細(xì)菌素CAMT2抗菌納米纖維膜制備及其特性研究

李啟彬，張雪梅，劉穎*，房志家，徐春厚

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江，524088) 2(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江，524088)

化學(xué)防腐劑的使用越來(lái)越受到消費(fèi)者的排斥，由此刺激了對(duì)天然安全的生物防腐劑的研究與開(kāi)發(fā)[1]，其中，細(xì)菌素是微生物核糖體合成的抗菌多肽，由于在消化過(guò)程中可被蛋白酶水解，在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生不利的影響[2]，因此作為天然安全的生物防腐劑替代化學(xué)防腐劑受到關(guān)注。目前，乳酸鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素(Nisin)已被60多個(gè)國(guó)家認(rèn)為天然安全的食品防腐劑，并被大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用[3]，但該細(xì)菌素僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有抑制作用[4]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等桿菌屬產(chǎn)生的細(xì)菌素或細(xì)菌素類(lèi)物質(zhì)不僅具有較強(qiáng)的抗菌活性，而且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌均有抗菌活性，具有較寬的抗菌譜[1, 5]。

然而，細(xì)菌素直接添加到食品中可能會(huì)受到食品中脂肪等復(fù)雜成分的影響，從而影響細(xì)菌素的活性，進(jìn)而不能達(dá)到預(yù)期的抗菌防腐效果[6-8]。為了克服以上問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用微膠囊[9]、納米脂質(zhì)體[7, 10-11]、靜電紡絲[12-13]等包埋技術(shù)，對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行保護(hù)，提高其使用穩(wěn)定性。其中，靜電紡絲技術(shù)將帶有電荷的紡絲液在高壓電場(chǎng)的作用下克服表面張力，產(chǎn)生帶電的微小射流，進(jìn)而被拉伸成絲狀纖維，同時(shí)將活性物質(zhì)包埋于纖維中，最后固化成膜[14]。利用該技術(shù)制得的納米纖維膜由于具有比表面積大、孔隙率高、功能特性強(qiáng)、緩釋效果好以及負(fù)載量高等優(yōu)點(diǎn)，在活性物質(zhì)包埋等方面受到青睞[15]。

本研究對(duì)象細(xì)菌素 CAMT2 是由分離自南海海域?qū)毷唪~(yú)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJHD3-06代謝產(chǎn)生的一種新型細(xì)菌素，能抑制主要的食品腐敗和食源性致病菌如李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[1]?？赡褪芨邷剡_(dá)100 ℃并不失活，在pH為2～10具有較強(qiáng)的抗性。其中李斯特菌又被稱(chēng)為“冰箱殺手”，因其能在高鹽、低溫等逆境中生長(zhǎng)，是常見(jiàn)于低溫冰鮮食品中的致病菌，人感染后死亡概率在30%以上，歷年有關(guān)低溫下食品被李斯特菌污染致病的安全事件常有報(bào)道[16-17]。CAMT2對(duì)單增李斯特菌(L.monocytogenes)有明顯的抗菌活性[1, 18]，利用靜電紡絲技術(shù)將其包埋于納米纖維膜中，作為食品的活性包裝材料，用于食品(尤其是低溫冷凍食品)的保鮮。通過(guò)納米纖維的緩釋作用，CAMT2能較長(zhǎng)時(shí)間地發(fā)揮抑菌功能，保護(hù)食品安全，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZJHD3-06，廣東海洋大學(xué)CAMT團(tuán)隊(duì)分離自南海寶石石斑魚(yú)腸道，NCBI登錄號(hào)：KF585041；單增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)ATCC 19111，購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，重均分子質(zhì)量75 000～80 000 Da)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌素CAMT2，實(shí)驗(yàn)室制備；葡聚糖凝膠SephadexG-50，美國(guó)GE醫(yī)療集團(tuán)；甲醇(色譜純)，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；PBS，碧云天生物技術(shù)有限公司；改良TGE培養(yǎng)基(葡萄糖7.15 g/L、FeSO40.11 mg/L、維生素C 0.69 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、陳海水)，自行配制；TSA-YE培養(yǎng)基，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SS253靜電紡絲設(shè)備，北京永康樂(lè)業(yè)科技發(fā)展有限公司；Sorvall LYNX高速落地離心機(jī)、Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；AKTA purifier 100制備型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，美國(guó)GE醫(yī)療集團(tuán)；Agilent 1200半制備高效液相色譜，美國(guó)安捷倫科技；FlexSEM4800掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術(shù)公司；SGW-1傅立葉紅外光譜儀，上海上天精密儀器有限公司；磁力攪拌器、PHSJ-3F數(shù)字pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FDU-1110冷凍干燥機(jī)，EYELA東京理化器械株式會(huì)社；DW-86L80超低溫冰箱，杭州綠博儀器有限公司；再生醋酸纖維素透析袋(1 kDa)，北京索萊寶生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌素CAMT2的制備

按AN等[1]的方法制備細(xì)菌素CAMT2，將活化后的108CFU/mL ZJHD3-06種子液按3%接種量接種到改良TGE培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。在磁力攪拌器上，往上清液中緩慢加入硫酸銨粉末，使溶液的飽和度達(dá)60%。在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心30 min，收集沉淀物，透析脫鹽后凍干。凍干后產(chǎn)物采用SephadexG-50葡聚糖層析進(jìn)行純化，以pH 7.0 PBS緩沖液為流動(dòng)相洗脫，220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，收集活性組分?；钚越M分透析脫鹽后用HPLC進(jìn)一步純化，使用C18柱，以體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇-水溶液為流動(dòng)相洗脫，在220 nm處進(jìn)行監(jiān)測(cè)，收集活性組分，旋蒸除去甲醇，冷凍干燥制備得CAMT2粉末，備用。

1.2.2 細(xì)菌素CAMT2抑菌活性測(cè)定

CAMT2凍干粉用PBS溶解，使溶液濃度分別為40、60、80 mg/mL，采用濾紙片法[19]測(cè)定不同濃度水平的CAMT2對(duì)LM的抑菌活性。用生理鹽水稀釋活化后的LM菌液，調(diào)整菌液濃度OD600=0.3±0.01，吸取100 μL均勻涂布到準(zhǔn)備好的TSA-YE培養(yǎng)基上。滅菌后的直徑為3 mm濾紙圓片充分浸泡CAMT2溶液，貼在涂布有LM的TSA-YE培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察記錄抑菌圈大小。

1.2.3 CAMT2—PVA納米纖維膜的制備

1.2.3.1 紡絲液的制備

基于范笑笑等[20]的方法略加改進(jìn)，稱(chēng)取0.8 g PVA浸泡在10 mL去離子水中15 min，待PVA軟化后，加熱攪拌至PVA完全溶解。然后加入CAMT2，攪拌均勻，使其質(zhì)量濃度達(dá)40、60、80 mg/mL。最后超聲10 min脫氣備用。

1.2.3.2 靜電紡絲制備納米纖維膜

將制備好的CAMT2—PVA紡絲液吸入干燥的5 mL注射器中，排出空氣，固定在靜電紡絲設(shè)備的微量注射泵上。將注射器前端金屬針頭與高壓直流電源正極連接，以固定在接收器上的鋁箔作為接收屏。在正高壓+28 kV，負(fù)高壓-2.7 kV，接收距離15 cm，流速0.06 mL/min的條件下，進(jìn)行靜電紡絲，制備載細(xì)菌素的CAMT2—PVA納米纖維膜，置于烘箱中30 ℃干燥3 d去除殘留溶劑[21]。

1.2.4 CAMT2—PVA納米纖維膜抑菌活性的測(cè)定

用打孔器將納米纖維膜制成直徑為3 mm的圓片，貼在1.2.2制備好涂布有LM的TSA-YE培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察記錄抑菌圈直徑。以直徑同為3 mm的不負(fù)載細(xì)菌素的PVA圓片為空白對(duì)照，各平行3組。

1.2.5 CAMT2—PVA納米纖維膜緩釋效應(yīng)評(píng)價(jià)

將納米纖維膜制成直徑為3 mm的圓片，分別放入3支離心管中，加入3 mL PBS。室溫?zé)o菌環(huán)境下每12 h吸取200 μL緩沖液，使用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值，檢測(cè)至吸光值穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組，每次吸取后回補(bǔ)等量的PBS。

1.2.6 CAMT2-PVA納米纖維膜形貌觀察

將抑菌效果最優(yōu)的納米纖維膜裁剪成5 mm×5 mm方塊，表面噴鉑金處理，所有樣品噴金10 min。用掃描電子顯微鏡(3.0 kV，5.0× 10.0×)觀察其形貌。

1.2.7 CAMT2—PVA納米纖維膜的結(jié)構(gòu)檢測(cè)

將納米纖維膜攤平，放置于傅立葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR)接受片上，波數(shù)4 000～400 cm-1，掃描速率1 200 cm-1/min。使用origin 9.65對(duì)譜圖擬合波峰圖，進(jìn)行峰值識(shí)別，分析納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)[22]。

1.2.8 CAMT2—PVA納米纖維膜對(duì)3種水產(chǎn)基質(zhì)中LM的控制效果

1.2.8.1 三種水產(chǎn)基質(zhì)平板制備

凡納濱對(duì)蝦去頭尾、去殼；新鮮羅非魚(yú)去頭尾、魚(yú)皮魚(yú)骨；新鮮花蛤去殼，分別取肉，將每種基質(zhì)的肉分別與NaCl質(zhì)量濃度為9 g/L的生理鹽水以3∶7(g∶mL)的料液比混合，反復(fù)均質(zhì)至乳液狀，煮沸2 min后過(guò)濾，收集濾液于錐形瓶中，加2%瓊脂粉，121 ℃、20 min高溫滅菌，冷卻至55 ℃左右，按照1∶100的體積比接種OD600=0.3的LM菌懸液，然后倒平板制得對(duì)應(yīng)水產(chǎn)基質(zhì)LM指示平板[23]。

1.2.8.2 納米纖維膜對(duì)水產(chǎn)基質(zhì)中LM抑制效果

稱(chēng)取1.2.4中抑菌活性最好的CAMT2—PVA納米纖維膜4.0 g，置于滅菌后的錐形瓶中，加入50 mL無(wú)菌PBS，4 ℃冰箱存放。每12 h吸取200 μL PBS，采用牛津杯法[24]加入到制備好的含LM的水產(chǎn)品基質(zhì)培養(yǎng)基中，4 ℃下培養(yǎng)，記錄抑菌圈大小，測(cè)試7 d，每種基質(zhì)3個(gè)平行，每次吸取后回補(bǔ)等量的PBS[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用IBM SPSS 22軟件進(jìn)行顯著性分析以及使用Origin 9.65軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌素CAMT2電紡前后抑菌活性

靜電紡絲后的納米纖維膜在TSA-YE平板上對(duì)LM的抑菌活性如圖1所示，3種濃度的納米纖維膜均有抗菌活性，與紡絲前抑制活性比較見(jiàn)表1，CAMT2質(zhì)量濃度為40與60 mg/mL電紡前抑菌圈直徑分別為16.42與21.36 mm，而電紡后比電紡前抑菌圈顯著減小，分別減小了6.44與4.90 mm。但當(dāng)CAMT2質(zhì)量濃度為80 mg/mL時(shí)，電紡前后抑菌圈直徑差異不顯著，電紡后抑菌圈直徑僅減小了0.40 mm，與電紡前比，抑菌活性得到了有效保留。電紡后抑菌圈的小幅縮小推測(cè)是電紡過(guò)程中較高的電壓使部分的細(xì)菌素失活或是細(xì)菌素被包埋于納米纖維中不能快速釋放所致[21]。

圖1 不同細(xì)菌素濃度的CAMT2—PVA納米纖維膜抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of CAMT2—PVA nanofiber membranes with different bacteriocin concentrations注：1-40 mg/mL CAMT2—PVA納米纖維膜；2-60 mg/mL CAMT2—PVA納米纖維膜；3-80 mg/mL CAMT2—PVA納米纖維膜；4-吸附有80 mg/mL CAMT2細(xì)菌素溶液的濾紙片；5-PVA空白對(duì)照

表1 不同濃度細(xì)菌素CAMT2電紡前后抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of different concentrations of bacteriocin CAMT2 before and after electrospinning

2.2 CAMT2—PVA納米纖維膜緩釋效應(yīng)

將納米纖維膜浸泡 PBS對(duì)PBS中CAMT2的釋放量進(jìn)行緩釋監(jiān)測(cè)，由圖2可知，在0～0.5 d 為PBS滲透進(jìn)入納米纖維膜高分子體系內(nèi)部的擴(kuò)散階段，活性物質(zhì)CAMT2尚未被釋放出體系外，OD值沒(méi)有發(fā)生變化。隨著PBS不斷涌入，納米纖維膜結(jié)構(gòu)逐漸松弛，CAMT2開(kāi)始從納米體系中釋放，并進(jìn)入突釋階段，在第0.5～2天表現(xiàn)出OD值急速增大。當(dāng)PBS大量涌入體系內(nèi)，導(dǎo)致納米纖維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象，甚至崩裂，同時(shí)CAMT2接觸到PBS，最終導(dǎo)致負(fù)載的CAMT2以較高的釋放速率從納米纖維膜中釋放出來(lái)[25]，但在第2天后，CAMT2釋放速率放緩，逐漸進(jìn)入恒速釋放過(guò)程，第4天后釋放量趨于穩(wěn)定。

2.3 CAMT2—PVA納米纖維膜形貌表征

CAMT2質(zhì)量濃度為80 mg/mL的納米纖維膜的電鏡圖見(jiàn)圖3，CAMT2—PVA纖維直徑相近，為(720±110) nm，纖維表面光滑，無(wú)明顯串珠，方向隨機(jī)，形成質(zhì)地緊密的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)有利于活性物質(zhì)的有效釋放及與食品基質(zhì)中致病菌的接觸[15]。

圖2 細(xì)菌素納米纖維膜緩釋結(jié)果Fig.2 Results of sustained release of bacteriocin nanofiber membrane

a-5 000×；b-10 000×圖3 CAMT2—PVA納米纖維膜掃描電鏡結(jié)果Fig.3 SEM results of CAMT2—PVA nanofiber membrane

2.4 CAMT2—PVA納米纖維膜FT-IR分析

FT-IR可以對(duì)電紡纖維膜的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效分析(圖4)。

圖4 納米纖維膜紅外光譜Fig.4 FT-IR of nanofiber membrane

由圖4可知，負(fù)載細(xì)菌素的CAMT2—PVA納米纖維膜與PVA在3 700～3 200 cm-1存在較寬的強(qiáng)吸收峰，歸因于PVA中O—H的伸縮振動(dòng)[20]，在2 939 cm-1處的吸收峰為亞甲基(—CH2)中C—H的伸縮振動(dòng)峰[26]，這兩處的吸收峰說(shuō)明了CAMT2—PVA納米纖維膜存在PVA基質(zhì)。細(xì)菌素CAMT2于3 032 cm-1處的吸收峰歸因于C—H鍵，位于1 684 cm-1的吸收峰可歸因于蛋白質(zhì)β螺旋N…H氫鍵[27]，位于1 402 cm-1的吸收峰歸因于蛋白質(zhì)—CH2—鍵的搖擺振動(dòng)，位于1 064 cm-1左右的特征吸收峰歸因于羧基(COOH)的C—O鍵[28]。CAMT2—PVA對(duì)比PVA無(wú)新的顯著吸收峰，但CAMT2—PVA位于1 425、1 136與1 093 cm-1處的吸收峰透過(guò)率顯著增強(qiáng)，是PVA與細(xì)菌素CAMT2各自吸收峰疊加形成的，說(shuō)明靜電紡絲過(guò)程中PVA對(duì)細(xì)菌素CAMT2進(jìn)行了有效的物理包埋[29]。

2.5 CAMT2—PVA納米纖維膜對(duì)水產(chǎn)基質(zhì)中LM的控制效應(yīng)

CAMT2質(zhì)量濃度為80 mg/mL的納米纖維膜在4 ℃貯藏條件下對(duì)3種水產(chǎn)基質(zhì)中LM均有較好的抑制效果(圖5)，在0～1 d細(xì)菌素CAMT2的釋放量較低，未達(dá)到最小抑菌濃度，無(wú)明顯抑菌圈，未表現(xiàn)出抑菌活性。在第1～1.5天后，CAMT2—PVA纖維膜釋放出的CAMT2濃度開(kāi)始增加，并陸續(xù)出現(xiàn)了抑菌圈。第1.5天后CAMT2—PVA納米纖維膜中CAMT2的釋放量迅速增加，對(duì)LM的抑菌圈直徑顯著增大，但第2天后抑菌圈直徑增加緩慢，第6～9天抑菌圈直徑基本保持穩(wěn)定，這與納米纖維膜的突釋和緩釋階段相對(duì)應(yīng)。由圖5可知，在羅非魚(yú)及對(duì)蝦基質(zhì)中抑菌圈大小接近，并均大于在花蛤基質(zhì)中的抑菌圈大?。凰訡AMT2—PVA納米纖維膜在羅非魚(yú)、對(duì)蝦基質(zhì)中對(duì)LM抑制效果接近，且抑菌效果略?xún)?yōu)于對(duì)花蛤基質(zhì)的效果。

圖5 4 ℃下細(xì)菌素納米纖維膜在水產(chǎn)基質(zhì)中對(duì)LM抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of bacteriocin nanofiber membranes on LM in aquatic substrates at 4 ℃

3 結(jié)論

本研究以PVA與細(xì)菌素CAMT2配制紡絲液，通過(guò)靜電紡絲制備CAMT2—PVA納米纖維膜。CAMT2濃度為80 mg/mL制備的CAMT2—PVA納米纖維膜電紡后抑菌圈直徑對(duì)比電紡前的無(wú)顯著差異，抑菌活性保留效果良好。CAMT2—PVA纖維膜在第0.5～2天為突釋期，細(xì)菌素的釋放量隨時(shí)間推移顯著增加，第2天后進(jìn)入緩釋期，細(xì)菌素釋放量緩慢上升，第7天后穩(wěn)定。CAMT2—PVA納米纖維膜直徑均勻，分布致密，具有多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。說(shuō)明靜電紡絲過(guò)程中PVA對(duì)CAMT2進(jìn)行了有效的物理包埋。在4 ℃下，CAMT2—PVA納米纖維膜在3種典型的水產(chǎn)基質(zhì)中具有明顯的抑菌效果。

本研究制備了CAMT2—PVA抗菌納米纖維膜，對(duì)纖維膜的抑菌能力、緩釋性能和實(shí)際應(yīng)用等進(jìn)行了評(píng)價(jià)，但要實(shí)際應(yīng)用于食品包裝材料中仍需要進(jìn)行力學(xué)、疏水性等評(píng)價(jià)。目前對(duì)靜電紡絲包埋細(xì)菌素用于食品包裝材料的研究報(bào)道仍然較少，所以本研究制備的CAMT2—PVA納米纖維膜具有較大應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景，希望能夠?qū)σ蚣?xì)菌污染食品致病的安全問(wèn)題有所幫助。