基于TGF-β/Smad7信號通路探討針灸對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響※

曾于恒 林麗珠 吳小云 吳 鋒

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)為非特異炎性腸病，以腹瀉、便次增多、黏液膿血便等為主要癥狀。至目前為止，其病因和發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明[1]，由于其病變范圍能累及全部腸黏膜，并且病情易反復(fù)，遷延難愈，世界衛(wèi)生組織將其歸為難治性疾病，一般認(rèn)為胃腸道免疫功能的紊亂是其主要病因[2]。流行病學(xué)調(diào)查[3]顯示，近年來該病在亞洲的發(fā)病率明顯升高。相關(guān)研究[4]表明，TGF-β為多效性細(xì)胞因子，具有抗炎活性，TGF-β 的活化與受體結(jié)合，TGF-β/Smad7信號通過通路調(diào)節(jié)黏膜免疫作用，促使組織的修復(fù)，是治療UC 的關(guān)鍵靶標(biāo)。多項研究表明[5-8]，針灸能有效治療UC，本研究通過觀察針灸對UC 的療效，并從黏膜組織基于TGF-β/Smad信號通路方面研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組斯萊克景達(dá)公司（湖南省長沙市）提供的40 只SPF 級SD 雄性大鼠（體重：180～200 g），質(zhì)量合格證號為43004700032111，許可證號為SCXK（湘）2014-0002。動物飼養(yǎng)于該公司SPF 級實驗室，溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)分組法，將其分成空白組、模型組、電針組、隔藥灸組各10只。

1.2 實驗用藥及器材TNBS（SLBG2766W）；乙醇（國藥集團(tuán)，批號：20181017）；水合氯醛（國藥集團(tuán)，批號：20200917）；石蠟切片機(jī)（KW2148，浙江溫州）；顯微鏡（奧林巴斯BF52）；實時熒光定量PCR儀（艾華德replex3）；PCR 擴(kuò)增儀（Bio-RadT110 thermal cycler）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像（Bio-Rad）；臺式高速冷凍離心機(jī)（HERNLEZ33HK）；核酸水平電泳儀（武漢百達(dá)生物BGSUHWIDI）；核酸蛋白濃度測定儀(BioDropBD1106)；Elisa 試劑盒（重慶基因美生物，批號：E-EL-R0016c、E-AB-16094、E-AB-12904）。

1.3 模型制備禁食、不禁水2 d，空白組予0.6 mL生理鹽水灌腸；其余三組于腹腔用10%的水合氯醛350 mg/kg 進(jìn)行注射麻醉，用灌胃針取0.6 mLTNBS-50%乙醇造模劑注入肛門8 cm。灌腸后提尾倒置30 s，然后歸籠，取頭低腳高位。模型制備后第2 d，每組隨機(jī)選取3 只大鼠，觀察聳毛、拱背、進(jìn)食和活動等情況，并處死大鼠取結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸病理變化來判定UC模型是否成功[9]。

1.4 干預(yù)方法空白組、模型組：無干預(yù)。

電針組：造模成功后，將大鼠固定在特制的鼠架上，暴露腹部，根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[10]選取天樞（雙側(cè)）、氣海等穴位（見圖1），天樞穴予毫針刺入13 mm，氣海穴予毫針刺入7～10 mm，接G6805ll 型電針儀，選擇疏密波，20 min/次，每日1次，共14 d。

圖1 大鼠氣海、天樞（雙側(cè)）解剖示意圖

隔藥灸組：造模成功后，將肉桂5 g、附子5 g 研末，用黃酒混合調(diào)制，并用模具做成厚度約0.2 cm、直徑約1 cm的藥餅，中間用針刺小孔，將藥餅置于大鼠的氣海穴、天樞穴（雙側(cè)），并選擇清艾條內(nèi)的艾絨制成重約1 g、底面直徑約1 cm 的圓錐形艾炷，隔藥餅灸，每次灸1壯，每日1次，共14 d。

1.5 標(biāo)本采集干預(yù)結(jié)束后禁食、不禁水1d，麻醉后解剖腹主動脈，抽取動脈血5 mL，用于ELISA 檢測；取3 cm結(jié)腸，剖開，分成2段，1段用于RT-PCR檢測，1段用于HE染色。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況 整個實驗過程，每日觀察并記錄大鼠精神、活動、體重、飲食、毛色、排便等情況。

1.6.2 大鼠疾病活動性指數(shù)（DAI）評分 參考Mur?thy 標(biāo)準(zhǔn)[11]，DAI 評分為干預(yù)后大鼠體重下降率、大便性狀、便血程度這3個指標(biāo)評分的均值。見表1。

表1 大鼠疾病活動性指數(shù)（DAI）評分細(xì)則

1.6.3 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分 根據(jù)結(jié)腸黏膜的病理改變情況來進(jìn)行評分。0分為結(jié)腸黏膜無損傷；1 分為結(jié)腸黏膜輕度水腫，無潰瘍；2 分為結(jié)腸黏膜充血且粗糙呈顆粒狀；3 分為結(jié)腸黏膜形成<1 cm的潰瘍；4分為結(jié)腸黏膜潰瘍1～2 cm，但和外周臟器沒有粘連；5分為結(jié)腸黏膜潰瘍1～2 cm，腸管增厚，且腸管和周圍臟器粘連嚴(yán)重。

1.6.4 病理學(xué)觀察 取各組大鼠結(jié)腸組織，經(jīng)石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，結(jié)腸組織通過顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.6.5 血清TGF-β、Smad7及IL-10表達(dá)量 將結(jié)腸黏膜置于玻璃勻漿器中，加入PBS 勻漿，離心15 min，取上清液，采用ELISA法，檢測各孔的吸光度值，計算TGF-β、Smad7及IL-10表達(dá)量。

1.6.6 結(jié)腸組織 TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表達(dá)量 采用RT-PCR 法檢測。步驟：取100 mg 組織于EP 管，加1 mL Trizol 勻漿、200 μL 三氯甲烷，離心，取500 μL上清液于新EP管，加500 μL異丙醇，離心15 min，棄上清液，取RNA 沉淀干燥至透明狀，加150 μL RNase，溶解，混勻，取2 μL用于測定RNA濃度、質(zhì)量。當(dāng)OD260/OD280為1.8～2.0時質(zhì)量較好，取2 μL 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，用Realtime PCR 檢測。PCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 次循環(huán)，凝膠成像儀檢測質(zhì)量。用2-△△Ct方法計算TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表達(dá)量?；騎GF-β、Smad7、IL-10 的引物序列見表2。

表2 基因TGF-β、Smad7、IL-10引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計，各組數(shù)據(jù)均以()表示，多組間數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析進(jìn)行兩組間比較，檢驗水平α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模后，空白組大鼠神情自然，靈活度好，肛周毛發(fā)干凈，進(jìn)食、二便無異常；各模型組大鼠都有聳毛、拱背、進(jìn)食減少、活動減少甚至不動，伴有稀便。結(jié)合病理結(jié)果，判定UC造模成功[9]。

2.1 各組大鼠DAI及CMDI評分比較空白組大鼠

DAI、CMDI評分顯著低于其他三組（P<0.05）；電針組、隔藥灸組大鼠DAI、CMDI評分均明顯低于模型組（P<0.05）；電針組、隔藥灸大鼠DAI、CMDI評分比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠DAI、CMDI評分比較（分，）

表3 各組大鼠DAI、CMDI評分比較（分，）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 光鏡下各組大鼠的結(jié)腸病理組織比較空白組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤、充血；模型組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較模糊，排列紊亂，腺體結(jié)構(gòu)較不完整，大量炎性細(xì)胞浸潤，并壞死、出血；電針組和隔藥灸組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)相對較完整，明顯黏膜病變減少，腺體排列較連續(xù)，少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 光鏡下各組大鼠的結(jié)腸病理組織（10×10）

2.3 各組大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA表達(dá)量比較模型組、電針組、隔藥灸組大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA 及IL-10 mRNA 表達(dá)量顯著高于空白組（P<0.05），電針組、隔藥灸組低于模型組（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表達(dá)量比較（）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表達(dá)量比較（）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 各組大鼠血清TGF-β、Smad7 及IL-10 表達(dá)量比較與空白組比較，其他三組TGF-β、Smad7及IL-10表達(dá)量升高；與模型組比較，電針組、隔藥灸組TGFβ、Smad7及IL-10表達(dá)量降低（P<0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清TGF-β、Smad7及IL-10表達(dá)量比較（-x±s）

3 討論

根據(jù)UC的臨床癥狀及體征，當(dāng)歸屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“久痢”范疇?！蹲C治匯補》曰：“泄者，大便溏?。粸a者，大便直下，略分輕重，總屬脾虛?！笨梢?，UC的發(fā)病根本乃脾胃虛弱[12-14]。劉歡等[15]認(rèn)為，脾虛不運貫穿于UC疾病過程的各個階段。脾胃虛弱最終可發(fā)展為脾腎陽虛，導(dǎo)致清陽下陷，從而使魄門失主，瀉下無度，發(fā)為久瀉，正如《景岳全書》所言：“脾弱者，因虛易瀉，因瀉愈虛，蓋關(guān)門不固，則氣隨瀉去，氣去則陽衰，陽衰則寒從中生……陰寒性降，下必及腎……所以久瀉不愈，必自太陰傳于少陰而為腸澼。”因此，UC病位在腸，與脾、腎關(guān)系密切。綜合其病因病機(jī)，治療當(dāng)以溫補脾腎、通調(diào)腸腑為法。

天樞穴歸足陽明胃經(jīng)，乃陽明脈氣所發(fā)之處，且其為大腸經(jīng)募穴，參考腑病取募的取穴原則，天樞穴不僅可以有效通調(diào)大腸腑氣、降濁化濕，而且還有益胃健脾、強(qiáng)身止瀉作用?！端貑枴ち⒅即笳摗吩疲骸疤鞓兄?，天氣主之；天樞之下，地氣主之。”說明此穴為升清降濁的穴位，可通調(diào)臟腑。《千金要方》記載：“大便泄數(shù)，并灸天樞?！薄夺樉拇笕吩弧靶篂a不止，里急后重……天樞二穴。”《針灸大成》描述天樞主“主奔豚，泄瀉……水痢不止，食不下，水腫腹脹腸鳴……冬月感寒泄痢”。氣海穴乃全身氣血匯集之所，可生發(fā)元氣、培元益腎、扶正固本、益氣溫陽。《千金翼方》曰“水泄痢，灸氣海百壯，三報之”“脹滿瘕聚滯下疼冷，灸氣海百壯”。天樞、氣海相配，可以達(dá)到溫養(yǎng)脾腎、通調(diào)氣血、調(diào)和陰陽之功效。

電針是將電與針兩種刺激方式相結(jié)合而防治疾病的一種方法，可以代替人做較長時間的持續(xù)運針，且能較客觀地控制刺激量。相關(guān)研究[16]表明，電針具有促進(jìn)血液新陳代謝、止痛、調(diào)理人體生理機(jī)能等作用。對于本研究中電針治療時所選擇的疏密波，李曉璐等[17]認(rèn)為，該波形具有增強(qiáng)人體代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、有效改善組織營養(yǎng)、抗炎、消除水腫等功效。

隔藥灸是將中藥及艾灸的優(yōu)勢高度結(jié)合的一種灸法。本研究中，藥餅的組成為附子、肉桂，二者皆大熱，味辛，歸脾、腎經(jīng)，善補火助陽，相須為用則功效益彰，可健脾溫腎以治其本。其中，附子為補助元陽之要藥，具有溫補腎陽、回陽救逆之功，《本草正義》曰：“附子辛溫大熱，性善走，故為通行十二經(jīng)純陽之要藥。”肉桂具有溫經(jīng)通脈、引火歸元、補火助陽之功效，乃治療命門火衰之要藥，《本草求真》曰其“大補命門相火，益陽治陰”。該法集穴、藥、灸作用于一體，藥物、艾灸對穴位可起到雙重刺激作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組上皮結(jié)腸黏膜完整，未見充血、水腫，具有完整的腺體性結(jié)構(gòu)，未見炎性細(xì)胞浸潤；而模型組結(jié)腸黏膜破損，伴充血，腺體排列紊亂，炎性細(xì)胞大量浸潤；電針組、隔藥灸組上皮結(jié)腸黏膜組織損傷有不同程度修復(fù)，腺體量增多，排列較整齊，炎性細(xì)胞明顯下降，表明電針及隔藥灸均能促進(jìn)黏膜修復(fù)且有效抑制炎癥反應(yīng)。

相關(guān)研究[18]表明，在免疫缺陷、易感性基因及環(huán)境等多方面因素綜合作用下，人體分泌過多的炎癥介質(zhì)及炎癥因子，導(dǎo)致大腸黏膜受損，發(fā)為UC。發(fā)病時，黏膜通透性升高，腸內(nèi)物質(zhì)通過黏膜固有層進(jìn)入，激活免疫，導(dǎo)致炎癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[19]，UC 的發(fā)病機(jī)制可能與NOXs 信號通路途徑有關(guān)，大量ROS活化產(chǎn)生，使NLRP3 小體激活，導(dǎo)致促炎因子大量分泌，而電針及隔藥灸治療潰瘍性結(jié)腸炎可抑制NOXs-ROS-NLRP3 炎癥小體信號通路，從而發(fā)揮作用。TGF-β因子可有效抑制腸道炎癥性反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受性，恢復(fù)受損組織，因而可通過TGF-β 信號通路途徑來治療炎癥性腸病[20]。在此通路依賴Smad 途徑，p-Smad2 與p-Smad3 結(jié)合，并與Smad4 產(chǎn)生復(fù)合物質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞核，靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[21]。研究顯示[22]，UC腸內(nèi)炎癥性特征由p-Smad2/3表達(dá)量降低和TGF-β信號傳導(dǎo)性受損以及Smad7（磷酸化抑制劑）、IL-10 表達(dá)升高所引起[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸組織TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA及血清中TGF-β、Smad7 及IL-10 的表達(dá)量均明顯高于空白組，電針及隔藥灸干預(yù)后，這些指標(biāo)均較模型組明顯降低，表明電針及隔藥灸可能通過TGF-β/Smad7信號通路抑制炎癥性反應(yīng)，促進(jìn)黏膜修復(fù)。

綜上所述，電針及隔藥灸可促使UC 大鼠結(jié)腸黏膜損傷修復(fù)，抑制炎癥性反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與TGF-β/Smad7 信號通路有關(guān)。電針及隔藥灸如何調(diào)控TGF-β/Smad7 信號通路發(fā)揮其治療作用有待今后進(jìn)一步研究。