慢性乙型肝炎治愈臨床研究進(jìn)展

文夏杰 魯鳳民 賈繼東

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是威脅公共健康的重要問題。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球HBV慢性感染者約2.57億，每年約80萬人死于HBV感染相關(guān)疾病[1]。目前臨床治療慢性乙型肝炎(CHB)的藥物主要包括核苷(酸)類似物(NAs)及干擾素類。前者的主要作用機(jī)制是通過競爭性與HBV DNA聚合酶結(jié)合，不可逆地終止其新鏈合成，從而抑制HBV的復(fù)制[1]。而后者的抗病毒機(jī)制既與直接影響HBV核衣殼的組裝及HBV RNA的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，也與激活細(xì)胞免疫有關(guān)。盡管這兩類藥物可有效抑制病毒復(fù)制，但均難以有效清除HBsAg從而實(shí)現(xiàn)臨床治愈。

HBV在復(fù)制過程可形成穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，和雙鏈線性DNA(dslDNA)。cccDNA結(jié)構(gòu)類似人類染色體，當(dāng)其處于轉(zhuǎn)錄靜默狀態(tài)時，難以被人類免疫系統(tǒng)識別，從而幫助感染細(xì)胞清除逃避。而dslDNA可以在感染早期以非同源重組的方式整合入人類基因組，并持續(xù)表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及C端截短型HBx蛋白，從而導(dǎo)致患者血清HBsAg難以被清除[3]。目前多種針對HBV 的新藥及用于評價抗病毒療效的新指標(biāo)正在研發(fā)及臨床試驗(yàn)中，在不久的將來有望實(shí)現(xiàn)抗病毒藥物的安全停藥，甚至CHB的臨床治愈。

一、 HBV新型生物標(biāo)志物

NAs可通過抑制前基因組RNA(pgRNA)逆轉(zhuǎn)錄從而使血清HBV DNA迅速下降，因此血清HBV DNA是評價抗病毒效果的重要指標(biāo)。但是，僅測定血清HBV DNA不能反映肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA及整合在人體基因組中的HBV DNA水平及復(fù)制活性。臨床上亟需反映cccDNA水平、轉(zhuǎn)錄活性及預(yù)測HBsAg清除的HBV新型生物標(biāo)志物。

(一)HBV RNA 血清中的HBV RNA主要轉(zhuǎn)錄自肝內(nèi)cccDNA， pgRNA存在于具有外包膜的病毒顆?；蚵愫艘職ぶ?。由于cccDNA是3.5 kb 長pgRNA的唯一來源，故后者的水平可在一定程度上反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的水平。有研究顯示，在未經(jīng)抗病毒治療的e抗原(HBeAg)陽性人群中，血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的相關(guān)性系數(shù)約為0.781，優(yōu)于血清HBcrAg、HBV DNA及HBsAg；經(jīng)過48周長效干擾素治療后發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換患者血清HBV RNA下降幅度更大[4]。但也有研究顯示，在未經(jīng)抗病毒治療的HBeAg陽性CHB患者中，血清HBV RNA水平與cccDNA的相關(guān)性(r=0.25,P=0.02)反而低于血清HBV DNA(r=0.36,P<0.01)[5]。在接受NAs治療的人群中，HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA絕對水平未見明顯相關(guān)性，但與HBV RNA和cccDNA比值呈正相關(guān)(r=0.584，P=0.001)，提示血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)[6]。

在接受恩替卡韋治療的患者中，停藥時血清HBV RNA>44.6 U/mL者的病毒學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險明顯高于血清HBV RNA陰性且HBsAg<10 IU/mL者(93.2% vs 9.1%)[7]。在接受PEG-INF-α治療的患者中，第12周時血清HBV RNA水平較低者實(shí)現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)的比例更高[8]。以上研究提示，血清HBV RNA單用或與其他指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用，能夠用于識別出可以安全停藥、甚至臨床治愈的人群。但是，目前尚缺乏經(jīng)國際認(rèn)證的HBV RNA標(biāo)準(zhǔn)品，而且對于定量引物的設(shè)計(jì)也存在差異，因此難以評價不同血清HBV RNA檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度及可比性[9]。

(二)乙型肝炎核心抗原相關(guān)抗原(HBcrAg) HBcrAg主要包含3種病毒蛋白：HBcAg、HBeAg和22 kD的前核心蛋白，三者間有著共同的149個氨基酸序列，并均源于前核心/核心基因(pre C/C)的轉(zhuǎn)錄、翻譯及近似的轉(zhuǎn)錄后修飾[10]。有研究顯示，在未經(jīng)抗病毒治療的CHB患者中，血清HBcrAg水平與肝內(nèi)cccDNA有顯著相關(guān)性(r=0.70，P<0.001)。由于NAs治療對病毒蛋白的產(chǎn)生無直接影響，因此血清HBcrAg水平仍可反映肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。在NAs治療1年后HBV DNA轉(zhuǎn)陰的人群中，仍有78%的患者HBcrAg陽性，此時血清HBcrAg水平與肝內(nèi)cccDNA水平的相關(guān)性系數(shù)為0.42(P<0.001)[11]。一項(xiàng)對34例停止拉米夫定治療的患者的研究顯示，停藥后出現(xiàn)HBV再激活者停藥時的HBcrAg水平高于無再激活者(4.9 vs 3.2 log10IU/mL，P=0.009)，HBcrAg預(yù)測HBV再激活的受試者工作曲線下面積為0.764[12]。但與HBV RNA類似，目前臨床缺乏靈敏度高、結(jié)果可比的血清HBcrAg檢測試劑盒。

(三)大/中/小HBsAg (L-HBsAg/M-HBsAg/S-HBsAg) HBV可表達(dá)3種HBsAg，其中大表面抗原蛋白(L-HBsAg)來源于2.4 kb mRNA，包括preS1、preS2及S蛋白；M-HBsAg/S-HBsAg 均來源于2.1 kb的mRNA，其中M-HBsAg包括preS2及S蛋白，而S-HBsAg僅包含S蛋白。L-HBsAg主要分布于Dane顆粒，其preS1是Dane 顆粒結(jié)合鈉-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)并在其介導(dǎo)下進(jìn)入肝細(xì)胞的重要結(jié)合位點(diǎn)。NAs治療后HBsAg陰轉(zhuǎn)的人群往往會有M-HBsAg/L-HBsAg比例的快速下降， M-HBsAg陰轉(zhuǎn)時間比總HBsAg轉(zhuǎn)陰提前約12.8 個月，提示L-HBsAg及M-HBsAg比例的變化可作為預(yù)測總體HBsAg清除的指標(biāo)[13]。目前有關(guān)L-HBsAg/M-HBsAg/S-HBsAg比例變化作為生物標(biāo)志物的相關(guān)研究仍然有限，其臨床意義仍需進(jìn)一步發(fā)掘與驗(yàn)證[14]。

二、抗HBV藥物的作用靶點(diǎn)及研究進(jìn)展

丙型肝炎治療的直接抗病毒藥物的成功，激發(fā)了學(xué)術(shù)界和制藥企業(yè)對CHB治愈方法的探索熱情。目前CHB治療的新藥主要包括針對HBV感染及復(fù)制的環(huán)節(jié)的直接抗病毒藥物及調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)劑。

(一)直接抗病毒治療藥物

1.進(jìn)入抑制劑： 病毒與肝細(xì)胞表面的受體結(jié)合并進(jìn)入其內(nèi)是HBV感染的第一步。具體機(jī)制是，L-HBsAg中的preS1區(qū)與人肝細(xì)胞膜上的?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽 (NTCP) 結(jié)合[15]。進(jìn)入抑制劑的作用方式主要分為4類:(1) 針對preS1區(qū)域的抗體，能夠識別并中和循環(huán)中的含有外包膜的完整病毒顆粒；(2) 結(jié)合肝細(xì)胞表面非特異HBV受體硫酸肝素糖蛋白的帶電荷藥物；(3)與肝細(xì)胞膜特異性HBV受體NTCP競爭性結(jié)合的底物，抑制preS1與NTCP的結(jié)合；(4) 不可逆性。

2.NTCP抑制劑：臨床研究顯示，接受不可逆性NTCP抑制劑bulevirtide (過去稱Myrcludex B)聯(lián)合PEG-IFN干擾素治療的HBV-HDV合并感染者中，有34%的患者血清HDV RNA低于檢測下限，優(yōu)于單用PEG-IFN治療組，目前bulevirtide 作為丁型肝炎治療藥物已經(jīng)在歐盟上市[16]。但是，本藥用于治療CHB的研究仍處于Ⅱb期。其他的進(jìn)入抑制劑，如單克隆抗體HH-003及HH-006分別處于Ⅱ期及Ⅰ期，hzVSF(IgG4)處于Ⅱ期，A232處于臨床前期。

3.轉(zhuǎn)錄后抑制： 靶向HBV mRNA的藥物可以直接抑制病毒蛋白的產(chǎn)生，從而抑制其復(fù)制和感染性病毒顆粒及亞病毒顆粒的釋放。此類藥物主要包括小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)和反義寡核苷酸(ASO)。

siRNA與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的短RNA片段結(jié)合，誘導(dǎo)HBV mRNA發(fā)生降解從而導(dǎo)致病毒基因沉默。在3.2 kb的HBV基因組中多種蛋白編碼序列相互重疊，針對不同區(qū)域設(shè)計(jì)siRNA對病毒蛋白的抑制效果也有所不同。如HBV所有的5個轉(zhuǎn)錄本均包含有“HBx”蛋白區(qū)域的核酸序列，因此針對這個區(qū)域的siRNA可靶向所有病毒轉(zhuǎn)錄本[17]。雖然siRNA能夠高效沉默病毒基因，但需要靜脈內(nèi)給藥、具有脫靶風(fēng)險、載體毒性不明，且有模式識別受體激活免疫的風(fēng)險。為了進(jìn)一步降低可能的脫靶效應(yīng)，將siRNA與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶聯(lián)進(jìn)而被肝細(xì)胞特異性攝取。JNJ-3989為膽固醇GalNAc偶聯(lián)的能夠靶向肝細(xì)胞的針對“HBx”區(qū)域siRNA類藥物，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過與 TDF 或 ETV聯(lián)合治療，在30%的患者 HBsAg 降低大于2 log10IU/mL，并且 HBV RNA、HBeAg 和 HBcrAg也出現(xiàn)持續(xù)降低趨勢。

ASO 與 HBV mRNA 的互補(bǔ)序列結(jié)合并形成雜交，可使靶標(biāo) RNA通過宿主RNase-H 依賴性途徑被降解。GSK3228836 是目前正在進(jìn)行Ⅱb期臨床試驗(yàn)的ASO類藥物，前期小樣本研究顯示，接受GSK3228836治療的初治和經(jīng)治CHB患者 HBsAg 水平能夠降低約3 log10IU/mL[18]?，F(xiàn)有研究顯示，血清HBsAg定量≤100 IU/mL的NAs經(jīng)治患者停藥后的復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著下降且停藥后發(fā)生HBsAg自發(fā)陰轉(zhuǎn)的幾率顯著增加[19]。有一些基于RNA干擾的抗HBV新藥臨床試驗(yàn)觀察到部分患者的血清HBsAg水平顯著下降等積極效果，但其臨床意義仍有待進(jìn)一步的觀察研究。

4.核衣殼抑制劑： HBV病毒核衣殼包含有病毒核心蛋白，后者參與病毒生命周期的多個過程，包括病毒入胞后向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)及釋放rcDNA、調(diào)節(jié)cccDNA穩(wěn)定性、形成核衣殼為逆轉(zhuǎn)錄合成子代病毒負(fù)鏈DNA提供密閉場所及完成子代病毒顆粒組裝。目前正在開發(fā)的核心蛋白組裝抑制劑主要包括苯丙烯酰胺類和雜芳基二氫嘧啶衍生物。其作用機(jī)制為通過加強(qiáng)蛋白質(zhì)相互作用，抑制pgRNA被組裝進(jìn)衣殼，同時阻斷了rcDNA的生成。目前已有多種核衣殼抑制劑進(jìn)入了早期臨床試驗(yàn)階段。其中莫非塞定(GLS4)是正在進(jìn)行Ⅲa期臨床試驗(yàn)的核衣殼抑制劑。在2020年歐洲肝病年會上公布的部分Ⅱb期研究數(shù)據(jù)對77例接受12周以上治療患者資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示與基線相比，在接受GLS4聯(lián)合ETV組與單純ETV組患者中，HBV DNA分別平均下降5.02 log10IU/ mL及3.84 log10IU/ mL，pgRNA分別下降2.63 log10IU/ mL和0.27 log10IU/mL，其中聯(lián)合用藥組有28.6%的患者出現(xiàn)HBsAg下降≥0.5 log10IU/ mL。

5.HBsAg釋放抑制劑： HBsAg可嵌入脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的感染性病毒顆粒的外包膜，在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用。HBsAg還可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基或多囊泡小體以亞病毒顆粒大量釋放到肝細(xì)胞外，從而造成抑制性免疫環(huán)境[20]。目前研發(fā)中的HBsAg釋放抑制劑主要包括基于DNA的核酸聚合物(NAP)或基于RNA的NAP， 其作用機(jī)制是通過與宿主因素相互作用，從而阻斷亞HBV顆粒的組裝和分泌。目前小型臨床試驗(yàn)表明，NAP類藥物REP-2139、REP-2165及REP-2055可以降低HBsAg向胞外釋放。有關(guān)REP-2139 或 REP-2165與TDF和PEG-ING-α聯(lián)合用藥的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，在完成TDF+PEG-INF-α+NAP方案后，60% (24/40) 的 HBeAg陰性CHB患者可達(dá)到HBsAg≤0.05 IU/mL，在48周時有13例患者實(shí)現(xiàn)了 HBsAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換[21]。目前本藥的臨床試驗(yàn)結(jié)果良好，但是否可以通過與其他抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)CHB臨床治愈仍然需要進(jìn)一步臨床研究。

(二)基于免疫調(diào)節(jié)抗病毒藥物 天然免疫及獲得性免疫對于控制HBV感染及清除HBsAg至關(guān)重要。CHB患者循環(huán)中及肝臟微環(huán)境中高水平的HBeAg及HBsAg，能夠抑制HBV 特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，導(dǎo)致肝臟免疫微環(huán)境通常處于抑制狀態(tài)[20]，這可能是HBV感染慢性化的重要機(jī)制。因此，恢復(fù)受損的HBV特異性免疫應(yīng)答是實(shí)現(xiàn)臨床治愈CHB的重要途徑。

(三)天然免疫系統(tǒng)激活劑 TLR7和TLR8是由多種免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞、NK 細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞)表達(dá)的單鏈 RNA 分子識別受體，視黃醇(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白I(RIG-I)是識別雙鏈 RNA 的傳感器。TLR與RIG-I的激活能夠誘導(dǎo) IFN 和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用。目前正在研發(fā)中的TLR激動劑包括GS-9620、GS-9688、RG-7854、RO-7020531等。其中GS-9620及GS-9688在HBV感染黑猩猩模型中顯示出良好的抗病毒作用；但前者在人類中未發(fā)現(xiàn)明顯抗病毒治療效果，后者對HBeAg陽性CHB患者安全性評價中亦未觀察到明顯的 HBsAg 或 HBV DNA 下降，是否與用藥時間較短、樣本量較少有關(guān)尚不清楚。目前GS-9688仍在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，其治療效果尚待更多的數(shù)據(jù)驗(yàn)證[22]。

三、治療性疫苗

與預(yù)防性乙型肝炎疫苗作用不同，治療性疫苗主要是通過修復(fù)T細(xì)胞功能，激發(fā)新的免疫應(yīng)答，進(jìn)而持續(xù)抑制HBV復(fù)制，從而達(dá)到HBsAg清除的效果。目前治療性乙型肝炎疫苗主要包括：(1)蛋白疫苗，主要包括針對PreS1、PreS2、S蛋白、HBcAg蛋白等多蛋白或其抗原表位的疫苗；(2)核酸疫苗，通過病毒載體將HBV基因序列導(dǎo)入肝細(xì)胞進(jìn)而達(dá)相關(guān)病毒抗原，激活CD8及CD4 T細(xì)胞從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。

GS-4774是來自可表達(dá) HBsAg、HBcAg和HBx 抗原成分的治療性乙型肝炎疫苗[23]，可以在健康志愿者中誘導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答。但是在經(jīng)NAs治療達(dá)到病毒抑制的以及未經(jīng)NAs治療CHB患者中，沒有觀察到HBsAg下降和消失[24]。核酸疫苗能夠在動物體內(nèi)產(chǎn)生針對HBV的抗體，但核酸疫苗攜帶的病毒核酸是否會與人類基因組發(fā)生整合，從而導(dǎo)致整合位點(diǎn)相關(guān)基因功能的改變，仍然是需要關(guān)注的問題。目前對治療性疫苗的注冊臨床試驗(yàn)較多、進(jìn)展較快的CVI-HBV-002也僅處于Ⅱb期，具體研究結(jié)果尚待公布。

四、總結(jié)及展望

由于cccDNA及HBV DNA整合的存在，CHB的臨床治愈仍然充滿挑戰(zhàn)。多種新型HBV生物標(biāo)志物及新藥的研發(fā)，為CHB安全停藥及臨床治愈提供了新的希望。針對HBV生命周期不同階段的直接抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物的臨床試驗(yàn)結(jié)果值得期待。