氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜-內(nèi)標(biāo)法測定果蔬中79種農(nóng)藥殘留

江改青，黃孟麗，李雪銀，邢夢珂，張博文，孫小杰

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京 211100）

農(nóng)藥作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在病蟲害防控、保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但因其不合理使用，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，也帶來了環(huán)境污染、生態(tài)破壞、食品安全等眾多問題，影響人體健康[1-3]。隨著生活水平的不斷提高，水果蔬菜需求量的日益增長，果蔬中的農(nóng)藥殘留問題越來越受到關(guān)注[3]。近年來，多品種農(nóng)藥的混合使用和濫用致使農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留現(xiàn)象比較突出[4]。因此，如何解決農(nóng)藥殘留問題、探究農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)已成為當(dāng)務(wù)之急。

目前，農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Quadrupole-Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-Q-TOF/MS）、 液 相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法和酶抑制法等[5-8]。當(dāng)前，GC-Q-TOF/MS作為典型的高分辨技術(shù)，因其具有質(zhì)量精確度更高、通量更大、全質(zhì)量數(shù)采集和數(shù)據(jù)庫匹配檢索等優(yōu)勢，定性確證能力更強(qiáng)，在多農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣[8-11]。采集方式是全掃描，可提供精確質(zhì)量數(shù)，質(zhì)譜裂解信息豐富，具有優(yōu)異的定性能力。目前，該方法已被應(yīng)用于食品成分分析[12]、生物代謝[13]、環(huán)境監(jiān)測[14]等領(lǐng)域。

對于農(nóng)藥殘留檢測，常用的樣品前處理方法有液液萃取法[15]、固相萃取法[16-17]、凝膠滲透色譜法[18]和QuEChERS法[19]等。其中QuEChERS方法是一種簡單、快速的農(nóng)藥殘留預(yù)處理技術(shù)，其原理是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)，從而達(dá)到除雜凈化的目的，相對于其他前處理方法，具有快速、方便、便宜、高效和耐用等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過建立多農(nóng)殘個(gè)人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫（Personal Compound Database and Spectrum Library，PCDL），結(jié)合GB 23220.113—2018中的QuEChERS前處理方法，采用GC-Q-TOF/MS全掃描對372批水果蔬菜樣品進(jìn)行多農(nóng)殘高通量篩查，并對檢出項(xiàng)目進(jìn)行定量分析，從而為水果蔬菜中多農(nóng)藥殘留的檢測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙酸乙酯，乙腈（色譜純，美國AOE公司），QuEChERS材料包（美國安捷倫公司）。

429 種農(nóng)藥殘留混標(biāo)（質(zhì)量濃度均為 10 μg·mL-1，購自First Standard公司），置于-18 ℃保存；79種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度均為1 000 μg·mL-1，購自First Standard公司）。用乙酸乙酯將各農(nóng)藥配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃保存；內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯 B（質(zhì)量濃度均為 100 μg·mL-1，購自 First Standard公司），用乙酸乙酯環(huán)氧七氯B配制成濃度為5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀7890B-7250（GC-Q-TOF/MS，美國Agilent公司）；氮吹儀（Organomation公司）；離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（德國賽多利斯公司）；渦旋混合器（美國Thermo公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 QuEChERS前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g均質(zhì)試樣于50 mL塑料離心管中，加入10.0 mL乙腈，振蕩3 min，4.0 g無水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，1.0 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min后4 200 r·min-1離心5 min。吸取6.0 mL上清液加到內(nèi)含900.0 mg硫酸鎂及150 mg N-丙基乙二胺（PSA）的15.0 mL塑料離心管中；對于顏色較深的試樣，15 mL塑料離心管中加入900.0 mg硫酸鎂、150.0 mg PSA及15.0 mg石墨化碳黑（GCB），渦旋混勻1 min。4 200 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確吸取2.0 mL上清液于10.0 mL試管中，40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两?。加?0.0 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，加入1.0 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過微孔濾膜，用于GC-Q-TOF/MS測定。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

樣品前處理實(shí)驗(yàn)時(shí)將79種農(nóng)藥殘留混標(biāo)稀釋成0 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1和 2.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列濃度。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱選用HP-5MS UI毛細(xì)管柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；升溫程序：60 ℃保持1 min，以40 ℃·min-1升溫至120 ℃，以5 ℃·min-1升溫至310 ℃；載氣：氦氣，流速1 mL·min-1；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件。氣相色譜與質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；離子源穩(wěn)定：230 ℃；電子轟擊源（EI）：70 eV；數(shù)據(jù)采集方式：TOF SCAN全掃描；質(zhì)量掃描范圍：m/z50～600；溶劑延遲：3.75 min。

1.3.4 數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集通過Agilent MassHunter Workstation軟件完成，數(shù)據(jù)分析通過Qualitative Anglysis 10.1和MassHunter PCDL Manager（B.08.00）建立化合物數(shù)據(jù)庫和譜圖庫、Unknowns Analysis進(jìn)行定性分析、Quantitative Anglysis進(jìn)行定量分析。采用建立好的PCDL庫對GC-Q-TOF/MS采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索匹配定性分析，特征離子的檢索匹配參數(shù)：保留時(shí)間最大偏差0.25 min，精確質(zhì)量最大偏差50×10-6（50 ppm），化合物檢出判定條件為至少2個(gè)特征離子檢出，綜合得分＞60分。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

以芹菜基質(zhì)中加入0.075 mg·kg-1目標(biāo)化合物的回收率為指標(biāo)，分別考察了甲醇、乙腈和含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液對79種化合物提取效率的影響。結(jié)果表明，采用甲醇提取時(shí)，共提物的色素較多，回收率為52.1%～78.2%；用含0.1%（v/v）甲酸的乙腈提取時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率為0%～105.2%；用乙腈提取時(shí)，79種化合物的回收率為60.9%～109.0%，提取效果最佳。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇含乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2 數(shù)據(jù)庫的建立

采用GC-Q-TOF/MS對429種農(nóng)藥殘留進(jìn)行分析，得到特征離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間等信息，將化合物的名稱、分子式、CAS號(hào)、保留時(shí)間和特征離子精確質(zhì)量數(shù)等信息，導(dǎo)入MassHunter PCDL Manager軟件，建立PCDL庫。將建成的PCDL庫對372批水果蔬菜樣品進(jìn)行定性分析，特征離子的檢索匹配參數(shù)為保留時(shí)間最大偏差0.25 min，精確質(zhì)量最大偏差50×10-6（50 ppm），化合物檢出判定條件為至少2個(gè)特征離子檢出，綜合得分＞60分，共篩查出79種農(nóng)藥殘留。建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對79種農(nóng)藥殘留進(jìn)行定量分析，79種農(nóng)藥殘留的化合物的名稱、保留時(shí)間、定量離子和定性離子精確質(zhì)量數(shù)見表1。

表1 79種農(nóng)藥殘留化合物保留時(shí)間、碎片質(zhì)譜參數(shù)及定量限

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

采用氣相色譜-質(zhì)譜法時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)主要由與分析物共流出的組分所致，可表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)考察了11種典型基質(zhì)（芹菜、菠菜、茄子、青菜、韭菜、豇豆、蘋果、梨、桃、橙子和葡萄）的基質(zhì)效應(yīng)，比較目標(biāo)物在純試劑和基質(zhì)液中的峰面積，得到基質(zhì)響應(yīng)相對強(qiáng)度（ME）=（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積/試劑標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積）×100%。ME＞120%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；80%＜ME＜120%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；ME＜70%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)[20]。11種基質(zhì)中，79種農(nóng)藥中29.27%的農(nóng)藥ME＞120%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。14.63%的農(nóng)藥80%＜ME＜120%，表現(xiàn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯，其余表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，為了定量準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配溶液對樣品進(jìn)行定量檢測。

2.4 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限、回收率及精密度

配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各目標(biāo)化合物在0～2.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.99。在基質(zhì)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，以S/N≥10確定方法的定量限。結(jié)果表明，在多個(gè)基質(zhì)中，79種化合物定量限在0.01～0.05 mg·kg-1，具體見表1。

考察方法的準(zhǔn)確性，在芹菜空白基質(zhì)中做0.025 mg·kg-1、0.075 mg·kg-1、0.250 mg·kg-13 個(gè) 水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，在上述儀器條件下測定，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，79種化合物在3個(gè)添加水平下的平均回收率分別為62.93%～114.07%、73.11%～117.63%、72.39%～113.94%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～16.0%（n=6），說明方法整體精確度和精密度良好。

3 結(jié)論

本研究首先利用GC-Q-TOF/MS結(jié)合MassHunter、PCDL軟件建立429種農(nóng)藥的譜庫。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，在空白芹菜基質(zhì)中添加0.025 mg·kg-1、0.075 mg·kg-1、0.250 mg·kg-13 個(gè)濃度水平下，方法的平均回收率62.93%～117.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.2%～16.0%，滿足方法學(xué)要求。隨后采用該方法，針對372批水果蔬菜樣品，經(jīng)QuEChERS前處理方法進(jìn)行萃取凈化后，結(jié)合GC-Q-TOF/MS進(jìn)行分析和PCDL譜庫全離子篩查模式檢索，以保留時(shí)間、特征離子精確質(zhì)量數(shù)等作為定性依據(jù)進(jìn)行定性篩查，共篩查出79種農(nóng)藥殘留。對于篩查出的79種農(nóng)藥殘留，利用空白基質(zhì)建立各農(nóng)藥殘留的基質(zhì)標(biāo)曲，并進(jìn)行定量分析，79種農(nóng)藥殘留在0～2.00 μg·mL-1線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R＞0.99，定量限為0.01～0.05 mg·kg-1。