余甘子果渣抑菌免洗凝膠的制備工藝研究

譚慶芻 黃浩洲 羅傳紅 李 莞 莫太剛 張定堃 韓 麗 林俊芝

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,西南特色中藥資源省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都,611137; 2 成都市三勒漿藥業(yè)集團(tuán)四川華美制藥有限公司,成都,610045; 3 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,代謝性疾病中醫(yī)藥調(diào)控四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都,610072)

余甘子為大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實(shí),是我國(guó)西南地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物[1]。余甘子風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富,由于其保健功效突出,被聯(lián)合國(guó)作為保健植物進(jìn)行推廣種植[2-3]。目前,全世界大約有17個(gè)國(guó)家及地區(qū)在自己的傳統(tǒng)藥物體系中使用了余甘子,在印度阿育吠陀(Ayurveda)醫(yī)學(xué)中具有很高的地位,在中國(guó)蒙古族、藏族、彝族、維吾爾族等多個(gè)民族醫(yī)學(xué)體系中高頻使用[4]。該品種1977年被載入《中華人民共和國(guó)藥典》,并列入原衛(wèi)生部“藥食同源”名單,現(xiàn)今成為西南地區(qū)鄉(xiāng)村振興的重點(diǎn)支撐品種。

課題組在四川、云南等地實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn),余甘子生產(chǎn)主要以鮮果榨汁為主,其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生2種主要固廢物,一是余甘子榨汁后產(chǎn)生大量果渣,干燥重量約為鮮果的30%,單個(gè)藥企年產(chǎn)可達(dá)300噸[5],主要通過(guò)曬干后填埋處理;另一種是其鮮汁靜置過(guò)程產(chǎn)生的大量沉淀物,年產(chǎn)近百噸,主要通過(guò)生物氧化處理,環(huán)保壓力大。由于鮮果壓榨對(duì)多酚的提取并不充分,果渣中含有大量的酚類物質(zhì),具有較強(qiáng)的酸性與腐蝕作用,掩埋后還可能影響土壤性質(zhì)。本研究首先比較研究了余甘子果渣與余甘子藥材的化學(xué)成分及含量差異,篩選了主要抑菌活性成分,以此指導(dǎo)余甘子果渣的最優(yōu)提取工藝,并采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選余甘子果渣抑菌免洗凝膠的制劑處方,以期探索余甘子果渣的綜合開(kāi)發(fā)途徑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 液相色譜儀(島津公司，日本，型號(hào):LC-2010AHLT),Milli-Q超純水儀(Millipore公司，美國(guó)，型號(hào):Reference),振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚科技有限公司，型號(hào):ZQLY-180V),生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療有限股份公司，型號(hào):HR30-ⅡA2),低溫冰箱(合肥美菱股份有限公司，型號(hào):BD-169C),1/10 000分析天平德國(guó)Sartorius公司，型號(hào):BSA224S)1/100 000分析天平(Sartorius公司，德國(guó),型號(hào):BT25S),RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號(hào):RE-52),冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司，型號(hào):SCIENTZ-10N),質(zhì)構(gòu)儀(上海騰拔儀器科技有限公司，型號(hào):Rapid TA+),pH計(jì)(濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司，型號(hào):PHS-3C)。

1.2 試劑 沒(méi)食子酸(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)：CHB201131,純度≥98%),訶黎勒酸、柯里拉京、鞣花酸(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：whq21050704、whq21040907、whq21010403;純度均≥98%)。腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：20210601),瓊脂粉(成都科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)：2019081301),大腸桿菌(Escherichiacoli),批號(hào)：BNCC336902、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，批號(hào)：BNCC337946、白念珠菌(candidaAlbicans),批號(hào)：BNCC352028購(gòu)于商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司;慶大霉素(0.04 g/mL西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：230141504),其余試劑為分析級(jí)。

1.3 分析樣品 余甘子果渣樣品S1-S10,對(duì)應(yīng)余甘子藥材樣品S11-S20(來(lái)源于成都三勒漿藥業(yè)在云南產(chǎn)地進(jìn)行鮮果榨汁產(chǎn)生的果渣,以及課題組在云南楚雄等產(chǎn)地收集),經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院許潤(rùn)春副教授鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthusemblica的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 余甘子果渣與余甘子藥材的化學(xué)成分比較

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液-甲醇,采用梯度洗脫,洗脫程序:0～6 min,5%甲醇;6～15 min,5%～7%甲醇;15～20 min,7%～15%甲醇;20～25 min,15%～21%甲醇;25～31 min,21%～22%甲醇;31～41 min,22%甲醇;41～47 min,22%～28%甲醇;47～51 min,28%～32%甲醇;51～57 min,32%～38%甲醇;57～70 min,38%～45%甲醇;70～80 min,45%～65%甲醇;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;體積流量為1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL[6]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取沒(méi)食子酸、柯里拉京、訶黎勒酸,鞣花酸對(duì)照品適量,精密稱定,分別置于容量瓶中,加50%甲醇配制質(zhì)量濃度分別為0.129 mg/mL、0.072 mg/mL、0.103 mg/mL、0.180 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取余甘子果渣粉末或藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩,下同)0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲20 min(300 W,40 kHz),放冷,加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 樣品含量測(cè)定 取10批余甘子果渣樣品與10批余甘子藥材樣品,按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品中沒(méi)食子酸、柯里拉京、訶黎勒酸與鞣花酸的含量。

2.2 余甘子果渣中主要抑菌活性成分篩選

2.2.1 菌懸液的制備 取適量白念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基,白念珠菌于28 ℃培養(yǎng)48 h,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)24 h后采用麥?zhǔn)瞎鼙葷岱ㄅ涑?06CFU/mL的菌液,備用[7]。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸、柯里拉京、訶子勒酸、鞣花酸適量,用二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)定容于容量瓶中,配制成濃度分別為0.131 mg/mL、0.110 mg/mL、0.177 mg/mL、0.131 mg/mL的供試品溶液,陽(yáng)性組為10 μg/mL慶大霉素。

2.2.3 活性成分最低抑菌濃度測(cè)定 取無(wú)菌96孔板,每孔加入100 μL含有0.5%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC)無(wú)菌培養(yǎng)基,每組樣品設(shè)定3個(gè)平行對(duì)照,取100 μL供試品溶液加入每排第1孔,與培養(yǎng)基充分混合,從中取100 μL加入到第2孔中,混合均勻后再取100 μL到第3孔中,以此類推,直到第11孔,取出100 μL棄去,陽(yáng)性對(duì)照為慶大霉素,陰性對(duì)照為空白DMSO培養(yǎng)基,在恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h,根據(jù)微孔中是否具有出現(xiàn)紅色來(lái)判斷有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),最低抑菌的濃度的判斷標(biāo)準(zhǔn)為微孔中不出現(xiàn)TTC紅色,各項(xiàng)操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行[8]。

2.3 余甘子果渣提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 提取次數(shù)考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入70%乙醇,固定其料液比為1∶10,回流2 h,分別提取1、2、3次,提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、濃縮、定容得到供試品溶液,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選。

2.3.2 提取時(shí)間考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入70%乙醇,固定其料液比為1∶10,提取次數(shù)為1次,分別回流0.5、1、2、3、4 h,提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、濃縮、定容得到供試品,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選。

2.3.3 乙醇濃度考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇,固定料液比為1∶10,回流2 h,提取次數(shù)為1次,提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、濃縮、定容得到供試品,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選。

2.3.4 料液比考察 精密稱取適量同一批次余甘子果渣各5份,分別加入70%乙醇,使其料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12,回流2 h,提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、濃縮、定容、干燥,得到供試品,以篩選出的主要抑菌成分含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選。

2.4 余甘子果渣抑菌免洗凝膠的制備工藝優(yōu)選

2.4.1 余甘子果渣提取液的制備 按照“2.3”中篩選出的最優(yōu)提取工藝制備果渣提取液。

2.4.2 基質(zhì)的篩選 凝膠劑屬局部外用制劑,根據(jù)凝膠劑的特點(diǎn),處方中除主藥外,應(yīng)包含凝膠基質(zhì)、保濕劑、防腐劑等。參考凝膠劑的常用基質(zhì),用于制備凝膠的輔料以卡波姆U20、卡波姆U21、卡波姆940、甲基纖維素(Methyl，MC)、羧甲基纖維素鈉(Carboxymethyl Cellulose-Na,CMC-Na)等較為常用,這些凝膠材料也是常用的生物黏附材料,在體內(nèi)均能生物降解,對(duì)皮膚刺激性小,制備免洗凝膠劑的關(guān)鍵是基質(zhì)篩選,通過(guò)感官評(píng)價(jià)評(píng)分對(duì)基質(zhì)進(jìn)行篩選。

2.4.3 不同基質(zhì)凝膠制備工藝篩選 稱取去離子水20 g于500 mL燒杯中,分別稱取卡波姆U20 0.4 g[9]、卡波姆U21 0.4 g[10]或卡波姆940 0.4 g[11]分散至水中待其完全溶脹,或緩慢加入MC 3 g[12]或CMC-Na 4 g[13]繼續(xù)攪拌制成凝膠,加入30 g藥液、3 g甘油、95%乙醇10 g,用TEA調(diào)pH值為5～6,攪拌均勻,純化水補(bǔ)重到100 g,比較5種基質(zhì)的成型效果,篩選最優(yōu)成型基質(zhì)。

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化余甘子果渣抑菌免洗凝膠處方 以各配方樣品的感官指標(biāo)(包括透明度、涂展性、殘留量、膚感)及理化指標(biāo)(包括黏度、黏著性、稠度、穩(wěn)定性)為評(píng)價(jià)指標(biāo),針對(duì)余甘子果渣免洗凝膠成型的主要成分果渣提取液、卡波姆U20、甘油,采取響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化處方比例。配方樣品的感官指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1,用量范圍見(jiàn)表2，響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。配方樣品的理化指標(biāo)采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定,采用A/BE-d45探頭,將觸發(fā)力設(shè)置為3 g,將探頭的前進(jìn)速度設(shè)置為0.3 mm/s,接觸保持時(shí)間為10 s,在測(cè)定完成后探頭回收速度1 mm/s,將測(cè)定距離設(shè)置為10 mm,分別對(duì)不同條件下制備的余甘子果渣抑菌免洗凝膠進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析,對(duì)質(zhì)構(gòu)分析曲線進(jìn)行積分處理,黏著性(Firmness)用最小力表示,稠度由正峰面積表示;黏度指標(biāo)(Index of Viscosity)以負(fù)峰面積表示,分值范圍為1～10分[14]。

表1 感官評(píng)價(jià)考察指標(biāo)賦分值

表2 凝膠劑處方范圍

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平

2.4.5 抑菌效果驗(yàn)證 在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行操作,將106CFU/mL的菌懸液0.2 mL涂布在凝固的平板表面,平行3份;將5 mm濾紙片分別放置于凝膠及無(wú)菌水液體中,浸泡4 h,在生物安全柜中用無(wú)菌鑷子進(jìn)行操作順時(shí)針將濾紙片均勻安置于培養(yǎng)平板中,37 ℃培養(yǎng)24 h,等待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈直徑,計(jì)算平均值[15]。

2.4.6 工藝驗(yàn)證 按響應(yīng)面優(yōu)化得出最終處方同時(shí)進(jìn)行3批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,計(jì)算最終評(píng)分。

2.5 結(jié)果

2.5.1 含量測(cè)定結(jié)果 余甘子果渣樣品與余甘子藥材樣品的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)圖譜見(jiàn)圖1,含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由圖譜結(jié)果可以看出,余甘子果渣與余甘子藥材的成分基本相同,但測(cè)定的4個(gè)成分含量不同,相對(duì)較低。沒(méi)食子酸在余甘子果渣中含量為0.218%～2.148%,在余甘子藥材中含量為0.991%～3.176%;柯里拉京在余甘子果渣中含量為0.004%～0.039%,在余甘子藥材中含量為0.760%～0.813%;訶黎勒酸在余甘子果渣中含量為0.063%～0.202%,在余甘子藥材中含量為0.716%～2.735%;鞣花酸在余甘子果渣中含量為0.040%～0.105%,在余甘子藥材中含量為0.394%～0.652%。余甘子鮮果在壓榨過(guò)程中,多酚類成分并未被完全提取出,部分批次果渣中殘留量較高,具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

表4 余甘子果渣與余甘子藥材中4種活性成分的含量(%)

2.5.2 指標(biāo)成分的抑菌活性篩選 訶黎勒酸、柯里拉京、沒(méi)食子酸與鞣花酸對(duì)白念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌效果見(jiàn)表5。由結(jié)果可知,4種指標(biāo)成分對(duì)3種細(xì)菌菌株均具有一定的抑制作用,陰性組每孔均有細(xì)菌生長(zhǎng),說(shuō)明空白溶劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。訶黎勒酸、柯里拉京、沒(méi)食子酸對(duì)3種菌種的最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)均低于10 μg/mL,其中訶黎勒酸的抑菌效果最強(qiáng),而鞣花酸的MIC為16.38～32.75 μg/mL,明顯弱于其他3種,故后續(xù)提取工藝優(yōu)化選擇沒(méi)食子酸、訶黎勒酸與柯里拉京含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表5 4種活性成分MIC(μg/mL)

2.5.3 提取工藝的考察結(jié)果 提取次數(shù)篩選結(jié)果如圖2A,由結(jié)果可知,隨著提取次數(shù)的增加,有效成分提取總量變化不明顯,這可能是果渣中的有效成分在第一次提取時(shí)就基本上被提取完成,從控制成本的角度考慮,提取次數(shù)定為1次。提取時(shí)間的篩選結(jié)果如圖2B,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),提取總量逐漸增多,在2 h時(shí)出現(xiàn)峰值,之后繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,提取總量反而減少,這與訶黎勒酸、柯里拉京長(zhǎng)時(shí)間受熱后的降解有關(guān),沒(méi)食子酸的不斷增加也是訶黎勒酸不斷水解的結(jié)果[5]。故確定最優(yōu)提取時(shí)間為2 h。乙醇濃度篩選結(jié)果如圖2C,隨著乙醇濃度的升高,3種成分的提取率均出現(xiàn)增高,但是在乙醇濃度達(dá)到70%后,總含量隨著醇濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì),故確定70%的醇濃度為最優(yōu)提取濃度。料液比篩選結(jié)果如圖2D,料液比對(duì)提取量有重要影響,在料液比為1∶4、1∶6時(shí)提取物含量較低,在達(dá)到1∶10后,提取總量變化不大,總體呈現(xiàn)料液比越高,提取物總量越高的趨勢(shì),故確定最優(yōu)料液比為1∶10。綜上所述，優(yōu)選出的提取工藝為“取余甘子果渣,加入10倍體積的70%乙醇,回流2 h,提取1次,提取液經(jīng)濾過(guò)、定容得到供試品”。

2.5.4 基質(zhì)的選擇結(jié)果 凝膠劑的基質(zhì)考察結(jié)果見(jiàn)表6。由結(jié)果可知,當(dāng)選擇MC或CMC-Na作為凝膠基質(zhì)時(shí),加入藥液后凝膠體系易發(fā)生絮凝而渾濁,且使用時(shí)較為油膩,涂展性差,在手背殘留量較大,穩(wěn)定性不好。而選擇卡波姆系列作為凝膠基質(zhì)時(shí),整體感官明顯優(yōu)于MC或CMC-Na,膚感清爽且保濕持久。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),以卡波姆U20為基質(zhì)時(shí),制備出的凝膠顏色金黃且透明度良好,使用清爽不油膩,相對(duì)最優(yōu),故采用卡波姆U20作為余甘子果渣抑菌免洗凝膠的基質(zhì)。

表6 不同基質(zhì)考察結(jié)果

表7 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

2.5.5 Box-Behnken優(yōu)化處方結(jié)果 基質(zhì)處方的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表7。由結(jié)果可知,隨著卡波姆、甘油、藥液比例的變化,凝膠性質(zhì)的綜合得分明顯不同,在54.56～76.54之間波動(dòng)。利用軟件Design-Expert 12.0分析對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,得到基質(zhì)綜合評(píng)分與各因素變量的二次方程模型為Y=74.94+2.15×A+0.616 7×B-3.75×C-0.222 5×AB-1.22×AC-0.260 81×BC-4.50×A2-2.19×B2-10.53×C2,回歸方程模型方差分析結(jié)果如表8,不同卡波姆、藥液、甘油用量對(duì)綜合評(píng)分交互影響的等高線及響應(yīng)面如圖3所示,此模型具有顯著性(F=41.40,P=0.000 4<0.05)。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.611 2>0.05),說(shuō)明該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)水平,實(shí)驗(yàn)失誤小,可用此模型對(duì)余甘子果渣免洗凝膠基質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型一次項(xiàng)A、C顯著,B不顯著,交互項(xiàng)BC顯著,AC、AB不顯著,二次項(xiàng)A2、C2顯著B(niǎo)2不顯著,根據(jù)F值可知各基質(zhì)用量對(duì)余甘子果渣免洗凝膠處方量的綜合評(píng)分影響程度為C>A>B,即果渣提取液用量>卡波姆用量>甘油用量。

表8 回歸模型方差分析結(jié)果

各項(xiàng)指標(biāo)綜合結(jié)果評(píng)分曲面得出的最佳處方組成為:30%果渣提取液、0.4%卡波姆、3%甘油、4%的95%乙醇、三乙醇胺調(diào)pH值到5～6,其為純化水,余甘子免洗凝膠綜合評(píng)分為74.93。同時(shí)進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平均值73.88,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值為0.39%,表明該優(yōu)化制劑處方穩(wěn)定可靠。

2.5.6 抑菌效果驗(yàn)證 使用優(yōu)化工藝制備的余甘子果渣抑菌免洗凝膠,驗(yàn)證對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌、大腸桿菌的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),余甘子果渣抑菌免洗凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為1.12 cm、1.15 cm、1.00 cm;陽(yáng)性組為慶大霉素,對(duì)3種細(xì)菌的抑菌圈直徑分別為1.30 cm、1.42 cm、1.40 cm。上述結(jié)果表明,余甘子果渣抑菌免洗凝膠具有較好的抑菌效果。

3 討論

本研究通過(guò)化學(xué)成分比較,證明了余甘子鮮果榨汁后得到的果渣具有與余甘子藥材相同的組成、可提取的多酚及其開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。通過(guò)對(duì)4種指標(biāo)成分的抑菌活性比較,發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸、柯里拉京、訶黎勒酸具有較好的抑菌活性。有研究表明,沒(méi)食子酸能改變金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的滲透性完整性,明顯抑制金黃色葡萄球菌胞可溶性蛋白的表達(dá)[16],而訶黎勒酸是一種有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑,對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)活動(dòng)具有明顯抑制作用[17]。在體外培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn),將柯里拉京加入到培養(yǎng)基中可減少青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-binding Protein2a，PBP2a)的產(chǎn)量[18],同時(shí)柯里拉京在一定程度上抑制了β-內(nèi)酰胺酶活性,可顯著性增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素如苯唑西林、頭孢美唑的抗耐甲氧西林金葡菌作用。由于在回流過(guò)程中,訶黎勒酸首先產(chǎn)生1分子柯里拉京和1分子的訶子次酸,柯里拉京則繼續(xù)水解生成沒(méi)食子酸[19-20],推測(cè)這2種成分的抑菌機(jī)制與沒(méi)食子酸相似,也是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性以及抑制菌體蛋白質(zhì)產(chǎn)生,或者改變細(xì)胞膜的通透性引起胞質(zhì)外滲等方式表達(dá)抑菌作用。

進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化提取工藝及凝膠劑基質(zhì)配方,得到了余甘子果渣抑菌免洗凝膠。見(jiàn)圖4。該品呈金黃色,質(zhì)地細(xì)膩,有均勻光澤,表面無(wú)氣泡,涂在手背上可均勻涂開(kāi),涂展性好。其pH值為5.87～5.98,與人體皮膚pH值相似,符合抑菌凝膠要求。離心30 min后凝膠性狀無(wú)明顯變化,證明具有較好的穩(wěn)定性。依據(jù)《2019版消毒產(chǎn)品衛(wèi)生安全評(píng)價(jià)技術(shù)要求》,對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量相關(guān)項(xiàng)進(jìn)行研究,初步建立余甘子果渣免洗凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為后期余甘子果渣抑菌免洗凝膠的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上市提供研究基礎(chǔ)。