混菌發(fā)酵對昌黎赤霞珠葡萄酒品質(zhì)的影響

李毅麗，李紅玉，賀艷楠，高山

1(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 質(zhì)量檢測與管理系，河北 石家莊，050000)2(中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北 昌黎，066600)3(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050000)

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵后獲得的酒精飲料。發(fā)酵過程中，酵母菌可以將葡萄漿果中的糖分解為乙醇、CO2和其他副產(chǎn)物。商業(yè)釀酒酵母由于發(fā)酵過程易于控制，產(chǎn)品同質(zhì)性好，在葡萄酒生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，但同時導(dǎo)致葡萄酒缺乏典型特征和復(fù)雜多樣的風(fēng)格[1]。而一些天然存在于葡萄中的非釀酒酵母,如伊薩酵母屬、畢赤酵母屬、葡萄汁有孢漢遜酵母屬和德巴利酵母屬等，與釀酒酵母同時參與到葡萄酒的酒精發(fā)酵過程中，能夠促進(jìn)葡萄酒中酯類、醇類等揮發(fā)性香氣成分的生成[2-3]，對葡萄酒的色、香、味及產(chǎn)品風(fēng)格的形成起到至關(guān)重要的作用[4]。PRIOR等[5]將Pichiakluyveri和Saccharomycescerevisiae混合接種發(fā)酵，葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量顯著提高；LIU[6]等將Torulasporadelbrueckii和Schizosaccharomycespombe與S.cerevisiae混合發(fā)酵所得葡萄酒品質(zhì)得以改善。不同酵母株對葡萄酒香氣影響存在差異，在釀酒時需要根據(jù)原料和產(chǎn)地選擇合適的釀酒酵母和非釀酒酵母組合[7]。且研究發(fā)現(xiàn)，接種比例對于混合釀造工藝的優(yōu)化起到重要作用[1,8-9]。

河北昌黎是中國干紅葡萄酒的搖籃，是“中國干紅葡萄酒之鄉(xiāng)” “中國釀酒葡萄之鄉(xiāng)”和“中國干紅葡萄酒城”。但近年來，昌黎產(chǎn)區(qū)葡萄酒產(chǎn)業(yè)缺乏本土特色，產(chǎn)品趨于大眾化，急需研究與原料相匹配的釀造工藝，開發(fā)出具有特色的新產(chǎn)品，以滿足廣大消費(fèi)者對于葡萄酒的不同需求。本研究以河北昌黎產(chǎn)區(qū)“赤霞珠”葡萄為原料，利用東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母等2種非釀酒酵母與國產(chǎn)安琪釀酒酵母分別按照不同比例進(jìn)行混菌發(fā)酵試驗，研究葡萄酒品質(zhì)差異，探究適合的混菌發(fā)酵工藝，為國產(chǎn)酵母的應(yīng)用開辟新的思路，充分發(fā)掘昌黎產(chǎn)區(qū)“赤霞珠”葡萄酒所特有的產(chǎn)品特色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠，于2021年10月27日采自河北昌黎產(chǎn)區(qū)，總糖含量(以還原糖計)為 195 g/L，可滴定酸含量(以酒石酸計)為6.86 g/L， pH為3.62，衛(wèi)生狀況良好。

酵母菌株：東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)為河北科技大學(xué)飲料酒釀造研究室于 2008年、2009年和2010年分別從河北省昌黎和沙城2個葡萄酒產(chǎn)區(qū)的葡萄園土壤、葡萄果表，以及赤霞珠葡萄和龍眼葡萄的自然發(fā)酵過程中分離、純化，并保藏的自選酵母菌。安琪酵母(AngelSaccharomycescerevisiae)購于安琪酵母股份有限公司。

試劑：葡萄糖、NaOH、NaCl、重亞硫酸鉀(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；3-辛醇、乙醇、苯乙酮、苯甲醇、乙酸異戊酯(均為色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；果膠酶，煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司；斐林試劑、次甲基藍(lán)指示劑、酚酞指示劑等按照GB/T 603—2002進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

7820-5975型GC-MS聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取手柄，美國Supelco公司；T09-1S恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DHP-520電熱恒溫培養(yǎng)箱，常州中捷實驗儀器制造有限公司；UV5100型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；雷磁pHS-3C型pH計，上海儀電儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗處理

對照組：只接種單一安琪釀酒酵母(A)；只接種單一東方伊薩酵母(I)；只接種單一葡萄汁有孢漢遜酵母(H)。

東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母混菌發(fā)酵組：東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母3∶1(體積比，下同)同時接種發(fā)酵(IA1)；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母1∶1同時接種發(fā)酵(IA2)；東方伊薩酵母與安琪釀酒酵母1∶3同時接種發(fā)酵(IA3)。

葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母混菌發(fā)酵組：葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母3∶1同時接種發(fā)酵(HA1)；葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母1∶1同時接種發(fā)酵(HA2)；葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪釀酒酵母1∶3同時接種發(fā)酵(HA3)。

酵母的總接種量為 1×106CFU/mL；同時接種指同時加入非釀酒酵母與釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。

1.3.2 葡萄酒釀造工藝

葡萄采收后經(jīng)除梗、破碎、混勻后轉(zhuǎn)入徹底滅菌的10 L玻璃發(fā)酵罐，酒樣中加入偏重亞硫酸鉀50 mg/L、果膠酶 30 mg/L，靜置過夜，分別接種1.3.1中所述混合酵母，發(fā)酵溫度為25～27 ℃。酒精發(fā)酵結(jié)束后(殘?zhí)?4 g/L)浸漬24 h，分離得到發(fā)酵原酒。之后，采用控溫啟動自然發(fā)酵的方式進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，結(jié)束后加入 50 mg/L SO2終止發(fā)酵并滿罐密封貯存，靜置 1 個月，分離沉淀并裝瓶于恒溫地下酒窖瓶儲，陳釀 3 個月后對各發(fā)酵組取樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析、揮發(fā)性香氣成分測定、香氣感官評價。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測

葡萄和葡萄酒中總糖、酒精度等理化指標(biāo)的測定參考 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.4 揮發(fā)性成分測定萃取

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對葡萄酒香氣成分進(jìn)行檢測，參考毛建利等[10]的方法，略作改動。

前處理：稱取2 g NaCl，準(zhǔn)確移取5 mL酒樣，0.5 mL質(zhì)量濃度為0.3 g/L的內(nèi)標(biāo)物3-辛醇，依次放入20 mL頂空瓶中；磁力攪拌器轉(zhuǎn)速1 000 r/min，50 ℃水浴平衡15 min，萃取吸附30 min，進(jìn)樣口250 ℃解吸3 min。

色譜條件：Agilent J&W HP-INNOWAX 色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm)；載氣He(99.999%)，流速1.0 mL/min；升溫程序：40 ℃保持12 min，以10 ℃/min的速率升至120 ℃保持12 min，再以3 ℃/min升至250 ℃保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃。MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍45～550 u。

揮發(fā)性物質(zhì)的定性：提取揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖，通過NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行，并根據(jù)C8-C20烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，用保留指數(shù)(retention index，RI)法對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性。

揮發(fā)性物質(zhì)的定量[11]：選用內(nèi)標(biāo)半定量法，通過內(nèi)標(biāo)物的峰面積與樣品中各組分的峰面積比值，計算各化合物的相對濃度，按照公式(1)計算：

(1)

式中：c1，待測化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL；f，相對校正因子，f=1；A1，待測化合物的峰面積；A0，內(nèi)標(biāo)物(3-辛醇)的峰面積；c0，加入內(nèi)標(biāo)(3-辛醇)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0，加入內(nèi)標(biāo)(3-辛醇)的體積，mL；V1，萃取的5 mL稀釋酒樣的體積，mL。

1.3.5 香氣活性值計算及氣味特征分類

香氣活性值(odour activity value，OAV)由物質(zhì)含量除以其嗅覺閾值得到。葡萄酒中香氣物質(zhì)按照其氣味特征可分為9組，分別為：果香、花香、植物味、堅果香、焦糖味、土腥味、化學(xué)味、脂肪味、烘烤味[1]，對所有OAV>0.1的香氣物質(zhì)進(jìn)行分組，各組物質(zhì)OAV的總和表示葡萄酒中該類香氣的輪廓特征。

1.3.6 葡萄酒感官評價

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》。由經(jīng)過葡萄酒專業(yè)品評培訓(xùn)的10名工作者組成評定小組，對產(chǎn)品的外觀、香氣、滋味、典型性進(jìn)行綜合評分，其中，外觀滿分20分，香氣滿分30分，滋味滿分40分，典型性10分，總分100分。去掉1個最高分和1個最低分，然后取平均值即為產(chǎn)品感官品評得分。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有樣品均分別平行測定3次取平均值。實驗數(shù)據(jù)通過Excel 2019、SPSS 17.0、Origin 2018進(jìn)行匯總與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程分析

在葡萄酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵體系中的糖一部分轉(zhuǎn)化為酵母菌自身代謝所需的能量，另一部分轉(zhuǎn)化為酒精和CO2。通過監(jiān)測發(fā)酵過程中糖分、酒精和CO2排放量可驗證酵母發(fā)酵能力[12]。

由圖1可知，9組樣品在接種120 h后完成發(fā)酵。發(fā)酵反應(yīng)趨勢基本一致，但反應(yīng)速率存在一定差異。樣品A在反應(yīng)初期反應(yīng)速率逐步提高，在48～72 h時達(dá)到最大值。與之相比，I、IA1、IA2、IA3在24～48 h內(nèi)糖分下降最快，同時迅速生成乙醇和CO2，CO2生成速度在48～72 h達(dá)到最大值；H、HA1、HA2、HA3在0～24 h內(nèi)糖分下降最快，卻在24～72 h迅速生成酒精和CO2。與安琪釀酒酵母相比，東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母在發(fā)酵早期迅速生長繁殖，使得發(fā)酵過程提前啟動，但葡萄汁有孢漢遜酵母適應(yīng)期較長，需要消耗大量的還原糖提供代謝所需能量，東方伊薩酵母能夠更迅速地將還原糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2。

a-還原糖含量;b-每24 h樣品中還原糖含量的減少量;c-酒精度;d-每24 h樣品中酒精度的增加; e-CO2排放量;f-每24 h樣品中CO2排放量的增加量圖1 發(fā)酵過程曲線Fig.1 Fermentation process curve

2.2 香氣成分分析

葡萄酒香氣由品種香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣組成[13]。所使用的酵母類型和接種比例不同，使得葡萄酒產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物在組成和含量上產(chǎn)生很大差異[14-15]。

對赤霞珠葡萄汁(SC)組及實驗組樣品進(jìn)行香氣成分分析，結(jié)果詳見電子增強(qiáng)出版附表(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032629)，并結(jié)合圖2進(jìn)行分析。酒樣中共檢測出揮發(fā)性香氣成分117種，其中品種香氣成分9種，包括萜烯類4種、降異戊二烯衍生物類3種、揮發(fā)性酚類1種、C6化合物1種。發(fā)酵香氣成分中，含酯類 36種、高級醇18種、酸類8種、醛類8種、酮類8種、酚類和烯炔類4種、其它化合物24種。如圖2所示，酒樣中高級醇含量較為突出，其次是酯類和酸類，使得產(chǎn)品呈現(xiàn)復(fù)雜的香氣。在樣品A中檢出32種揮發(fā)性化合物，總含量為39.44 mg/L，IA3中檢出種類最多為55種，總含量為48.87 mg/L，IA1檢出48種，總含量為66.48 mg/L，為最高值，比A增加了40.67%。東方伊薩酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母參與發(fā)酵過程，使得樣品中揮發(fā)性香氣成分種類和含量得到不同程度的提高，并且非釀酒酵母比例越高，提高越顯著。

2.2.1 品種香氣成分組分比較

混合發(fā)酵體系的高糖苷酶活性有利于增加葡萄酒的品種香氣組分和香氣復(fù)雜度。其中，葡萄汁有孢漢遜酵母在發(fā)酵環(huán)境中具有最高的β-葡萄糖苷酶活性，促使糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)(如單萜烯、降異戊二烯和芳香族化合物)在糖苷酶作用下被釋放，具有了揮發(fā)性。由附表可知， HA1樣品中品種香氣成分為5種，含量為1.58 mg/L，證明了葡萄汁有孢漢遜酵母具有增加品種香的優(yōu)勢。IA3樣品中品種香氣成分種類達(dá)6種，含量為1.52 mg/L，僅次于HA1，說明東方伊薩酵母同樣具有增加品種香的性能。

2.2.2 酯類組分比較

酯類化合物是葡萄酒乙醇發(fā)酵的典型副產(chǎn)物，主要形成于發(fā)酵和陳釀過程，大多數(shù)酯類物質(zhì)具有鮮花或水果的香氣[16]。本研究中的發(fā)酵酒樣酯類成分最高為19種，相比釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵，非釀酒酵母參與發(fā)酵可顯著促進(jìn)酯類成分的復(fù)雜性[17]。發(fā)酵酒樣HA2中含量最多，為10.54 mg/L，比A樣品增加了30.77%，占其全部香氣成分的20.65%。證明葡萄汁有孢漢遜酵母可以顯著增加葡萄酒內(nèi)酯類物質(zhì)的含量。另外，根據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母參與發(fā)酵同樣能夠提高酯類的含量和種類。

酒樣中共有且含量較高的酯類成分是乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯。與樣品A相比，IA3的乙酸乙酯含量增加27.51%，IA2的辛酸乙酯含量增加34.93%，IA2的癸酸乙酯含量增加200.83%。在酒樣中還有乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯等共有的酯類。乙酸異戊酯具有較強(qiáng)的新鮮果香，可賦予葡萄酒香蕉、梨、蘋果的酸甜味。乙酸苯乙酯是一種特殊的芳香化合物，當(dāng)含量超過 0.25 mg/L 時，能夠給葡萄酒增添玫瑰等花香[16]。由附表可知葡萄汁有孢漢遜酵母能夠顯著增加葡萄酒中的乙酸異戊酯與乙酸苯乙酯的含量，與前人研究結(jié)果一致[18-19]。

2.2.3 高級醇組分比較

醇類物質(zhì)主要是酵母酒精發(fā)酵過程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物，是葡萄酒發(fā)酵香氣的重要成分。含量低于 300 mg/L 時，醇類能使葡萄酒的香氣更為復(fù)雜、濃郁；但當(dāng)其總含量超過 400 mg/L 時，就會給人帶來強(qiáng)烈的刺鼻味和不悅感[16]。由實驗結(jié)果可知，發(fā)酵酒樣醇類總含量為16.05～47.54 mg/L，低于300 mg/L，能夠賦予酒樣豐富的香味。樣品IA1中醇類種類與含量均為最高值，含量與A樣品相比增加了93.96%，占其全部香氣成分的71.51%。

在酒樣中共有的含量最為突出的醇類物質(zhì)為苯乙醇，含量達(dá)15.65～42.55 mg/L，是各酒樣中最為典型的醇類成分。苯乙醇賦予葡萄酒蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味，樣品A中苯乙醇含量為23.98 mg/L，低于大部分酒樣，說明混合發(fā)酵可促進(jìn)苯乙醇的生成。樣品IA1中含量為33.51 mg/L，僅次于樣品H，比樣品A增加了34.15%。

2.2.4 酸類組分比較

葡萄酒中的有機(jī)酸能夠保持酒體平衡和口感清爽特性，適宜的含酸量能使葡萄酒帶有新鮮的水果香，修飾葡萄酒的滋味和口感，并且有利于形成瓶貯酒香。酸類物質(zhì)主要來源于發(fā)酵副產(chǎn)物和葡萄漿果。發(fā)酵樣品中共檢測出8種酸類物質(zhì)，樣品IA1中含有7種，A中僅含4種。酸類物質(zhì)總含量為2.92～5.43 mg/L，IA1中含量最高，比樣品A增加了85.96%，占其全部香氣成分的8.17%。樣品中共有的酸類組分有己酸、辛酸、癸酸，HA1中己酸為0.66 mg/L，IA1中癸酸含量為1.28 mg/L，均為最高值。

為了更好地區(qū)別不同酒樣中揮發(fā)性香氣成分的差異，對所有OAV>0.1的36種揮發(fā)性香氣成分及9組酒樣進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示。前3個主成分分別占數(shù)據(jù)總體方差的35.9%、16.9%和13.9%，總貢獻(xiàn)率為66.7%。由于接種菌株及接種比例的不同，各試驗組有著不同的分布，葡萄汁樣品CS組位于PC1、PC2的正方向上，主要含有香葉基丙酮、3-丙酮、己二酸二異丁酯、β-紫羅蘭酮等香氣成分；樣品A主要位于PC1和PC2的正方向上，與H、HA1、HA2、HA3及IA3較為接近，酒樣中乙酸乙酯、丁酸乙酯、正辛醇、乙酸異戊酯等香氣成分含量豐富；IA1位于PC1和PC3的正方向和PC2的負(fù)方向上，與其它組別相距較遠(yuǎn)，正庚醇、異戊醇等香氣成分含量較為突出；I和IA2位于PC2和PC3的負(fù)方向上，癸酸乙酯、1-癸醇等含量較為豐富。由此可見，東方伊薩酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母與安琪酵母混合發(fā)酵，對發(fā)酵酒樣中香氣成分影響較大。

a-得分圖;b-載荷圖圖3 發(fā)酵結(jié)束后酒樣中OAV>0.1的香氣化合物主成分分析Fig.3 Principal component analysis for aroma compounds (OAV>0.1) in wines after alcoholic fermentation

對酒樣中OAV>0.1的物質(zhì)進(jìn)行香氣分組，選取∑OAV>0.5的7 種香氣類型繪制得到葡萄酒的香氣輪廓圖。如圖4所示，所有發(fā)酵酒樣的香氣均以果香和花香為主，其次為植物味、堅果香、焦糖味、化學(xué)味、脂肪味。相較于樣品A，IA1、IA2、HA2中果香和花香顯著提高[20]。這與混合發(fā)酵顯著提高了樣品中酯類、醇類等物質(zhì)含量有關(guān)。植物味、脂肪味及化學(xué)味在低濃度條件有利于提升香氣復(fù)雜度，所有處理無顯著差別。

a-樣品I、IA1、IA2、IA3和A;b-樣品H、HA1、HA2、HA3和A圖4 赤霞珠干紅葡萄酒感官香氣輪廓圖Fig.4 Sensory aroma profile of Cabernet Sauvignon dry red wine

2.3 感官品評結(jié)果

由感官品評結(jié)果可知，樣品IA1綜合評分最高，為89.5，該酒樣澄清度較好，呈新酒所具有的紫紅色；酒體香氣優(yōu)雅細(xì)膩，具有赤霞珠葡萄品種的香氣特性，具有濃郁的發(fā)酵香氣，但協(xié)調(diào)性略差，還需要在后續(xù)陳釀過程中增加陳釀香氣，形成更加協(xié)調(diào)豐富的香氣；酒體豐滿濃郁，平衡協(xié)調(diào)性較好，隨著陳釀過程的進(jìn)行，還需逐漸增加葡萄酒的質(zhì)感。與A樣品相比，其他樣品在香氣和滋味濃郁度、復(fù)雜性等均有所改善。

3 結(jié)論

東方伊薩酵母與安琪酵母混合發(fā)酵能夠更迅速地將還原糖轉(zhuǎn)化為乙醇和CO2，并顯著促進(jìn)揮發(fā)性香氣成分的形成。二者以3∶1的比例混合發(fā)酵時，揮發(fā)性香氣成分多達(dá)48種，含量比安琪酵母單獨(dú)發(fā)酵酒樣增加68.56%；其中品種香氣成分4種，發(fā)酵香氣成分酯類15種、高級醇10種、酸類7種，發(fā)酵香氣成分含量與安琪酵母單獨(dú)發(fā)酵酒樣相比分別增加了18.98%、93.96%和85.96%，占其全部香氣成分的14.43%、71.51%和8.17%；酒樣中苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等香氣成分的含量得到不同程度的增加，增強(qiáng)了葡萄酒中的花香和果香；經(jīng)感官評定，該樣品評分最高，為89.5。因此，可將東方伊薩酵母與安琪酵母以3∶1的比例混合發(fā)酵作為昌黎產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒理想的混菌發(fā)酵方案?；炀l(fā)酵可改善葡萄酒發(fā)酵過程，提高葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性，研究結(jié)果為生產(chǎn)昌黎產(chǎn)區(qū)獨(dú)特風(fēng)味的葡萄酒產(chǎn)品提供了參考。