不同產(chǎn)地杜仲雄花指紋圖譜的建立及其化學模式識別研究

張 智，龍 華，曾 羅，李 韜，李 鸝

不同產(chǎn)地杜仲雄花指紋圖譜的建立及其化學模式識別研究

張 智，龍 華，曾 羅，李 韜，李 鸝*

吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000

建立4個產(chǎn)地21批杜仲雄花的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為杜仲雄花的質(zhì)量控制提供參考。采用HPLC法，色譜柱為Agilent HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；程序變化波長；進樣量20 μL。通過相似度評價、偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）以及氣候因子相關(guān)性分析等對杜仲雄花指紋圖譜進行分析評價。建立4個產(chǎn)地杜仲雄花HPLC指紋圖譜，共標定15個共有峰，指認出其中6個色譜峰，分別為桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、蘆丁、槲皮素；21批杜仲雄花指紋圖譜與對照圖譜的相似度為0.911～0.989；PLS-DA分析表明不同產(chǎn)地杜仲雄花樣品具有一定差異，根據(jù)變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）篩選出7個差異性成分；差異性成分峰面積結(jié)合氣候因子的相關(guān)性分析結(jié)果顯示9號峰峰面積與3、4月平均最低氣溫呈顯著正相關(guān)，15號峰槲皮素峰面積與3月平均降水天數(shù)呈顯著負相關(guān)，其余差異性成分與氣候因子未呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。該方法可應用于杜仲雄花的質(zhì)量評價，為杜仲雄花質(zhì)量控制與資源開發(fā)提供參考。

杜仲雄花；指紋圖譜；高效液相色譜法；偏最小二乘法分析；聚類分析；桃葉珊瑚苷；京尼平苷酸；綠原酸；京尼平苷；蘆丁；槲皮素

杜仲Oliv.為我國特有單科單屬單種植物，落葉喬木且雌雄異株[1]。杜仲傳統(tǒng)以樹皮入藥，在我國已有2000多年藥用歷史，其樹皮和葉為《中國藥典》2020年版收載[2]。由于其良好的藥理作用與經(jīng)濟價值，在我國被廣泛栽種，主要產(chǎn)地有湖南、陜西、四川、貴州、河南等[3]。杜仲雌雄異株，雄花簇生于當年生枝條基部，早春開花，單株花期較短，僅1周左右，產(chǎn)量高，易采集[1,4]。杜仲雄花中含有與杜仲皮、葉類似的環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酚酸類等成分，具有良好的抗炎抑菌、抗氧化、降血壓、降血糖等藥理作用，同時還含有豐富的營養(yǎng)成分[5-8]。2014年杜仲雄花被國家衛(wèi)生計生委批準為新食品原料[9]，已開發(fā)出杜仲雄花茶、杜仲雄花酒、保健品、功能飲料等，利用前景廣闊。不同產(chǎn)地因其溫度、濕度、海拔、土壤等生態(tài)因子的不同，影響著有效成分含量高低，進而導致不同產(chǎn)地的植物原料具有功效不同[10-11]。由于杜仲的廣泛種植，不同產(chǎn)地的植物化學成分含量未知且不同產(chǎn)地之間含量差異大，加上缺乏切實可行的質(zhì)量評價標準，因此有必要尋找和探究導致次生代謝組分出現(xiàn)差異的原因及其主要變量，實現(xiàn)杜仲雄花質(zhì)量評價和控制。

指紋圖譜技術(shù)能夠體現(xiàn)有效成分的整體性、穩(wěn)定性，以及不同產(chǎn)地間的共有性圖譜片段，被認為是控制天然藥材質(zhì)量的有效手段之一[12-13]，但指紋圖譜提供的信息量過大，不利于統(tǒng)計分析。近年來，模式識別技術(shù)作為化學計量學的重要組成部分，已成為提取復雜中藥化學指紋圖譜特征的重要數(shù)學方法，具有較好的預測精度和廣泛的適用性[14]。2者的結(jié)合能夠快速篩選出主要的差異性成分，達到區(qū)分不同產(chǎn)地、不同質(zhì)量樣品的目的[15-16]。已有杜仲指紋圖譜的研究以杜仲皮、葉為主，杜仲雄花指紋圖譜研究側(cè)重于對不同花期進行評價，并探討了杜仲雄花次生代謝成分積累規(guī)律[17]。本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法對杜仲4個主要產(chǎn)地的21批杜仲雄花建立指紋圖譜，結(jié)合化學模式識別評價整體質(zhì)量、篩選不同產(chǎn)地的差異性成分，并與各產(chǎn)地氣候因子進行相關(guān)性分析，以探討不同產(chǎn)地差異性成分的積累規(guī)律，了解杜仲雄花質(zhì)量與產(chǎn)地的關(guān)系，為今后杜仲栽培基地的選擇、雄花質(zhì)量控制的完善提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260-II型高效液相色譜儀，配備G7155A DAD檢測器、G7111A四元泵、G7129A自動進樣器（美國安捷倫科技有限公司）；BPX-52型電熱恒溫干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PX84ZH型電子天平（美國奧豪斯儀器公司）。

1.2 主要試劑與材料

對照品綠原酸（批號100081-201610）、京尼平苷（批號110749-201919）、槲皮素（批號100081-201610）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品蘆丁（批號B20771）、京尼平（批號B20635）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品桃葉珊瑚苷（批號479-98-1）、京尼平苷酸（批號27741-01-1）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，以上對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%。乙腈、甲醇（HPLC級，瑞典歐普森色譜純試劑公司）；甲酸（HPLC級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；純凈水。

不同產(chǎn)地21批杜仲雄花樣品，于2021年4月分別采集自四川省資陽市樂至縣、貴州省遵義市紅花崗區(qū)、湖南省張家界市慈利縣、陜西省漢中市略陽縣4個省區(qū)。選擇花期處于盛花前期長勢良好的杜仲雄株（樹齡為25年以上），每株樣品分別采集上、中、下3部分杜仲雄花枝條，以內(nèi)置冰袋的泡沫保溫箱及時帶回實驗室處理。去雜質(zhì)，60 ℃烘干至恒重，粉碎，過80目篩，存于自封袋中避光干燥處保存，備用。樣品經(jīng)吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院李鸝教授鑒定為杜仲科植物杜仲Oliv.的雄花，樣品來源信息見表1。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件：0～15 min，5%～7% A；15～20 min，7%～14% A；20～42 min，14% A；42～45 min，14%～23% A；45～55 min，23%～25% A；55～60 min，25%～50% A；60～65 min，50%～100% A；65～75 min，100% A；75～77 min，100%～5% A；77～82 min，5% A；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；程序變化波長：0～8 min，202 nm；8～15 min，238 nm；15～25 min，324 nm；25～30 min，238 nm；30～40 min，240 nm；40～50 min，254 nm；50～82 min，374 nm。

表1 杜仲雄花樣品來源信息

2.2 供試品溶液制備

分別精密稱取0.05 g樣品粉末與4.0 mL 50%甲醇溶液混勻，稱定質(zhì)量，室溫靜置1 h，超聲提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足揮發(fā)溶劑，搖勻，使用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 對照品溶液制備

分別精密稱取1.5 mg桃葉珊瑚苷、1.4 mg京尼平苷酸、0.4 mg京尼平、0.6 mg蘆丁、5.2 mg綠原酸、0.8 mg京尼平苷、0.5 mg槲皮素對照品，加入5 mL 50%甲醇溶解，制備成母液，備用。母液中各對照品質(zhì)量濃度分別為0.3、0.28、0.08、0.12、1.04、0.16、0.1 mg/mL。

2.4 精密度試驗

取同一批次（S1）杜仲雄花樣品，按“2.2”項方法制備成供試品溶液，在“2.1”項下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以5號峰（綠原酸）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間RSD均小于1%，各共有峰的相對峰面積RSD小于3%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批次（S1）杜仲雄花樣品，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h測定，記錄色譜圖。以5號峰（綠原酸）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間RSD均小于1%，各共有峰的相對峰面積RSD小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗

取同一批次（S1）杜仲雄花樣品，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.1”項下色譜條件下進樣，記錄色譜圖。以5號峰（綠原酸）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間RSD均小于1%，各共有峰的相對峰面積RSD小于3%，表明該方法重復性良好。

2.7 氣候數(shù)據(jù)

綜合考慮杜仲開花季節(jié)及環(huán)境條件，選取了3、4月的氣溫、降水量、濕度等12個氣候因子用于研究。氣候因子源于中國天氣網(wǎng)（http://www. weather.com.cn/）進行下載收集。

2.8 化學模式識別

本研究采用系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）以及偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）對各組數(shù)據(jù)進行分析。HCA屬于無監(jiān)督分析方法，即輸入樣本時不需要人為的給定分類標簽，直接對數(shù)據(jù)進行建模分類，可以明顯區(qū)分組間差異；而后者PLS-DA為有監(jiān)督分析方法，在輸入樣本時需要人為給定分類標簽，從而建立分類模型，PLS-DA可以有效地對組間觀察值進行區(qū)分，并且能夠找到導致組間區(qū)別的差異性變量。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC指紋圖譜建立與共有峰的確定

將21批杜仲雄花樣品按照“2.2”項下方法制備成供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下進行分析，記錄色譜圖。導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012）版軟件，以S1樣品色譜圖為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點校正后進行色譜峰的匹配，得到21批杜仲雄花樣品的指紋圖譜（圖1）以及對照指紋圖譜（圖2），并進行相似度評價。從指紋圖譜中共標定了15個共有峰，通過與混合對照品溶液色譜圖（圖3）對比，指認了其中6個峰，分別為1號峰桃葉珊瑚苷、2號峰京尼平苷酸、5號峰綠原酸、6號峰京尼平苷、11號峰蘆丁以及15號峰槲皮素。

相似度評價結(jié)果（表2）表明，21批杜仲雄花樣品圖譜與對照指紋圖譜之間的相似度在0.911～0.989，均在0.9以上，說明21批樣品的化學成分基本一致，質(zhì)量相對穩(wěn)定，僅部分成分在含量上具有一定差異。5批四川樂至樣品間的相似度為0.979～0.998，3批貴州遵義樣品間的相似度為0.926～0.985，6批湖南慈利樣品間的相似度為0.832～0.994，7批陜西略陽樣品間的相似度為0.929～0.997。不同產(chǎn)地樣品間的相似度為0.751～0.984，其中貴州遵義樣品（S7、S8）與陜西略陽樣品間的相似度整體較低，大多低于0.9，說明2產(chǎn)地的杜仲雄花間存在差異較大。

圖1 21批杜仲雄花樣品指紋圖譜

圖2 杜仲雄花HPLC對照指紋圖譜

1-桃葉珊瑚苷 2-京尼平苷酸 5-綠原酸 6-京尼平苷 11-蘆丁 15-槲皮素

表2 指紋圖譜相似度結(jié)果

3.2 HCA與PLS-DA

以21批杜仲雄花中15個共有峰峰面積為變量，組成21×15的數(shù)據(jù)矩陣進行HCA。原始數(shù)據(jù)經(jīng)得分標準化后采用組間對比和距離公式作為樣品的測度，分析結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示以相對距離13.0為閾值，21批樣品分為5個類別，即S1～S7聚為1類，S8～S9、S11～S12、S14聚為1類，S13、S15～S18、S20～S21聚為1類，S10單獨聚為1類，S19單獨聚為1類。聚類結(jié)果與雄花產(chǎn)地來源關(guān)聯(lián)性不明顯，存在產(chǎn)地交叉的現(xiàn)象。4個不同產(chǎn)地中僅四川樂至的樣品被整體歸為1類。湖南慈利和陜西略陽都存在單個樣品獨立為1類的現(xiàn)象，說明該樣品與同產(chǎn)地其他樣品間差異較大。

圖4 21批杜仲雄花HCA圖

為了更好地區(qū)分21批杜仲雄花樣品，篩選出影響較大的差異性成分，選擇有監(jiān)督模式的PLS-DA進行判別分析。以21批樣品中15個共有峰的峰面積為變量，組成1個21×15的新矩陣，采用SIMCA 14.1軟件對新組成的矩陣進行PLS-DA，結(jié)果見圖5。該模型的累積解釋能力參數(shù)2和2分別為0.819和0.865，預測能力參數(shù)2為0.731，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠。不同產(chǎn)地杜仲雄花樣本點在得分圖中完全被分開，相互之間沒有出現(xiàn)樣本交叉的情況，能夠直觀顯示出各組間差異。根據(jù)模型中變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP），分析篩選主導不同產(chǎn)地杜仲雄花樣品相區(qū)分的差異性成分。VIP＞1的變量被認為是重要變量[18-19]。模型中VIP＞1的化學成分共有7個（圖6），分別是15、1、11、9、4、13、3號峰，其中15號峰為槲皮素，1號峰為桃葉珊瑚苷、11號峰為蘆丁。

3.3 差異性成分峰面積與氣候因子相關(guān)性分析

依據(jù)PLS-DA結(jié)果，分別計算4個不同產(chǎn)地中7個VIP＞1的成分峰面積的均值，通過SPSS 25.0軟件與產(chǎn)地氣候因子進行相關(guān)性分析，明確與差異性成分具有相關(guān)性的生態(tài)因子，結(jié)果見表3。15號峰槲皮素峰面積與3月平均降水天數(shù)呈顯著負相關(guān)；9號峰峰面積與3月平均最低氣溫、3月平均氣溫、4月平均最低氣溫、4月平均氣溫呈顯著的正相關(guān)；其余差異性成分與氣候因子并未呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。從整體看，溫度對9號峰化學成分以及4號峰化學成分的積累有促進作用，對3號峰化學成分的積累有抑制作用，降水量和濕度則對槲皮素、桃葉珊瑚苷影響較大，他們可能促進桃葉珊瑚苷的積累，抑制槲皮素的積累。

圖5 21批杜仲雄花PLS-DA圖

圖6 差異性標志物VIP圖

3.4 差異性成分峰面積與氣候因子相關(guān)性分析

依據(jù)PLS-DA結(jié)果，分別計算4個不同產(chǎn)地中7個VIP值大于1的成分峰面積的均值，通過SPSS 25.0軟件與產(chǎn)地氣候因子進行相關(guān)性分析，明確與差異性成分具有相關(guān)性的生態(tài)因子，結(jié)果見表3。15號峰槲皮素峰面積與3月平均降水天數(shù)呈顯著負相關(guān)；9號峰峰面積與3月平均最低氣溫、3月平均氣溫、4月平均最低氣溫、4月平均氣溫呈顯著的正相關(guān)；其余差異性成分與氣候因子并未呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。從整體看，溫度對9號峰化學成分以及4號峰化學成分的積累有促進作用，對3號峰化學成分的積累有抑制作用，降水量和濕度則對槲皮素、桃葉珊瑚苷影響較大，它們可能促進桃葉珊瑚苷的積累，抑制槲皮素的積累。

表3 差異性成分與氣候因子的相關(guān)系數(shù)

*和**分別表示相關(guān)性達到0.05和0.01的顯著水平

*and**respectively represent significant levels of correlation of 0.05 and 0.01

4 討論

本實驗分別考察了不同濃度提取溶劑（50%、60%、70%甲醇），不同超聲時間（20、30、40 min）對杜仲雄花樣品色譜峰數(shù)目、峰分離度以及峰形的影響，結(jié)果顯示50%甲醇提取，超聲30 min所處理的樣品效果最佳?？疾炝瞬煌w積流量（1.0、0.8 mL/min），不同流動相乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液對分離效果的影響，確定乙腈-0.1%甲酸水溶液，體積流量為0.8 mL/min，可使各成分理想分離，且峰形較好。檢測波長采用多波長檢測，相較于單一波長檢測，多波長的優(yōu)勢在于通過優(yōu)選色譜峰的最大吸收波長，獲取更多的共有峰信息，反映樣品的峰信息更準確、更直接。綜合各種因素，優(yōu)化得到上述最終色譜條件。

21批杜仲雄花樣品的相似度評價結(jié)果表明不同產(chǎn)地杜仲雄花質(zhì)量較穩(wěn)定，化學成分種類基本一致，差異主要為化學成分的含量。相似度結(jié)果高于前人對不同產(chǎn)地杜仲葉的相似度評價結(jié)果[20]，其原因可能是由于杜仲雄花花期短，采集時間集中，且本研究中采集樣點范圍較小。HCA結(jié)果存在產(chǎn)地交叉的現(xiàn)象，尤其是湖南慈利和陜西略陽產(chǎn)地中都有單個樣品獨立為1類，表明該樣品與同產(chǎn)地其他樣品間差異較大，其原因可能是遺傳因素的影響更大，超過了產(chǎn)地和氣候的影響。杜仲經(jīng)歷長期的引種栽培，其群體間遺傳變異小，相似程度高，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)[21]。湖南慈利和陜西略陽均為我國杜仲的主要原生地及主產(chǎn)區(qū)，具有種質(zhì)資源豐富、產(chǎn)量大等優(yōu)點。推斷當?shù)亻L期對野生種質(zhì)栽培馴化，在遺傳背景上有一定體現(xiàn)，這也提示我們應當加強關(guān)注對杜仲原生地中種質(zhì)資源的收集和保存，為將來杜仲良種選育提供基礎(chǔ)。PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析方法，可以有效對組間觀察值進行區(qū)分，并且能夠找到導致組間區(qū)別的影響變量，有效提高組內(nèi)聚集性。PLS-DA結(jié)果顯示4產(chǎn)地樣品分別聚集在各自所在區(qū)域，相互間無交叉，不同產(chǎn)地區(qū)別直觀可見，區(qū)分效果較好。經(jīng)VIP值篩選分析發(fā)現(xiàn)槲皮素、桃葉珊瑚苷、蘆丁等是引起差異的主要成分。從指紋圖中可知陜西略陽杜仲雄花的蘆丁、京尼平苷峰面積明顯大于其他產(chǎn)地，四川樂至杜仲雄花的槲皮素峰面積明顯大于其他產(chǎn)地，在考慮杜仲雄花不同的藥用價值或是與其他藥用植物配伍時，可以側(cè)重選擇杜仲雄花的不同產(chǎn)地。氣候因子相關(guān)性分析結(jié)果表明15號峰槲皮素和9號峰峰面積與氣候因子存在一定相關(guān)性，其余成分峰面積與氣候因子并無顯著相關(guān)性，這可能是由于杜仲適生性強，4個產(chǎn)地氣候因子的差異并不是造成差異性成分積累的主要因素。差異性成分的積累可能更多的受當?shù)赝寥罈l件、光照強度、日照時長等其他因素的影響，其作用規(guī)律有待進一步深入研究。整體而言，不同產(chǎn)地杜仲雄花具有一定的質(zhì)量差異，主要表現(xiàn)為幾個單一成分的差異，前人對不同產(chǎn)地杜仲葉的指紋圖譜研究中也表現(xiàn)出類似的結(jié)果[20]，推測這也是杜仲僅有主要產(chǎn)地而無明確道地產(chǎn)地的原因之一[3]，在將來建立杜仲栽培基地時應綜合考慮其生態(tài)環(huán)境的適宜性，以期提高杜仲雄花品質(zhì)。本實驗建立的指紋圖譜方法可為杜仲雄花質(zhì)量控制與資源開發(fā)利用提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of fingerprint and chemical pattern recognition ofmale flowers from different cultivation areas

ZHANG Zhi, LONG Hua, ZENG Luo, LI Tao, LI Li

College of Biological Resources and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China

To establish HPLC fingerprints of 21 batches of male flowersfromin four producing areas and provide experimental reference for quality control and resource development of male flowersfrom.HPLC mthod was adopted. The determination was performed on a column of Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm, 5.0 μm); Mobile phase: 0.1% formic acid (A) and acetonitrile (B); Flow rate: 0.8 mL/min; Column temperature: 35 ℃; Injection volume: 20 μLwas used to detect organic chemicals in male flowers. The fingerprint of male flowers fromwas evaluated via similarity evaluation, partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), hierarchical cluster analysis and its relationship with climatic factors were also analyzed by using correlation analysis.HPLC fingerprints of male flowers offrom four producing areas were established. A total of 15 common peaks were calibrated and six chromatographic peaks were identified, which were aucubin, geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, rutin and quercetin. The similarity between the established fingerprint of 21 batches and standard reference was 0.911—0.989. The results of PLS-DA analysis showed that there existed differences among male flower samples from different producing areas. Seven differential compounds were screened by variable importance in the projection (VIP). Moreover, correlation analysis between peak area of different compounds and climatic factors indicated that the peak area of No.9 was positively correlated with the average minimum temperature in March and April. The peak area of quercetin (No.15) was negatively correlated with the average precipitation days in March. The other five compounds showed no significant correlation with climate factors.The established method in this paper could be applied to evaluate the quality of male flowers from, with view to providing reference for quality control and resource development of male flowers from.

male flowers fromOliv.; fingerprint; HPLC; partial least squares discriminant analysis; cluster analysis; aucubin; geniposidic acid; chlorogenic acid; geniposide; rutin; quercetin

R286.12

A

0253 - 2670(2022)22 - 7207 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.025

2022-03-13

國家自然科學基金資助項目（31960323）；吉首大學校級科研項目（Jdy20080）

張 智（1997—），男，碩士研究生，研究方向為藥用植物質(zhì)量評價。Tel: 15008581385 E-mail: 785434618@qq.com

李 鸝，碩士生導師，教授，主要從事藥用植物資源學。E-mail: lilyjsu@126.com

[責任編輯 時圣明]