長鏈非編碼RNA在缺血性腦卒中的研究進展

馮冬軍，馬雪飛，于文霞，譚 明，關利新，翟鳳國

(牡丹江醫(yī)學院藥理教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦卒中是我國中老年人致殘和致死的主要疾病。缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、早期診斷缺乏、死亡及致殘率高[1]等特點。我國每五位死亡患者中至少有一位是死于腦卒中，其中缺血性腦卒中又占腦卒中的絕大多數(shù)，缺血性腦卒中已經(jīng)成為威脅我國公眾健康的主要病因。目前治療缺血性腦卒中的一線藥物是靜脈組織型纖溶酶原激活劑，主要用來溶栓治療，但是由于治療窗窄，適用范圍有限。目前，缺血性腦卒中的分子機制仍待進一步明確。Dharap等[2]研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血可誘發(fā)大鼠腦內(nèi)一系列LncRNA表達譜的改變。近年來，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)MEG8 、lncRNA Rian、 Malat1、MIAT等LncRNA在腦缺血損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。LncRNA作為缺血性腦卒中研究的新機制和新靶點，正成為缺血性腦卒中研究的重要方向，因此，本文將對lncRNA在缺血性腦卒中方面的研究進展進行綜述。

1 缺血性腦卒中

1.1 病因及主要機制缺血性腦卒中是由于腦動脈區(qū)供血受阻而導致的局部腦組織及其功能的損害。其中自由基的生成、鈣超載、興奮性氨基酸、一氧化氮、炎癥反應以及細胞凋亡是缺血性腦卒中發(fā)生的主要病理生理機制。缺血性腦卒中發(fā)生過程中無氧代謝占優(yōu)勢，導致細胞內(nèi)pH值降低，為防止氫離子的累積，鈉離子與氫離子交換器會泵送出額外的氫離子，以致大量的鈉離子流入，引起細胞的電生理紊亂。此外，局部缺血還會減少腺嘌呤核苷三磷酸的儲備，從而導致腺嘌呤核苷三磷酸酶失活，使腦細胞內(nèi)活性鈣的釋放減少，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還會抑制鈣離子的再攝取，導致細胞內(nèi)鈣超載，造成腦細胞的生理功能紊亂[3]。腦組織缺血再灌注后，氧氣和其他血液成分的運輸也會加劇由局部缺血造成的傷害，并引起腦組織超微結構的破壞。此外，線粒體功能受損，細胞凋亡和自噬途徑失調(diào)也參與了腦缺血損傷的病理生理過程。

2 lncRNA

2.1 lncRNA的定義及發(fā)現(xiàn)在人類基因組30多億個堿基對基因序列中，約有98.5%的非編碼序列，其中絕大多數(shù)非編碼序列被轉錄成長度大于200個堿基的非編碼RNA被稱為lncRNA[4]，lncRNA是一類主要的真核轉錄本，它們構成了哺乳動物基因組的重要組成部分。lncRNA會被加帽，剪接和聚腺苷酸化，它們通常不充當?shù)鞍踪|(zhì)合成的模板，但某些lncRNA也可以被核糖體吸引，并翻譯產(chǎn)生小肽[5]。lncRNA起初被認為是RNA聚合酶II轉錄的副產(chǎn)物，不具有生物學功能。早在1991年就證實了lncRNA Xist參與X染色體失活的調(diào)控[6]，但當時并未引起科研人員的重視，直到2007年人才們開始聚焦于lncRNA的研究。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA在眾多生命活動過程中發(fā)揮著至關重要的作用。

2.2 LncRNA的分類lncRNA有多種不同的分類方式，從基因的角度可以將lncRNA大致分為6類：(1)正義LncRNA，與編碼基因的一個或多個外顯子重疊；(2)反義轉錄產(chǎn)物，與相反鏈上的轉錄產(chǎn)物部分或完全互補；(3)內(nèi)含子LncRNA，由基因的內(nèi)含子產(chǎn)生；(4)雙向轉錄產(chǎn)物，與蛋白質(zhì)編碼基因共享相同的啟動子，但轉錄方向相反；(5)基因間LncRNAs(LincRNA)，由位于蛋白質(zhì)編碼基因之間的序列獨立轉錄；(6)增強子RNA(eRNA)，由蛋白質(zhì)編碼基因的增強子區(qū)域產(chǎn)生[7]。

2.3 lncRNA的主要作用模式LncRNA 的作用模式主要分為四大類：(1)信號模式，LncRNA的第一種作用是調(diào)控下游基因轉錄。不同的刺激條件和信號通路下，LncRNA將會被特異性地轉錄，并作為信號傳導分子參與特殊信號通路的傳導。一些LncRNA分子被轉錄后，擁有調(diào)控下游基因轉錄的作用。從生物體的角度而言，利用RNA進行轉錄調(diào)控是具有明顯優(yōu)勢的，由于不涉及蛋白質(zhì)的翻譯，因此具有更好的反應速度，對于機體的某些急性反應可以做出更好更迅速的反應；(2)誘餌模式，LncRNA的第二種作用是分子阻斷劑。這一類LncRNA被轉錄后，它會直接和轉移因子或轉錄調(diào)節(jié)子結合，從而阻斷了相應分子的作用和信號通路。由于LncRNA的結合，這類轉錄因子的功能會被阻斷，從而調(diào)控下游的基因轉錄；(3)引導模式，第三種作用模式是LncRNA會與通常是轉錄因子的蛋白結合，然后將蛋白復合物定位到特定的DNA序列上；(4)支架模式，LncRNA 還可以起到一個“中心平臺”的作用，即多個相關的轉錄因子都可以結合在這個LncRNA分子上。在機體或細胞中，當多條信號通路同時被激活時，這些下游的效應分子可以結合到同一條LncRNA分子上，實現(xiàn)不同信號通路之間的信息交匯和整合，有利于機體或細胞迅速地對外界信號和刺激產(chǎn)生反饋和調(diào)節(jié)[8]。

2.4 lncRNA的功能lncRNA在生物體內(nèi)能夠廣泛通過染色質(zhì)重塑、DNA甲基化、組蛋白修飾、細胞周期調(diào)控等方式參與胚胎發(fā)育、細胞增殖分化以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展，在轉錄、轉錄后以及表觀遺傳水平上調(diào)控靶基因的表達[9]。lncRNA不僅承擔著遺傳信息中間載體的輔助性角色，更重要的是在發(fā)育和基因表達中發(fā)揮著復雜精確的調(diào)控功能。lncRNA發(fā)揮功能主要依靠其二級結構與蛋白質(zhì)結合，引起染色質(zhì)重構、影響轉錄因子的功能等。此外，lncRNA還可以在其線性水平與微小核糖核酸(microRNA，miRNA，miR)結合，間接影響mRNA表達，同時也可以直接與mRNA結合，影響mRNA翻譯、剪切、降解過程[10]。lncRNA與中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關，其失調(diào)可導致神經(jīng)病理學狀態(tài)的發(fā)生，例如神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)免疫疾病、原發(fā)性腦腫瘤和精神疾病[11]。因其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程的密切相關性，使得lncRNA可能成為在缺血性腦卒中進展中發(fā)揮重要作用的調(diào)控靶點。目前對lncRNA在缺血性腦卒中方面的研究還在不斷探索中。

3 lncRNA與缺血性腦卒中

3.1 lncRNA在缺血性腦卒中進程中的作用lncRNA在多個層面上以復雜的作用機制廣泛參與細胞分化、增殖、凋亡、自噬以及免疫反應和血管生成等過程[12]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、維持穩(wěn)態(tài)以及神經(jīng)細胞功能行使等過程中l(wèi)ncRNA發(fā)揮著重要的作用，同時缺血性腦卒中會使lncRNA表達譜發(fā)生明顯改變，在缺血性腦卒中患者和動物模型中，數(shù)千個異常表達的lncRNA被發(fā)現(xiàn)[13]。lncRNA通過鈣超載、氧化應激、炎性反應、神經(jīng)血管損傷、神經(jīng)元壞死、神經(jīng)保護與修復、突觸功能破壞等途徑影響缺血性腦卒中的進展及轉歸，參與缺血級聯(lián)的分子過程[14]。

3.2 與缺血性腦卒中相關lncRNA的分類缺血性腦卒中相關的lncRNA既有對缺血性腦卒中有保護作用的lncRNA，也存在對缺血性腦卒中有損害作用的lncRNA，可按照lncRNA在缺血性腦卒中中的保護和損害作用主要分為兩類。

3.2.1 具有保護作用的lncRNA (1)MEG8：MEG8參與了缺血性腦卒進程，通過對MEG8，miR-130a-5p和血管內(nèi)皮生長因子A(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGFA)的表達進行分析發(fā)現(xiàn)，在糖氧剝奪(Oxygen and glucose deprivation，OGD)處理的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞 (Brain Microvessel Endothelial Cells，BMEC)中，MEG8被上調(diào)、miR-130a-5p被下調(diào)，而VEGFA的表達上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a-5p是MEG8的靶標，而VEGFA是miR-130a-5p的靶標，MEG8的下調(diào)通過負性調(diào)節(jié)經(jīng)糖氧剝奪/復氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)處理的大鼠BMEC中的miR-130a-5p的表達，從而抑制細胞活力、遷移、血管生成以及VEGFA的表達?？傊?，MEG8降低了大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的腦缺血神經(jīng)學評分和miR-130a-5p表達，并增加了VEGFA表達，即MEG8通過miR-130a-5p / VEGFA信號傳導通路調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后的血管生成并減輕腦缺血損傷。(2)lncRNA 1810034E14Rik：生物信息學提示lncRNA 1810034E14Rik可能參與先天免疫反應和凋亡過程。通過lncRNA芯片分析篩選發(fā)現(xiàn)，與炎癥反應相關的1810034E14Rik在OGD和內(nèi)毒素誘導的小膠質(zhì)細胞中均下調(diào)。通過MCAO小鼠模型，發(fā)現(xiàn)過表達1810034E14Rik可顯著改善腦缺血急性期癥狀，減少梗死體積和腦水腫。梗死皮質(zhì)中的促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1b(IL-1b)受到1810034E14Rik負性調(diào)控，而抗炎因子白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-4(IL-4)在1810034E14Rik過表達后顯著升高。此外，過表達1810034E14Rik可降低梗死皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的激活。同時上調(diào)1810034E14Rik也可抑制體外OGD誘導的小膠質(zhì)細胞的激活并減輕炎癥。這說明1810034E14Rik對缺血性腦卒中有改善作用，而其抗炎作用主要是通過影響小膠質(zhì)細胞激活來實現(xiàn)的。小膠質(zhì)細胞在MCAO后的梗死皮層被激活并分泌白細胞介素-1(IL-1), TNF-α和白細胞介素-6(IL-6)。然而，過表達1810034E14Rik逆轉了這些細胞因子的增加。OGD刺激下原代小膠質(zhì)細胞的結果與動物實驗一致，OGD后小膠質(zhì)細胞磷酸化抑制性卡巴蛋白(p-IκB)水平降低、磷酸化p65(p-p65)水平升高，同時p65在細胞核內(nèi)的轉移也被誘導，而過表達1810034E14Rik可逆轉缺血引起的上述變化，由此可見1810034E14Rik是中風治療的潛在靶標[15]。(3)lncRNA Rian：lncRNA Rian在腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷中發(fā)揮著重要的作用。在利用小鼠成神經(jīng)細胞瘤(N2a)細胞OGD模型模擬腦I/R損傷，通過臺盼藍染色、活性氧的產(chǎn)生和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性檢測細胞凋亡，并通過小鼠的MCAO模型來評估lncRNA Rian在小鼠腦I/R損傷過程中如何發(fā)揮作用的實驗中，用real-time PCR和western blotting檢測lncRNA Rian、miR-144-3p、GATA結合蛋白3 (GATA3)、caspase-3、Bcl-2相關X蛋白(Bax)和B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達。結果表明，在腦I/R損傷的體內(nèi)外實驗中，lncRNA Rian和GATA3均下調(diào)，miR-144-3p上調(diào)。過表達lncRNA Rian可抑制OGD誘導的細胞凋亡。此外，lncRNA Rian過表達能明顯減小梗死面積，提高腦缺血小鼠的神經(jīng)功能學評分。lncRNA Rian過表達可在體內(nèi)外消除miR-144-3p介導的體內(nèi)和體外的腦I/R損傷。此外，GATA3是miR-144-3p的靶點，GATA3可受miR-144-3p和lncRNA Rian的協(xié)同調(diào)控。總之，lncRNA Rian/miR-144-3p/GATA3軸在腦I/R損傷中是一個重要的信號通路[16]。lncRNA Rian可能成為缺血性腦卒中患者治療的潛在靶點。

3.2.2 有損害作用的lncRNA (1)MALAT1：肺腺癌轉錄本1(MALAT1)編碼基因位于人染色體11q13，此lncRNA存在于細胞核核小體核斑區(qū)，長約8.1kb。在人類各組織中MALAT1具有較高表達豐度。MALAT1在缺血性腦卒中進程中發(fā)揮著重要的作用。在MCAO模型中會引起同側皮質(zhì)中MALAT1和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達的顯著增加，敲減MALAT1可以減輕腦缺血后的炎癥損傷，而過表達MALAT1則會加劇缺血性的腦炎癥。HMGB1是miR-181c-5p的直接下游靶標，miR-181c-5p可以靶向HMGB1的3'-UTR，同時又可以充當MALAT1的競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)促進缺血后的炎癥發(fā)生。敲減MALAT1可顯著降低HMGB1水平，此過程可以通過轉染miR-181c-5p抑制劑來消除。綜上，MALAT1 / miR-181c-5p / HMGB1信號通路可能是中風抗炎作用的關鍵途徑，它們可能為缺血性腦卒中的靶向治療提供新的途徑[17]。(2)MIAT：lncRNA心肌梗死相關轉錄本(MIAT)最初被證實與心肌梗死有關，后來發(fā)現(xiàn)MIAT還與神經(jīng)元發(fā)育以及神經(jīng)血管功能障礙相關[18]。MIAT可以作為海綿吸附miR-204-5p的內(nèi)源性ceRNA。MIAT在MCAO模型大鼠的腦組織中過表達，而MIAT的抑制可減輕MCAO大鼠的腦組織損傷。抑制MIAT可以促進MCAO大鼠腦組織中的血管生成及miR-204-5p表達并抑制HMGB1表達，減少OGD處理的腦微血管內(nèi)皮細胞(Cerebral microvascular endothelial cells ,CMEC)的損傷，誘導CMEC的血管生成，增加存活神經(jīng)元的數(shù)量。綜上，MIAT可通過競爭性結合miR-204-5p來促進HMGB1表達，從而引起腦缺血后CMEC的損傷[19]。故MIAT將可能成為缺血性腦卒中治療的重要靶點。(3)Gm11974：lncRNA Gm11974主要位于細胞質(zhì)中。在使用轉錄組測序技術分析識別了大量I/R損傷中的差異lncRNA后，發(fā)現(xiàn)了Gm11974在腦I/R損傷中高表達。采用N2a細胞OGD模型模擬腦I/R損傷，發(fā)現(xiàn)敲除Gm11974可減輕OGD誘導的細胞凋亡，顯著降低細胞死亡率。Gm11974能夠負向調(diào)控miR-766-3p的表達，正向調(diào)控孕酮受體 (Nuclear receptor subfamily3, group C, member2, NR3C2)的蛋白水平引起缺血腦細胞的凋亡，Gm11974/miR-766-3p/NR3C2軸在腦I/R損傷中起重要作用。敲除Gm11974可以降低NR3C2的蛋白表達水平，在對Gm11974/miR-766-3p/ NR3C2軸在腦I/R損傷中的作用的進一步驗證中發(fā)現(xiàn)，過表達miR-766-3p可以阻斷Gm11974的作用。以上揭示了Gm11974可以通過海綿吸吸附作用于miR-766-3p來抑制miR-766-3p拮抗NR3C2功能的作用，進一步促進腦I/R損傷的細胞凋亡[20]。故lncRNA Gm11974可能成為缺血性腦卒中治療干預的潛在靶點。

4 討論

lncRNA有著重要的生物學功能并與缺血性腦卒中的進展緊密相關，有潛力成為缺血性卒中的生物標志物和治療靶點。當前l(fā)ncRNA在缺血性腦卒中方面的研究熱點主要是通過研究lncRNA與miRNA以及靶蛋白之間的關系來確定lncRNA及相關通路在缺血性腦卒中中所發(fā)揮的作用。但目前相關研究也存在一定的局限性，由于lncRNA與miRNA之間并不一定互為唯一靶標，類似地，miRNA與靶蛋白之間也并不一定互為唯一靶標，而目前相關研究大多僅限于單一通路的研究，因此是否存在其他靶標和信號通路的串擾也值得相關研究進一步的考察和完善。目前，lncRNA在缺血性腦卒中方面的研究還不夠充分，有很多新的lncRNA仍然需要我們進一步去發(fā)掘。在lncRNA水平揭示缺血性卒中的分子機制將為缺血性腦卒中的診療提供科學的依據(jù)，并有助于相關藥物早日應用以造?；颊?。