8種肉類線粒體DNA的提取及貂源性成分PCR檢測方法的建立

艾金霞，周 童，李明成，孫麗媛，高麗君，夏 薇，苑廣信，張麗華

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.吉林市雷博科技有限公司，吉林 吉林 132013)

飼養(yǎng)貂和狐貍通常是為了獲得其皮毛，貂肉、狐貍?cè)鈩t被處理掉，為謀取利益，不法商販低價(jià)收購貂肉、狐貍?cè)饷俺渑Ｑ蛉獬鍪?由于養(yǎng)殖戶在貂的飼料中添加了一些藥物及生長激素，貂肉牛羊肉未經(jīng)檢測流入市場存在安全隱患.因此，建立一種能快速、靈敏、特異鑒別肉類的方法已成為食品安全領(lǐng)域亟須解決的問題.

目前，質(zhì)檢部門對肉類鑒定方法主要是蛋白質(zhì)鑒定和核酸鑒定.蛋白質(zhì)鑒定肉類品種方法有很大局限，因蛋白質(zhì)經(jīng)蒸煮、煎炸、高壓等加工處理后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而無法精確鑒定，但核酸結(jié)構(gòu)不會改變，因此，以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)已成為食品中肉源性成分鑒別的主流技術(shù).

高等動物線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)編碼效率高，進(jìn)化速度快，尤其是其多態(tài)性特點(diǎn)，即使是親緣關(guān)系很近的動物，其mtDNA在分子大小及結(jié)構(gòu)上也有差異，這些特點(diǎn)使mtDNA 成為目前研究動物起源、進(jìn)化及群體遺傳分化的理想研究對象，而mtDNA 的制備是進(jìn)行這些研究的前提條件[1].我們科研團(tuán)隊(duì)完成了貂心組織線粒體DNA及細(xì)胞色素b的鑒定[2]，并開展了人參、龜甲、蘄蛇和烏梢蛇等中藥材基因特異性鑒定研究[3-6].運(yùn)用DNA分子技術(shù)在中藥材與易混品種鑒別方面已有很多研究，但用DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒別貂源性成分，國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道.本研究通過兩種不同方法提取肉類mtDNA，根據(jù)細(xì)胞色素b(cytochrome b，cytb) 基因獨(dú)特的優(yōu)勢，設(shè)計(jì)出貂特異性引物，并運(yùn)用PCR技術(shù)檢測貂源性成分.

1 材料、儀器與和試劑

1.1 材 料

試驗(yàn)用牛、羊、豬、雞、鴨、驢鮮肉(吉林地區(qū)不同超市和食品市場)；鹿肉(吉林市龍?zhí)渡铰箻I(yè)公司)；貂肉(長春市左家貂養(yǎng)殖基地).

1.2 儀 器

GL-20G-Ⅱ型變速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；UV2550 島津紫外分析儀(島津國際貿(mào)易上海有限公司)；JY-600C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司，美國)；UVWHITE-2020D 紫外凝膠成像自動分析儀(Cold Spring公司，美國).

1.3 試 劑

改良SDS堿變性法的動物組織DNA提取試劑盒為20次用量，其中，P1、P2、P3是細(xì)胞消化液，P4、P5是DNA沉淀劑，P6是DNA洗滌劑，P7是DNA溶解液.

DNase、SDS、RNase、Taq DNA Polymerase(華美生物工程公司)；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.

2 方 法

2.1 肉類mtDNA的提取

將采集的樣品進(jìn)行分類標(biāo)記，取0.05 g左右樣品放入無菌小燒杯中，加10 mL冷生理鹽水溶液浸泡20 min；去除鹽水，樣品置于EP管中，加入1.5 mL生理鹽水，用小型組織勻漿機(jī)點(diǎn)式研磨；4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，棄上清液.

2.1.1 改良SDS堿變性法[7]

取2.1處理的樣品0.02 g，置于離心管中；加入P1溶液500 μL、P2溶液30 μL、P3溶液15 μL混勻，置于56 ℃水浴振蕩1 h；取出后加入P4溶液500 μL，充分混勻10 min，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積P5溶液，-20 ℃放置1 h；取出后10 000 r/min離心10 min；棄去上清液，沉淀中加入P6溶液200 μL，混勻，11 000 r/min離心10 min(重復(fù)1次)；棄去上清液，沉淀，室溫晾干后分別加入P7溶液100 μL溶解DNA，混勻，作為供試品DNA溶液.

2.1.2 鹽析法[8]

取2.1處理的樣品0.05 g，置于乳缽中，加65 ℃預(yù)熱的DNA提取試劑250 μL，在液氮中研磨；磨碎溶液轉(zhuǎn)入離心管56 ℃水浴振蕩1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入離心管，加250 μL氯仿/異戊醇(24∶1)，室溫8 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入離心管，加預(yù)冷的異丙醇200 μL，-20 ℃冷凍1 h；4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清液，晾干，加70%乙醇200 μL清洗，室溫12 000 r/min離心3 min，棄去乙醇；干燥后加100 μL TE(pH 8.0)或雙蒸水，放入-20 ℃冰箱中備用.

2.2 mtDNA的純度和濃度的檢測

將兩種方法提取的DNA適當(dāng)稀釋，用紫外分光光度儀分別測定吸光度A260、A280，以A260/A280的比值鑒定mtDNA的純度，并計(jì)算DNA 的濃度.

2.3 mtDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

制備0.8%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含GelRed)，將兩種方法提取的mtDNA與適量6倍上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣，3 V/cm凝膠電泳2 h，應(yīng)用紫外燈觀察并拍照.

2.4 肉類中貂源成分PCR檢測

2.4.1 引物設(shè)計(jì)

在GenBank中下載紫貂(KF824765.1)基因序列，應(yīng)用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)貂特異性引物，利用NCBI中的在線軟件Primer-BLAST 對設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評估，上游引物：5′TCCACCCATACTACACCA TC3′；下游引物：5′ATCATGCCTCGTTGTTTTGA3′.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

2.4.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

將分別用兩種方法提取的樣品DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)管總體積為20 μL，含有Master Mix混合酶10 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL，余為雙蒸餾水.經(jīng)PCR擴(kuò)增后將引物加入反應(yīng)管中，PCR反應(yīng)按下列程序進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，退火溫度58 ℃ 30 s，72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

2.4.3 PCR產(chǎn)物檢測

制備1.5%瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物混勻后點(diǎn)樣，3 V/cm凝膠電泳90 min，應(yīng)用紫外分析儀檢測OD值，并拍照.

2.5 特異性試驗(yàn)

取已制備的貂、牛、羊、豬、驢、鹿、雞、鴨等8種動物肉的DNA各0.1 μg作為模板，加入體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照，并應(yīng)用電泳鑒定其特異性.

2.6 敏感性試驗(yàn)

將制備的貂肉的DNA模板依次2倍遞增稀釋，每個(gè)稀釋度各取1 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照，并應(yīng)用電泳鑒定其敏感性.

3 結(jié) 果

3.1 8種肉類mtDNA的提取

分別使用改良SDS堿變性法和鹽析法提取8種肉類mtDNA，結(jié)果顯示兩種方法均成功提取了8種肉類的mtDNA.改良SDS堿變性法提取的mtDNA條帶較鹽析法更清晰，泳道背景沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象.結(jié)果見圖1.

M.DL23kbp DNA Marker；1、9.紫貂；2、10.牛肉；3、11:羊肉；4、12.豬肉；5、13.驢肉；6、14.鹿肉；7、15.雞肉；8、16.鴨肉.圖1肉類樣品mtDNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1Agarose gel electrophoresis of mtDNA in meat samples

3.2 mtDNA濃度及純度

兩種方法提取的8種肉類DNA濃度和純度比較見表1.由表1可知，改良SDS堿變性法和鹽析法提取肉類mtDNA處于同一數(shù)量級，均能保證后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)要求.

表1 兩種方法提取肉類DNA濃度和純度Tab.1 Purity and concentration of DNA by two kinds of extraction methods

3.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

通過反復(fù)梯度PCR試驗(yàn)篩選出最佳退火溫度為58 ℃.用8種目標(biāo)肉類mtDNA作為模板，對設(shè)計(jì)的貂肉引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證.結(jié)果顯示，用該引物僅在貂肉mtDNA模板上能擴(kuò)增出大小約為289 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致；其余7種生肉則無擴(kuò)增目的片段，呈陰性，證明本研究成功建立了一種生肉中貂源性成分鑒定的PCR方法.結(jié)果見圖2.

M.DNA Marke；1.紫貂；2.牛肉；3.羊肉；4.豬肉；5.驢肉；6.鹿肉；7.雞肉；8.鴨肉；9.陰性對照.圖2貂引物對8種肉類PCR鑒定結(jié)果Fig.2Identification results of Martes zibelliza primers for PCR in 8 kinds of meat samples

3.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將制備的貂肉DNA模板依次做2倍遞增稀釋，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中含貂源性成分DNA6.25 ng/μL時(shí)，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增、電泳后可在紫外燈下觀察到明顯的目的條帶.結(jié)果見圖3.

M.DNA Marke;1.100 ng/μL;2.50 ng/μL;3.25 ng/μL;4.12.5 ng/μL;5.6.25 ng/μL;6.3.13 ng/μL;7.1.57 ng/μL;8.0.79 ng/μL;9.陰性對照.圖3貂源性成分PCR擴(kuò)增靈敏度結(jié)果Fig.3Agarose gel electrophoretogram of PCR for the sensibility experiment

4 討 論

我國在貂、狐貍、貉等動物養(yǎng)殖方面一直處于領(lǐng)先地位[9]，但國內(nèi)的毛皮動物養(yǎng)殖方式主要以個(gè)體農(nóng)戶養(yǎng)殖為主，因此，在流通上缺乏統(tǒng)一規(guī)范的監(jiān)督管理.貂是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的毛皮動物，我國貂主要產(chǎn)地為河北、山東、吉林、遼寧、黑龍江和內(nèi)蒙古等地[10].貂肉、狐貍?cè)獬杀镜土?，獲得渠道廣，肉量充足，一只成年的貂重6～10 kg[11]，據(jù)中國皮革協(xié)會發(fā)表貂、狐、貉取皮數(shù)量統(tǒng)計(jì)，2016年我國水貂皮數(shù)量2 616萬張[12]，而其動物尸體的流向卻很少得到關(guān)注.一些不法企業(yè)和個(gè)人收購貂肉冰存，做成羊肉卷和火腿腸等食品，而從肉眼上經(jīng)加工處理后的貂肉無法與牛羊肉辨別.

物種特異性PCR方法具有操作簡單、對樣品要求低、特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，該方法的使用極大改善和方便了食品中動物源成分的檢測[13].應(yīng)用分子遺傳學(xué)標(biāo)記技術(shù)鑒定貂源性成分的關(guān)鍵是提取出一定數(shù)量和質(zhì)量足夠好的DNA.現(xiàn)有的DNA 提取方法有SDS堿變性法、密度梯度離心法、鹽析法、酶消化法、柱層析法等[14].本研究采用兩種不同方法提取了8種生肉的mtDNA.為獲得高純度的mtDNA，我們對SDS堿變性法進(jìn)行了優(yōu)化，研制出動物組織mtDNA提取試劑盒.改良SDS堿變性法所用試劑均為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用試劑，應(yīng)用差速離心去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，再利用SDS能溶解核膜的特點(diǎn)破碎核膜，堿變性去除蛋白及DNase 酶消化黏附在線粒體外膜的核DNA，以排除核DNA的干擾.本研究提取的mtDNA濃度和純度測定的結(jié)果顯示，兩種方法提取的mtDNA均能達(dá)到PCR要求，但SDS堿變性法不需分離和純化線粒體，可以從完整的細(xì)胞直接分離mtDNA，方法簡單快速，對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和試劑要求不高，提取時(shí)間短，成本低廉，DNA結(jié)構(gòu)完整，因此，本方法提取動物組織mtDNA完全可以用于常規(guī)分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)研究工作.

以PCR為基礎(chǔ)的DNA檢測技術(shù)已逐步成為肉類種屬鑒定的核心方法，多以線粒體的細(xì)胞色素b、12S rRNA和D-Loop區(qū)域?yàn)榘行蛄?，檢測方法的靈敏度一般都能達(dá)到1%或更低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)實(shí)的檢測需求[15].CHEN Y等[16]報(bào)道了馬、驢、鹿、駱駝等成分的PCR檢測方法，多重PCR技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于食品中牛、羊、豬、雞、鴨等常見肉多種成分的檢測.HE W L等[17]應(yīng)用引物多重PCR法快速鑒別食品中豬肉、牛肉、羊肉和雞肉成分；MATSUNAGA J等[18]應(yīng)用一次PCR同時(shí)對食品中的6種肉的mtDNA進(jìn)行檢測，根據(jù)DNA片段的長度來鑒別混合肉制品的動物源性；GIRISH PS等[19]應(yīng)用PCR-RFLP法在12S rRNA區(qū)段設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出片段鑒別肉制品中種屬特異性成分.近年來，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的發(fā)展提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使肉類含量的定量溯源成為可能[20].雖然DNA檢測技術(shù)目前在國內(nèi)外有一些報(bào)道，但仍處于理論研究階段，特別是動物食品DNA檢測試劑的開發(fā)和應(yīng)用方面國內(nèi)外未見深入研究，線粒體DNA在肉類產(chǎn)品中貂源性成分鑒定方面的文獻(xiàn)中還未見報(bào)道.

設(shè)計(jì)出貂mtDNA細(xì)胞色素b特異性引物是鑒別貂源性成分的另一個(gè)關(guān)鍵.查找近年來用于鑒別貂產(chǎn)品文獻(xiàn)，從GenBank中下載紫貂和水貂位于mtDNA的基因序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物.經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)摸索，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，確定退火溫度為58 ℃，在該溫度下289 bp的目的條帶最清晰，其他7種肉類均無PCR反應(yīng)，此結(jié)果顯示引物特異性很強(qiáng).PCR反應(yīng)敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中含貂mtDNA僅為6.25 ng/μL時(shí)，經(jīng)過擴(kuò)增、電泳后仍可觀察到明顯的目的條帶.

本研究是國內(nèi)首次設(shè)計(jì)的貂源性引物，通過比較不同肉類mtDNA序列差異進(jìn)行貂源性成分鑒定，與目前常見的多重PCR、PCR-RFLP、熒光定量PCR等方法比較，本方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)體系更簡單可靠，試劑儀器普通實(shí)驗(yàn)室均具備，成本低廉，檢測時(shí)間短，可滿足普通實(shí)驗(yàn)室肉類品種鑒定，并可在質(zhì)檢部門應(yīng)用推廣.

本研究的后續(xù)工作將針對加工肉類制品如肉串、火腿腸、丸類等的組分進(jìn)行分析，并探討熒光定量PCR技術(shù)對純?nèi)?、肉卷等肉類的檢測.