大黃魚分子育種相關(guān)技術(shù)研究進(jìn)展

彭士明，王亞冰，王 倩，高權(quán)新，鄭漢豐，許 建，王魯民

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141）

大黃魚是我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類，為了推進(jìn)大黃魚產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，我國諸多學(xué)者陸續(xù)開展了大黃魚的良種選育研究，并取得了良好的進(jìn)展［1］。大黃魚優(yōu)良品種＂閩優(yōu)1號＂、“東海1號”和“甬岱1號”相繼問世，有力推動了我國大黃魚“育-繁-推”一體化產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)。雖然通過群體選育、家系選育可以選育出具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的品種，但是傳統(tǒng)的育種技術(shù)也存在周期長、效率低、預(yù)見性差等缺陷，極大限制了大黃魚種業(yè)發(fā)展的步伐。

早在20世紀(jì)60年代，就有專家提出了基于分子標(biāo)記開展選育的設(shè)想，然而這種當(dāng)時(shí)超前的觀點(diǎn)卻并沒有得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注［2］。到了20世紀(jì)90年代，DNA分子標(biāo)記的價(jià)值逐漸被重視和挖掘，并且經(jīng)過幾十年的飛速發(fā)展，分子輔助育種技術(shù)逐漸成為引導(dǎo)全球魚類育種革新的焦點(diǎn)。早期應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記主要包括限制性酶切片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記等等。SSR和SNP標(biāo)記因其具有多態(tài)性高、易于檢測、遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為全球分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域的主體技術(shù)。進(jìn)入21世紀(jì)后，SSR和SNP標(biāo)記開始用于大黃魚的遺傳改良研究［3-6］。

1 大黃魚分子育種相關(guān)技術(shù)概述

隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展和低成本運(yùn)營模式的推動，大黃魚分子輔助育種發(fā)展迅速。新型的基因分型和分析技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在大黃魚育種研究中得以廣泛應(yīng)用。采用全基因組重測序（whole genome resequencing，WGR）和簡化基因組測序（restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-Seq）技術(shù)可以挖掘出大量的SNP信息，這為SNP分型奠定了基礎(chǔ)。然后，基于基因型數(shù)據(jù)可以構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，并用于數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）。目前，已經(jīng)確定了一系列與大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，包括生長特性、抗病能力、性腺發(fā)育和抗逆性狀等?；谶@些SNP，分子標(biāo)記輔助育種（marker-assisted selection，MAS）和全基因組選擇技術(shù)（genomic selection，GS）已被用于大黃魚育種。伴隨著大黃魚基因組的破譯，得以在全基因組的水平上對目標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，提高了人工選育的效能，加速了大黃魚育種的進(jìn)程［7-9］。我國現(xiàn)已開發(fā)了大量SNP標(biāo)記，同時(shí)對重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了QTL定位和GWAS分析，這為大黃魚品質(zhì)改良和抗病抗逆育種提供了重要的數(shù)據(jù)支撐［10-12］。

2 大黃魚分子育種相關(guān)技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 RAD-Seq測序技術(shù)

RAD-Seq技術(shù)于2007年問世，該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶將基因組進(jìn)行酶切，并利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行序列檢測。因?yàn)镽AD-Seq技術(shù)不需要全基因組，因此該方法適用于所有的水產(chǎn)動物。RAD-Seq技術(shù)成本低，因此已成為基因分型和SNP標(biāo)記選育的常見技術(shù)［13］。但該技術(shù)的主要缺陷是可能檢測不到與目標(biāo)性狀相關(guān)的等位基因，因?yàn)檫@種方法的測序范圍僅限于與限制酶位點(diǎn)相關(guān)的序列，這就導(dǎo)致基因組的很多區(qū)域不能檢測［14］。LIU等［15］采用RAD-Seq技術(shù)在5個(gè)養(yǎng)殖及野生群體的120尾大黃魚中發(fā)現(xiàn)了7 161個(gè)SNP標(biāo)記，并指出在中國沿海水域的野生種群中，大黃魚存在兩個(gè)遺傳譜系。ZHOU等［16］采用RAD-Seq技術(shù)分析了與大黃魚生長性狀相關(guān)的遺傳信息，并結(jié)合GWAS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與體型顯著相關(guān)的SNP和候選基因（bmp7、col1a1、col11a2和col18a1），這為開展大黃魚的分子標(biāo)記輔助選育提供了較為可靠的遺傳標(biāo)記。

2.2 遺傳連鎖圖譜與QTL定位

遺傳圖譜是以基因連鎖、重組交換值構(gòu)建的圖譜，顯示與性狀關(guān)聯(lián)遺傳標(biāo)記的相對位置。待測物種的遺傳背景必須是已知的，這是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的前提條件。迄今為止，已經(jīng)構(gòu)建了40多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的高密度遺傳連鎖圖譜，其中大多數(shù)水產(chǎn)動物的高密度連鎖圖譜是基于SNP或SSR 標(biāo)記完成的［17］。早在2007年，NING等［18］就構(gòu)建了首個(gè)大黃魚遺傳連鎖圖譜。近十年來，我國有關(guān)大黃魚連鎖圖譜的研究逐漸增多，并為大黃魚的分子育種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。YE等［19］基于大黃魚的兩個(gè)半同胞家系構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)了289個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（93個(gè)EST-SSRs），共整合為24個(gè)連鎖群，并在5個(gè)連鎖群上檢測到了7個(gè)QTL位點(diǎn)；AO等［20］構(gòu)建了大黃魚的遺傳連鎖圖譜，總長度為5 451.3 cM，位點(diǎn)之間的平均距離為0.54 cM；KONG等［21］對大黃魚的抗刺激隱核蟲性狀進(jìn)行了QTL定位，并發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與抗病性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)和候選基因（ifnar1、ifngr2、ikbke和CD112）；ZHAO等［22］亦對大黃魚抗刺激隱核蟲性狀進(jìn)行了GWAS分析，在2個(gè)種群中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)QTL和2個(gè)候選基因（casp8和traf6），上述研究為大黃魚的生長和抗病性狀的遺傳標(biāo)記選育提供了有效的序列信息。高密度遺傳連鎖圖譜為大黃魚精準(zhǔn)定位、基因編輯和全基因組選擇育種提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

經(jīng)濟(jì)性狀多為數(shù)量性狀且受多基因控制，傳統(tǒng)的育種方法難以做到準(zhǔn)確選擇，因此構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜并進(jìn)行QTL定位，可以開發(fā)出有效控制經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳標(biāo)記。一個(gè)數(shù)量性狀的表型大多受多個(gè)基因的控制，而QTL定位的目的是確定導(dǎo)致該數(shù)量性狀變異的相應(yīng)基因位點(diǎn)。迄今為止，國內(nèi)外已對近百種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物進(jìn)行了QTL定位，其中包括魚類、軟體動物、甲殼動物和棘皮動物，主要性狀涉及生長、抗病能力、脅迫響應(yīng)、形態(tài)性狀、耐溫性、肉質(zhì)和性別決定等［17，23-26］。分子標(biāo)記在構(gòu)建大黃魚遺傳圖譜方面的應(yīng)用起步較晚，這在一定程度上制約了大黃魚分子育種的發(fā)展。

2.3 GWAS分析

GWAS是在全基因組水平上開展大規(guī)模、多樣本、反復(fù)驗(yàn)證的基因序列與目的性狀的關(guān)聯(lián)性分析技術(shù)，進(jìn)而尋找與目的性狀相關(guān)遺傳因素的研究方法，以確定與性狀相關(guān)的遺傳基因。GWAS可用于分析數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀，包括識別新的變異性狀，檢測單基因和多基因控制的性狀信息［27］。隨著全基因組測序成本的降低，目前GWAS技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用逐漸增多，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良。涉及的主要性狀有尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的性腺分化、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的肌肉產(chǎn)量［28］、凡納濱對蝦（Litopeneaus vannamei）的生長性狀［29］、扇貝（Patinopecten yessoensis）的殼色［30］和虹鱒的抗病性狀等［31］。

XIAO等［32］采用高通量全基因組測序技術(shù)完成了世界上首個(gè)大黃魚全基因組物理圖譜，并將大黃魚的全基因組圖譜組裝成686張圖譜，總長度為727 Mb，N50長度（126張圖譜）達(dá)到1.7 Mb，這為深入研究大黃魚生長、抗病、耐寒等性狀的遺傳機(jī)制和性狀改良育種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，國內(nèi)的諸多學(xué)者已經(jīng)運(yùn)用GWAS分析獲得了與大黃魚生長性狀、抗病性狀、性腺發(fā)育、肌肉品質(zhì)、性別指數(shù)性狀和耐高溫性狀等關(guān)聯(lián)的SNP多態(tài)位點(diǎn)、候選基因及QTL信息［22，33-43］，這為后續(xù)開展大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良提供了重要的分子工具。通過大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀基因位點(diǎn)或者等位基因的聚合和選育，可以全面提高養(yǎng)殖大黃魚生產(chǎn)性能，促進(jìn)大黃魚增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

2.4 全基因組重測序和分析

WGR技術(shù)可以對不同個(gè)體進(jìn)行全基因組測序，全面解讀基因組上的變異信息，從而計(jì)算該變異信息與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性。隨著WGR價(jià)格不斷降低，其應(yīng)用也逐漸增多。但由于WGR的計(jì)算數(shù)據(jù)量非常大，所以對這些數(shù)據(jù)集的分析需要花費(fèi)大量的時(shí)間，而且此類分析也需要較大的計(jì)算資源和存儲空間。全基因組低深度重測序（low-coverage whole-genome sequencing，LcWGS）可以減少測序數(shù)據(jù)量并降低測序成本，通過基因型填充得到高密度SNP，并為基因組育種值（genomic estimated breeding values，GEBV）和GS提供幫助。ZHANG等［44］發(fā)現(xiàn)，對大黃魚分別進(jìn)行0.5x與8x的重測序，兩者的精度相似，因此認(rèn)為LcWGS適用于大黃魚的GS。

近年來，隨著許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的全基因組被陸續(xù)破解，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，WGR被廣泛用于檢測目的性狀的遺傳信息、環(huán)境適應(yīng)機(jī)理以及選育效果驗(yàn)證，包括瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii）的適應(yīng)性遺傳分化［45］、鯉（Cyprinus carpio）的遺傳多樣性［46］、南方鲇（Silurus meridionalis）的性別連鎖分子標(biāo)記開發(fā)［47］、大西洋鮭（Salmo salar）的雄性發(fā)育、大菱鲆（Scophthalmus maximus）的抗病特性［48］以及點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）耐氨氮能力［49］等等。KON等［50］使用WGR技術(shù)對來自寧德和舟山的大黃魚進(jìn)行了遺傳種群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)了不同水域大黃魚存在的遺傳差異基因位點(diǎn)，并揭示了適應(yīng)性馴化養(yǎng)殖所造成的遺傳特征。WAN 等［38］針對大黃魚變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的內(nèi)臟白點(diǎn)病開展了抗病性狀的WGR分析，基于254 110個(gè)SNPs信息在3、5和20號染色體上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與抗病相關(guān)的候選區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)了抗病性狀的候選基因（IL10、THBS1、IGSF21、IGR、IGH、IRF8、TRAIL、CC、TNF和LINGO1）。

2.5 SNP芯片開發(fā)與應(yīng)用

SNP芯片技術(shù)是開展大批量SNP基因分型的有效方法。與必須進(jìn)行復(fù)雜文庫制備和密集生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)處理的高通量測序技術(shù)相比，SNP芯片技術(shù)的操作流程和統(tǒng)計(jì)分析要簡單得多。且大批量的測序無可避免的可能導(dǎo)致誤差的產(chǎn)生，但是SNP芯片技術(shù)不存在這種問題，而且其可重復(fù)性較好。然而，SNP芯片也存在較大的缺陷，比如標(biāo)記信息往往不全。由于SNP芯片標(biāo)記主要是基于已測序品種的基因組序列開發(fā)的，而在育種過程中常常會引入外地品種、野生品種甚至近緣種群的優(yōu)異基因組片段，因此現(xiàn)有育種芯片可能無法識別不同遺傳資源中的特有變異序列，這也限制了外源片段的導(dǎo)入和識別。

SNP芯片分型技術(shù)更適用于具有完整基因組數(shù)據(jù)以及分子育種相對成功的物種，而測序技術(shù)更適用于新的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種或處于育種初始階段的品種。因此，未來進(jìn)行基因分型的技術(shù)可能是將測序技術(shù)和SNP芯片技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，其技術(shù)成功的關(guān)鍵取決于物種遺傳標(biāo)記的有效性。ZHOU等［51］使用SNP芯片（NingXin-I）對5個(gè)種群96尾大黃魚進(jìn)行了效果評估，發(fā)現(xiàn)83.38% SNP具有多態(tài)位點(diǎn)，并確定了跨種群SNP的有效性為26.68%～56.23%。

2.6 全基因組選擇技術(shù)

雖然在確定了主效QTL位點(diǎn)后，MAS可用于性狀的強(qiáng)化選育，然而對于復(fù)雜的數(shù)量性狀，分子標(biāo)記的效果卻十分有限，而GS可以作為一個(gè)更好的替代技術(shù)［52］。GS可以對物種全基因組位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)進(jìn)行全面估計(jì)，并使用多種分析方法生成一個(gè)方程來預(yù)測GEBV，最后將GEBV與實(shí)際表型值進(jìn)行比較，使用具有基因型和表型數(shù)據(jù)的驗(yàn)證群體來評估預(yù)測方程的準(zhǔn)確性。LIU等［53］對3 000多個(gè)群體進(jìn)行生長性狀的遺傳力分析，準(zhǔn)確率為80%。預(yù)測精度還取決于識別出的SNP的數(shù)量，也就是SNP密度越高越好，QTLs位點(diǎn)至少有一個(gè)SNP，這樣SNP效應(yīng)的估計(jì)就可以捕捉更多的遺傳變異信息。QIU等［54］基于SNP標(biāo)記的方法估計(jì)了9個(gè)數(shù)量性狀的遺傳參數(shù)，發(fā)現(xiàn)SNP數(shù)量降低時(shí)遺傳力的估計(jì)值通常也會降低，體長、體高、體寬和內(nèi)臟重之間存在較高的表型和遺傳相關(guān)性。DONG等［55］評估了大黃魚體質(zhì)量、體長和肉質(zhì)（n-3HUFA）的遺傳力值，比較了不同計(jì)算模型的預(yù)測準(zhǔn)確度，評估GS所需要的SNP的有效性，并著重指出將GS用于生長和肉質(zhì)性狀選育是完全可行的。董林松等［56］開發(fā)了基因組預(yù)測方法的兩種新的計(jì)算策略和一種新的FBayesC預(yù)測方法，并將這些基因組預(yù)測方法用于大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良研究，同時(shí)使用單標(biāo)記分析和貝葉斯模型對大黃魚的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行GWAS比較研究，研究成果不僅提供了節(jié)省基因組育種費(fèi)用的方法，而且有助于推動大黃魚基因組選擇育種的進(jìn)程。

2.7 基因編輯技術(shù)

如果可以確定控制性狀的種內(nèi)或種間變異的等位基因，那么運(yùn)用CRISPR／Cas9系統(tǒng)編輯對性狀不利或有利的等位基因，可以達(dá)到優(yōu)化性狀的目的。CRISPR／Cas9技術(shù)已經(jīng)在很多魚類中獲得了成功，包括鮭科魚類（大西洋鮭和虹鱒）、鯉科魚類（Labeo rohita，Ctenopharyngodon idella和Cyprinus carpio）、鯰科魚類（Ictalurus punctatus等）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、尼羅羅非魚和金頭鯛（Sparus aurata）等［57-62］。

迄今為止，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物基因編輯的主要目標(biāo)性狀包括不育化、生長性狀和抗病能力等?；蚓庉嬙谒a(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，主要原因是魚類易于獲得成千上萬的體外受精胚胎，并且這些胚胎足夠大，便于手動顯微注射。使用大規(guī)模家系選育可以在一定程度上控制背景遺傳效應(yīng)，并且可以獲得足夠的樣本量，以便將基因編輯與非編輯個(gè)體進(jìn)行比較。目前尚未有CRISPR／Cas9技術(shù)在大黃魚分子育種方面的相關(guān)報(bào)道，但是隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR／Cas9技術(shù)應(yīng)用于大黃魚的良種選育也是可以期待的。另外，多基因性狀對于基因編輯技術(shù)而言是一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，因?yàn)樾枰瑫r(shí)編輯關(guān)聯(lián)同一性狀的多個(gè)等位基因才能達(dá)到優(yōu)化性狀的目的，因此需要開發(fā)和改進(jìn)多重基因組編輯方法。

3 展望

當(dāng)今世界，高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本也急劇下降，基因組組裝技術(shù)也更加精準(zhǔn)，大黃魚大量候選基因和遺傳位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，為開展大黃魚分子育種提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。一些分子育種技術(shù)已經(jīng)用于大黃魚的良種選育，并取得了顯著成效［63-64］?，F(xiàn)代基因測序技術(shù)的發(fā)展推動了育種技術(shù)的革新，大黃魚育種技術(shù)必然隨著遺傳學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展而不斷進(jìn)步。我國大黃魚分子育種起步較晚，研究基礎(chǔ)較為薄弱，但是我國大黃魚種質(zhì)資源豐富，市場需求量巨大，得天獨(dú)厚的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)是推動大黃魚分子育種發(fā)展的有利條件，具有廣闊的發(fā)展前景。徐鵬等［65］先后開發(fā)了大黃魚育種芯片“寧芯1號”和＂寧芯2號＂。大黃魚分子育種技術(shù)的不斷成熟和突破，將引發(fā)傳統(tǒng)育種方式的重大變革。

種業(yè)是水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的命脈和根基，是國家“十四五”乃至今后相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的核心攻關(guān)任務(wù)。當(dāng)前，大黃魚種業(yè)創(chuàng)新研發(fā)面臨前所未有的大好形勢。盡管目前我國在大黃魚遺傳育種領(lǐng)域已取得了一些重要進(jìn)展，但在前沿育種技術(shù)領(lǐng)域仍存局限性，很多熱點(diǎn)領(lǐng)域與技術(shù)有待發(fā)展和突破。首先，大黃魚的基因編輯制種仍處于探索起步階段?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的主效基因，后續(xù)可以利用基因編輯技術(shù)對目的基因進(jìn)行精準(zhǔn)功能解析，并開展種質(zhì)創(chuàng)制，從而達(dá)到優(yōu)化性狀的目的。第二，全基因組選擇技術(shù)是一種基于全基因組范圍的分子標(biāo)記進(jìn)行育種值計(jì)算和選擇的高效育種方法，可大幅推廣應(yīng)用，并結(jié)合當(dāng)今熱點(diǎn)組學(xué)技術(shù)、人工智能設(shè)計(jì)育種方案，構(gòu)建復(fù)雜性狀的精準(zhǔn)控制理論體系，驅(qū)動大黃魚育種加速向精準(zhǔn)化、高效化和智能化發(fā)展，從而為大黃魚種業(yè)科技創(chuàng)新帶來新的生機(jī)與活力。第三，腸道菌群作為新興研究領(lǐng)域，對于大黃魚的健康發(fā)育至關(guān)重要，并且與宿主基因和經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)，今后可以構(gòu)建“經(jīng)濟(jì)性狀-腸道菌群-遺傳基因”的一體化模型，為大黃魚的種業(yè)創(chuàng)新提供新的理論視角與技術(shù)支持。