華通膠間充質(zhì)干細胞移植改善大鼠肺動脈高壓的療效觀察

王 力，宗剛軍，陳 亮，王圩健

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension,PAH）是一大類以肺動脈壓力進行性增高，伴有肺小動脈內(nèi)皮功能障礙、血管重塑為特征的疾病，往往可引起右心功能衰竭甚至死亡[1]。目前常用于PAH的藥物有鈣離子拮抗劑、前列環(huán)素、內(nèi)皮素-1受體拮抗劑、磷酸二酯酶5型抑制劑等[2]。盡管這些藥物確實延緩了疾病進程，但由于該病的病因并不完全清楚，因此目前尚沒有能治愈該疾病的方法，多數(shù)患者都會走向心肺功能衰竭的結(jié)局。諸多的動物實驗均證實了同種屬或異種屬間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）治療PAH的可行性與有效性[3-5]。

本課題組前期從人臍帶結(jié)締組織中分離出黏液樣物質(zhì)Wharton’s jelly并從中培養(yǎng)出大量MSCs，稱為華通膠間充質(zhì)干細胞（wharton’s jelly derivedmesenchymal stem cells,WJ-MSCs），具有分化潛力大、增殖能力強、無免疫源性、無致瘤性、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業(yè)化制備等特征[6]。目前，MSCs的體外培養(yǎng)主要是以含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為主，含有異源性蛋白，易引起人體的過敏反應(yīng)，阻礙了MSCs在臨床的應(yīng)用與推廣。無血清培養(yǎng)基（serum-ree media,SFM）是一種合成培養(yǎng)基，主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充因子組成，可以避免血清源性污染及血清成份對實驗研究的影響。本研究采用WJ-MSCs作為種子細胞，在無血清培養(yǎng)條件下體外擴增后移植PAH大鼠模型，探索WJ-MSCs對PAH大鼠模型的治療作用，為PAH患者的干細胞臨床試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞該實驗所用6周齡雄性SD大鼠（SPF級，體質(zhì)量200～220 g）購自杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號SCXK浙2019-0002），飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第904醫(yī)院SPF級動物房。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，每天照明12 h，自由飲水進食。本實驗所用臍帶來源于聯(lián)勤保障部隊第904醫(yī)院婦產(chǎn)科2021年10月40周胎齡剖宮產(chǎn)胎兒，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊第904醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：20220909），同時經(jīng)產(chǎn)婦及其家屬同意，產(chǎn)婦健康，無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病。

1.2 干細胞培養(yǎng)及表型鑒定無菌取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶，以平衡鹽溶液洗去臍帶殘留血液，剔除臍帶動靜脈，取結(jié)締組織中的膠狀物（此膠狀物即為華通膠Wharton’s jelly）并剪切成1 mm3及以下小塊，分裝接種于數(shù)個75 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入10 mL間充質(zhì)干細胞SFM（北京友康生物，貨號NC0103），置于37℃、飽和濕度的細胞(含5%CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d半量換液1次，每日觀察組織塊周圍，待細胞貼壁融合至80%以上時傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至P3代細胞采用流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物。棄培養(yǎng)基，用干細胞溫和消化酶（北京友康生物，貨號NC1004）消化，SFM終止消化后離心、重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL單細胞懸液1 mL/管，共6管，分別加入小鼠抗人單克隆抗體FITCCD34、FITC-CD45、PE-CD44、PE-CD73、PE-CD90、PE-CD105各20 μL，充分混勻，避光室溫孵育30 min，平衡鹽緩沖液洗2遍后離心（1000 r/min,5 min,離心半徑10 cm），重懸成0.5 mL/管進行流式細胞儀表型檢測。

1.3 PAH大鼠模型建立及實驗分組將30只雄性SD大鼠隨機分為三組：對照組（control組）、模型組（MCT組）、WJ-MSCs移植組（MCT+WJMSC組），每組10只大鼠，三組同等條件飼養(yǎng)。將模型組、WJMSCs移植組大鼠一次性腹腔注射野百合堿（60 mg/kg）（Sigma Aldrich，貨號C2401），對照組腹腔注射等量生理鹽水。飼養(yǎng)14 d后從WJ-MSCs移植組大鼠尾靜脈注射0.5 mL細胞懸液（含2×106WJMSCs），對照組和模型組大鼠尾靜脈注射0.5 mL生理鹽水，處理后于同等條件下繼續(xù)飼養(yǎng)21 d，每周稱量大鼠體質(zhì)量并記錄。

1.4 右心室收縮壓及右心肥大指數(shù)檢測野百合堿注射后第35天，各組大鼠稱重后腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（按體質(zhì)量40 mg/kg）麻醉，然后固定于大鼠操作臺。右側(cè)頸部行縱形切口，鈍性分離右頸外靜脈，遠心端結(jié)扎，近心端剪開頸外靜脈，將預(yù)充盈肝素鈉鹽水的聚乙烯PE50導(dǎo)管緩緩插入，經(jīng)上腔靜脈入右心房后進入右心室，尾端連接三通管，通過換能器連接MP150生物信號采集系統(tǒng)（美國BIOPAC公司），記錄各組大鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure,RVSP）。脫臼法處死各組大鼠并取出心臟，剪除心房，沿室間溝分離右心室（RV）及左心室加室間隔（LV+S），濾紙吸水后分別稱重，以RV/（LV+S）得出各組大鼠右心肥大指數(shù)（right ventricle hypertrophy index,RVHI），反映右心室的質(zhì)量變化。

1.5 病理學(xué)檢測取各組大鼠左肺組織塊常規(guī)石蠟包埋、組織切片并行HE染色，在倒置相差顯微鏡下觀察肺小動脈的病理改變，每組隨機選取與終末細支氣管伴行的管徑50～100 μm肺小動脈10根，運用圖像分析軟件測量肺小動脈管壁相對中膜厚度（medial thickness,MT）、外徑（external diameter,ED）、中膜面積（membrane area,MA）及血管總面積(total arterial area,TAA)；分別計算中膜厚度占血管外徑百分比（2MT/ED×100%)、管腔狹窄率（MA/TAA×100%)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，單個時間點的多組數(shù)據(jù)間比較，若符合正態(tài)分布且方差齊性采用單因素方差分析，多重比較采用LSD或Tukey法檢驗。重復(fù)測量資料的多組數(shù)據(jù)間比較采用單變量方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WJ-MSCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果原代WJ-MSCs培養(yǎng)約8～10 d后，組織塊間隙可見大量細胞貼壁生長，形態(tài)不均一，以短梭形、三角形為主，呈平行緊密排列或漩渦狀生長，連續(xù)傳代培養(yǎng)的5代細胞增殖趨勢相對穩(wěn)定，細胞形態(tài)逐漸均一，呈紡錘形（圖1）。流式細胞儀檢測P3代細胞表型，結(jié)果顯示實 驗 培 養(yǎng) 的WJ-MSCs表 達CD44、CD73、CD90、CD105，而不表達CD45、CD34（圖2），符合間充質(zhì)干細胞的表型特點。

圖1 光鏡下原代（A，×100）及P3代（B，×200）WJ-MSCs形態(tài)

圖2 P3代WJ-MSCs流式細胞儀檢測表型

2.2 動物一般情況及生存質(zhì)量觀察與對照組大鼠比較，模型組、WJ-MSCs移植組大鼠在注射野百合堿第10天后，活動明顯減少，飲食、水量減少，呼吸較急促，體重增長速度減緩（圖3）。模型組在注射野百合堿第18天后開始出現(xiàn)死亡，注射后第21天時死亡率為30%，注射后第35天死亡率為50%。WJ-MSCs移植組在移植干細胞1周后食欲逐漸恢復(fù)，體重漸增加，活動良好，在實驗結(jié)束時，對照組及WJ-MSCs移植組大鼠生存率100%。與對照組相比，其余兩組大鼠注射野百合堿第14天后體重均有顯著下降（F=36.97,P<0.01），其中模型組下降最為明顯。

圖3 實驗期間各組大鼠體重變化

2.3 右心室收縮壓及右心肥大指數(shù)注射野百合堿5周后，與對照組大鼠RVSP（23.5±1.09 mmHg）比較，模型組大鼠（47.8±1.3 mmHg）、WJ-MSCs移植組（41.5±1.72 mmHg）大鼠RVSP明顯升高（F=642,P<0.01）,提示肺動脈高壓模型造模成功（圖4A）。WJ-MSCs移植組與模型組相比RVSP明顯降低（P<0.01）。從RVHI結(jié)果來看，模型組（0.383±0.03）及WJ-MSCs移植組（0.348±0.03）較對照組（0.287±0.02）大鼠右心肥厚程度顯著增加（F=31.46,P<0.01），但WJMSCs移植組較模型組大鼠右心肥厚程度有所下降（P<0.05）（圖4B）。

圖4 各組大鼠RVSP及RVHIA：右心室收縮壓,B：右心肥大指數(shù)；*P<0.05,**P<0.01

2.4 病理形態(tài)觀察及圖像分析結(jié)果對照組大鼠肺小動脈內(nèi)皮連續(xù)性好，炎性細胞較少，管壁均一（圖5A）。模型組大鼠肺小動脈管壁向心性增厚，中膜平滑肌細胞明顯增生伴炎性細胞浸潤，致管腔明顯狹窄（圖5B）。WJ-MSCs移植組大鼠肺小動脈中膜增生程度介于對照組與模型組之間，管腔輕中度狹窄（圖5C）。三組大鼠中膜厚度占血管外徑百分比（F=146.8,P<0.01）、管腔狹窄率（F=138,P<0.01）均有顯著差異，模型組最高，WJ-MSCs移植組次之，兩組數(shù)值明顯高于正常對照組（P<0.01），同時WJMSCs移植組中膜厚度占血管外徑百分比、管腔狹窄率明顯低于模型組（P<0.01）（圖6A、6B）。

圖5 各組大鼠肺小動脈顯微結(jié)構(gòu)改變（H-E染色，×200）

圖6 各組大鼠肺小動脈中膜厚度占血管外徑百分比及管腔狹窄率比較A：中膜厚度占血管外徑百分比，B：管腔狹窄率；**P<0.01

3 討論

Bourgeois等[7]在研究PAH的病理生理學(xué)機制過程中提出了細胞增殖和退化假說，內(nèi)皮損傷和功能障礙參與抑制肺動脈高壓模型中的細胞凋亡，促進肺小動脈閉塞性叢集病變的形成，而細胞損傷可引起內(nèi)皮功能障礙，進而引起肺小動脈功能障礙。再生細胞治療旨在修復(fù)內(nèi)皮損傷和功能障礙，同時恢復(fù)肺小動脈功能。目前常見的干細胞治療種子細胞有內(nèi)皮祖細胞、間充質(zhì)干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞等[8]。MSCs屬于多能成體干細胞，其來源于中胚層間充質(zhì)，分布于骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤組織、脂肪組織等，其自我更新及分化潛能不如胚胎干細胞，但較內(nèi)皮祖細胞強，有向骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞等分化的能力[9]。本研究中采用的WJ-MSCs取材于廢棄的人體臍帶組織，避免了胚胎干細胞面臨的醫(yī)學(xué)倫理問題，它介于胚胎與成體組織之間，具有類似胚胎干細胞的原始特性，其強大的再生潛能在組織修復(fù)和血管生成中起著重要作用，經(jīng)過體內(nèi)注射后可遷移到損傷部位，分化并促進修復(fù)[10-11]。此外，WJ-MSCs具有獨特的免疫學(xué)特性，表達人類白細胞Ⅰ類抗原（human leukocyte antigen-1,HLA-Ⅰ）、HLA-G，不表達HLA-DR，從而避免自然殺傷細胞的免疫排斥及T淋巴細胞活化，表現(xiàn)為低免疫源性[12]。如果能在體外提取、培養(yǎng)及傳代過程中避免接觸異源性蛋白，WJ-MSCs將有望成為最具應(yīng)用前景的臨床應(yīng)用級別的間充質(zhì)干細胞。因此，本研究選擇無血清培養(yǎng)體系對WJ-MSCs進行體外培養(yǎng)，避免常規(guī)培養(yǎng)體系中不同程度的異種蛋白混入，避免因異種蛋白造成的移植宿主對移植干細胞的排斥反應(yīng)。

許多動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，MSCs顯示出較低的組織持久性和植入率，約5%[13]。移植的MSCs在受體組織中的低存活率可能與培養(yǎng)條件或在受體內(nèi)環(huán)境有關(guān)，因此對其使用有很大的限制[14]。然而，越來越多的證據(jù)表明，MSCs修復(fù)和改善受損組織功能的能力并不一定需要顯著的植入或分化率[11]。事實上，間充質(zhì)干細胞的旁分泌機制實現(xiàn)了與靶細胞之間的細胞通訊與聯(lián)系[15]。MSCs分泌的生物活性因子介導(dǎo)MSCs的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗凋亡等功能。它們還有助于組織再生、血管生成和微生物的清除。本研究中首次采用無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)WJ-MSCs用于移植PAH大鼠模型，發(fā)現(xiàn)移植后大鼠生存率明顯改善，右心室動脈壓較模型組下降，右心肥厚程度下降，提示W(wǎng)J-MSCs移植后可有效緩解PAH所產(chǎn)生的肺小動脈壓力升高、右心壓力負荷重的病理生理過程。從病理結(jié)構(gòu)上看，WJMSCs移植后從一定程度上逆轉(zhuǎn)了PAH大鼠肺小動脈中膜過度增生及血管周圍炎性細胞浸潤的病理改變，從而緩解了肺動脈壓力進行性升高的進展過程。該研究結(jié)果產(chǎn)生的機制有如下可能：（1）諸多研究發(fā)現(xiàn)，野百合堿誘導(dǎo)的PAH動物模型，主要通過損傷肺動脈內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞壞死、脫落，進而整個肺動脈血管發(fā)生纖維化、硬化[16]，小動脈周圍巨噬細胞浸潤，白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子水平升高，病理結(jié)果顯示W(wǎng)J-MSCs移植進入受體后小動脈周圍炎性細胞浸潤程度較模型組減輕，可能通過旁分泌機制產(chǎn)生生物活性因子，一定程度上起到免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用[17,18]。（2）Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)，野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠經(jīng)舌下靜脈注射大鼠骨髓MSCs后，肺動靜脈壁面積較PAH大鼠模型組顯著增加，通過熒光染色發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及血管性假血友病因子(vwF)抗體在移植區(qū)顯著增加，提示MSCs移植后能在肺內(nèi)分化成血管內(nèi)皮細胞。本實驗中WJ-MSCs移植后可能受內(nèi)環(huán)境影響分化成血管內(nèi)皮細胞，修復(fù)受損的肺動脈血管內(nèi)皮。（3）WJ-MSCs通過旁分泌機制分泌促血管生成物質(zhì)，刺激新生血管網(wǎng)及側(cè)枝循環(huán)形成，緩解肺小動脈壓力過高，改善肺內(nèi)血流及氧供平衡[20]。

另一方面，WJ-MSCs移植PAH大鼠后雖然在血流動力學(xué)及病理結(jié)構(gòu)方面較模型組有所改善，但仍無法完全逆轉(zhuǎn)肺小動脈中膜增生過程，分析原因主要包括：（1）移植細胞量不足或移植途徑引起的移植效率不足?？紤]到動物模型的總體循環(huán)血量有限，無法一次性輸注過多的細胞懸液。另外，經(jīng)尾靜脈注射的干細胞需經(jīng)下腔靜脈循環(huán)，部分細胞無法到達靶病變處。有文獻報道，除尾靜脈注射外，經(jīng)舌下靜脈、頸外靜脈以及氣管內(nèi)注射干細胞，均可實現(xiàn)本研究類似結(jié)果[19,21,22]，但各種移植途徑的優(yōu)劣尚缺乏系統(tǒng)比較。（2）旁分泌產(chǎn)生的生物活性因子數(shù)量有限，可能無法完全抑制炎癥反應(yīng)的進展。因此，采用基因修飾的方法將生物活性因子基因轉(zhuǎn)染干細胞，進而在移植供體內(nèi)持續(xù)高表達，進而發(fā)揮持久的抗炎作用是可能的解決途徑。（3）肺動脈高壓病理生理機制復(fù)雜多樣，單一的機制補償不足以逆轉(zhuǎn)疾病轉(zhuǎn)歸。在今后的研究中，我們將采用基因修飾的WJ-MSCs移植治療PAH，并對比多種移植途徑的移植效率，探索更加優(yōu)化的干細胞移植方案。