膠體金免疫層析法檢測(cè)帶魚(yú)中氯霉素殘留的前處理方法研究

◎ 李 倩，陳 煜，閻安婷

(山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所，山西 太原 030001)

帶魚(yú)，自古以來(lái)就是我國(guó)重要的海洋作物之一，在《本草從新》《中華本草》等著作中均有記載。帶魚(yú)蛋白含量高，味道鮮美，具有補(bǔ)中益氣、溫胃養(yǎng)肝、補(bǔ)氣血的作用[1]。

氯霉素為廣譜抗生素，價(jià)格低，療效顯著，多用于動(dòng)物的抗菌治療預(yù)防。氯霉素理化性質(zhì)穩(wěn)定，不容易分解，會(huì)在人體中蓄積，從而引發(fā)血液系統(tǒng)疾病及抗藥性。我國(guó)已明確規(guī)定禁止氯霉素在食品動(dòng)物中使用[2]。氯霉素殘留現(xiàn)有檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[3-4]，但這些方法前處理復(fù)雜，需要大型檢測(cè)設(shè)備。膠體金免疫層析法操作簡(jiǎn)便快速，又具有很好的特異性，無(wú)需昂貴的檢測(cè)儀器[5-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化前處理方法，建立以膠體金免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的帶魚(yú)中氯霉素殘留快速檢測(cè)方法，該方法的建立為其他動(dòng)物藥物殘留的快速檢測(cè)提供有利的技術(shù)支持，對(duì)于今后開(kāi)展基層食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)工作也具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

帶魚(yú)購(gòu)自太原美特好超市；固相萃取小柱（Cleanert Silica，200 mg/6 mL，LOT：0170198）；氯 霉 素 快速檢測(cè)卡（蘇州快捷康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：kjk20171125c）。氯霉素，購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer，CAS登錄號(hào)為56-75-7；乙酸乙酯、水、正己烷、丙酮、乙腈、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）及氯化鈉均為分析純。

Eppendorf移液器、中佳HC-3018高速離心機(jī)、IKA V2S025渦旋混合器及梅特勒-托利多ML204T電子天平。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取氯霉素用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.01 μg·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用新配。

1.2.2 前處理方法研究

取粉碎均勻的帶魚(yú)樣品6 g于50 mL具塞離心管中，分別采用以下4種方法進(jìn)行樣品前處理。

方法一：加入8 mL乙酸乙酯，渦旋提取5 min，以8 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層 40 ℃氮?dú)獯蹈?，置?5 mL具塞離心管中，精密加入600 μL復(fù)溶液，渦旋混合1 min，作為待測(cè)液。

方法二：依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯，提取同方法一。精密加入600 μL復(fù)溶液和600 μL正己烷，渦旋混合1 min，取下層溶液作為待測(cè)液。

方法三：依次加入15 mL乙腈勻漿提取，加入 10 mL乙腈飽和的正己烷去脂，離心分層，取乙腈層用氮?dú)獯蹈?，加? mL丙酮-正己烷（1∶9）溶解殘?jiān)齼艋?。過(guò)LC-Si硅膠小柱，用5 mL丙酮-正己烷（6∶4）洗脫，收集洗脫液用氮?dú)獯蹈?，?fù)溶為待測(cè)液。

方法四：依次加入4 mL水和8 mL乙酸乙酯，渦旋提取5 min，以4 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移乙酸乙酯層于50 mL具塞離心管中，加入正己烷25 mL，氯化鈉1 g渦旋混勻，4 000 r·min-1離心1 min，上清液待凈化。凈化同方法三，復(fù)溶為待測(cè)液。

1.2.3 復(fù)溶液的確定

通過(guò)查閱資料并結(jié)合試劑盒復(fù)溶液的pH值范圍選擇最常用的4種磷酸鹽緩沖液。

稱(chēng)取0.12 g磷酸二氫鈉置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液A；稱(chēng)取7.16 g磷酸氫二鈉置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液B。①取溶液A 3.3 mL、溶液B 6.7 mL、 氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液1（pH 7.1）。②取溶液A 2.8 mL、溶液 B 7.2 mL、氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液2（pH 7.2）。③取溶液A 2.3 mL、溶液B 7.7 mL、氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液3（pH 7.3）。④取溶液A 1.9 mL、溶液B 8.1 mL、氯化鈉0.85 g，用水溶解并稀釋至100 mL，得磷酸鹽緩沖液4（pH 7.4）。

1.2.4 測(cè)定步驟

吸取150 μL樣品待測(cè)液滴加到檢測(cè)卡上的加樣孔中，室溫溫育5 min，通過(guò)比較控制線(xiàn)、檢測(cè)線(xiàn)的顏色深淺對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.5 測(cè)定條件研究

本方法的結(jié)果測(cè)定以競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析為基礎(chǔ)，具有特異、靈敏、快速以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)反應(yīng)條件及環(huán)境往往具有嚴(yán)格的要求，本方法除了對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，還對(duì)測(cè)定時(shí)間和溫育溫度進(jìn)行研究。測(cè)定時(shí)間分別考察了復(fù)溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min測(cè)定效果，溫育溫度對(duì)比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反應(yīng)效果。

1.2.6 交叉反應(yīng)

分別取甲砜霉素、氟甲砜霉素，制成水平為 10 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察試劑盒與上述化合物的交叉反應(yīng)。

1.2.7 與參比方法一致性分析

稱(chēng)取空白樣品帶魚(yú)為基質(zhì)，分別添加3個(gè)濃度水平0 μg·kg-1、0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1的盲樣各40份，其中20份按自擬方法的前處理和分析步驟進(jìn)行測(cè)定，另外20份參考《動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測(cè)定》（GB/T 22338—2008）測(cè)定，對(duì)比兩種方法測(cè)定結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法及復(fù)溶液確定

2.1.1 對(duì)前處理方法進(jìn)行考察

對(duì)比4種前處理方法發(fā)現(xiàn)，方法一樣品加乙酸乙酯后，樣品凝結(jié)成塊，提取過(guò)程中不能均勻分散，提取不完全，待測(cè)溶液渾濁不清，無(wú)法點(diǎn)樣；方法二加入水后樣品結(jié)塊問(wèn)題解決，但加入的正己烷量太少，無(wú)法完全去脂，待測(cè)溶液依舊渾濁不清；方法三雖然待測(cè)溶液可以達(dá)到滿(mǎn)意的結(jié)果，也消除了脂肪對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，但乙腈氮吹耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法滿(mǎn)足快檢要求，需進(jìn)一步優(yōu)化，縮短檢測(cè)時(shí)間；方法四試驗(yàn)樣品中添加25 mL正己烷后，待測(cè)溶液清晰，點(diǎn)樣結(jié)果滿(mǎn)意，同時(shí)乙酸乙酯氮吹時(shí)間縮短，單樣時(shí)間控制在 60 min之內(nèi)。因此，采取方法四為本試驗(yàn)最終方法。

2.1.2 對(duì)復(fù)溶液進(jìn)行考察

如圖1所示，磷酸鹽緩沖液2（pH 7.2）廠(chǎng)家試劑盒能達(dá)到較好的點(diǎn)板效果。

圖1 測(cè)試結(jié)果圖

2.2 測(cè)定條件研究結(jié)果

結(jié)果表明，在1.2.5各不同時(shí)間段下，待測(cè)液點(diǎn)板后T線(xiàn)顏色沒(méi)有明顯差異，時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響，但是為了避免不確定因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，建議復(fù)溶后立即測(cè)定。在1.2.5各溫度下，待測(cè)液點(diǎn)板后無(wú)明顯差異，溫度對(duì)本試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果幾乎沒(méi)有影響，但是為了避免極端監(jiān)測(cè)環(huán)境對(duì)于檢測(cè)相關(guān)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，建議日常檢驗(yàn)中在室內(nèi)或相對(duì)溫和的檢驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行，故本方法中孵育溫度建議為室溫。

2.3 交叉反應(yīng)結(jié)果

交叉反應(yīng)顯示，甲砜霉素、氟甲砜霉素與試劑盒點(diǎn)板后結(jié)果均顯示陰性，表明均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.4 與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比結(jié)果

表1、表2的檢測(cè)結(jié)果表明，膠體金方法中0 μg·kg-1均未檢出為陰性，0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出為陽(yáng)性。液相色譜-質(zhì)譜法中0 μg·kg-1檢出濃度為 0 μg·kg-1視為陰性，0.1 μg·kg-1、0.2 μg·kg-1均可以檢出符合回收率要求（80%～110%）的濃度視為陽(yáng)性，因此膠體金試劑盒方法的結(jié)果均與參比方法一致，符合方法一致性要求。

表1 膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果表

表2 液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化前處理方法、確定復(fù)溶液等操作建立的膠體金免疫層析技術(shù)相比于傳統(tǒng)氣相色譜、液相色譜、酶聯(lián)免疫方法，具有操作簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、無(wú)需大型儀器成本低的特點(diǎn)，非常適合作為初篩手段用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。