葉蛋白提取與應(yīng)用的研究進(jìn)展

史 可， 李研東， 王成祥， 霍惠玲， 高 山， 馬曉迪， 李丹丹， 韓 雪*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥飼料工作總站，河北 石家莊 050035；3.河北省健康主食產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 石家莊 051430；4.河北同福健康產(chǎn)業(yè)有限公司，河北 石家莊 051430）

葉蛋白是以綠色植物的莖葉為提取原料，經(jīng)壓榨、浸提、蛋白質(zhì)分離和濃縮干燥等步驟制備的蛋白質(zhì)濃縮物（LPC）（高琦等，2020）。主要由葉綠體內(nèi)基質(zhì)蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白等組成，屬于“功能性蛋白質(zhì)”（劉曉庚等，1999）。當(dāng)前，大約有60多種植物莖葉可用于葉蛋白的提取，紫花苜蓿、桑葉、黑麥草、紫云英是研究與應(yīng)用的常見種類（表1）。葉蛋白作為一類優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，其廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)療等行業(yè)，可有效地緩解我國人均蛋白質(zhì)攝入量不足的問題。近年來，葉蛋白研究多集中在提取方法優(yōu)化和復(fù)合功能性物質(zhì)分析等方面，并且研究內(nèi)容逐漸深入。本文主要從葉蛋白的營養(yǎng)價(jià)值、提取方法、應(yīng)用前景等方面概述其研究進(jìn)展。

表1 常見葉蛋白的蛋白質(zhì)含量及其應(yīng)用

1 葉蛋白的營養(yǎng)價(jià)值

葉蛋白是綠葉植物中所特有的蛋白質(zhì)，是在葉中形成的初始蛋白，與經(jīng)過莖葉輸送、累積到籽實(shí)中的蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)的分子鏈更短，易于人體的消化吸收。其粗蛋白質(zhì)含量一般可達(dá)30%~60%，所含氨基酸種類齊全，比例均衡，包含人體所需的8種必需氨基酸，且含量均較高。從營養(yǎng)學(xué)角度來看，幾乎完全符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）推薦的人體需要的氨基酸模式。

除蛋白質(zhì)外，葉蛋白還含有許多營養(yǎng)物質(zhì)，如胡蘿卜素、葉黃素、維生素及多種礦物質(zhì)元素等，具有抗氧化、促進(jìn)消化吸收、降低膽固醇等功效。如西蘭花莖葉蛋白肽具有較好的降血脂活性（李露等，2019）。魯梅克斯葉蛋白酶解物具有一定的抗氧化效果，食用后可有效清除體內(nèi)的自由基，減少自由基帶來的氧化損傷（李延琪等，2017）。且綠葉中含豐富的不飽和脂肪酸，非常符合人們當(dāng)下的飲食理念?，F(xiàn)我國已有研究采用一系列方法來制備其水解物，優(yōu)化制備條件并進(jìn)行成分分析，為葉蛋白資源的開發(fā)利用和精深加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)參考。

2 葉蛋白的提取方法

植物體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)一般穩(wěn)定性都比較強(qiáng)，即使植物受到了一定的破壞，也不會(huì)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成影響。在進(jìn)行葉蛋白的提取之前，需要通過壓榨、酶法等手段破壞其穩(wěn)定狀態(tài)，利用離心等多種方式實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀，從而為后期的研究和應(yīng)用提供條件（于群，2019）。目前用到的葉蛋白提取方法有很多，針對不同的葉蛋白需要采取不同的提取方式，在提取過程中一定要綜合考慮多種影響因素，選用合理的提取方法。

2.1 直接加熱法 直接加熱法是指蛋白質(zhì)在高溫環(huán)境下受熱沉淀而提取蛋白質(zhì)的方法。工藝流程圖如下：

該方法操作簡單易行，成本低，但是溫度過高會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)使其變性，可能會(huì)降低蛋白質(zhì)的活性以及提取率。呂富（2013）利用50~90℃逐漸升溫的加熱法提取水葫蘆葉蛋白，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，其葉蛋白得率不斷提高，50~70℃時(shí)升高幅度較大，70℃后葉蛋白得率不再升高，考慮到經(jīng)濟(jì)效率與葉蛋白得率，提取溫度70~80℃最為適宜，葉蛋白得率可達(dá)1.52%，提供了一種水葫蘆葉蛋白提取的可行性方法。

2.2 酸（堿）化加熱法 酸（堿）化加熱法是將酸堿法和加熱法相結(jié)合的一種復(fù)合蛋白質(zhì)分離方法，在等電點(diǎn)和熱變性雙重因素的作用下，葉片蛋白質(zhì)的聚集效應(yīng)和敏感性提高，導(dǎo)致葉片蛋白質(zhì)快速聚集。工藝流程圖如下：

該方法蛋白質(zhì)沉淀快、過濾收集較方便，但化學(xué)試劑會(huì)在一定程度上損害葉蛋白的營養(yǎng)成分，并對環(huán)境造成一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)以酸化加熱法來提取紅萍葉、木薯葉、黑麥草、構(gòu)樹葉、籽粒莧、黃麻等的葉蛋白效果較好（岑湘濤等，2020；楊有泉等，2013），提取率一般可達(dá)30%以上，提取效率高，但操作較繁雜，適用于實(shí)驗(yàn)室提取。而堿化加熱法適用于提取含有大量等電點(diǎn)偏堿性的葉蛋白（王震等，2016），可以有效減少葉蛋白中的不利因子，并對葉黃素的穩(wěn)定性有一定的保護(hù)作用；但一定程度上破壞了葉蛋白的結(jié)構(gòu)，品質(zhì)較差。這表明在制備葉蛋白時(shí)，需要根據(jù)想要得到的功能性質(zhì)和實(shí)際應(yīng)用選擇合適的提取工藝。

2.3 鹽析法 鹽析法是利用各物質(zhì)在不同鹽溶液中的溶解度不同而沉淀析出。常用的中性鹽有硫酸銨、氯化鈉等，工藝流程圖如下：

該方法可在室溫下進(jìn)行，操作簡單、成本較低，且可以較好的保持蛋白質(zhì)的活性。但是整個(gè)提取過程耗時(shí)較長、效率低。陳秀清（2017）通過正交試驗(yàn)優(yōu)化不同方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的條件，結(jié)果表明鹽析法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的得率最高，很好的保持了葉蛋白的活性，且適用于工業(yè)化和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。楊豪（2021）通過硫酸銨沉淀法提取辣木葉蛋白，優(yōu)化其提取條件，提取率可達(dá)13.49 mg/g。

2.4 發(fā)酵法 發(fā)酵法是利用菌種發(fā)酵液中的酸效應(yīng)作為蛋白質(zhì)沉淀劑使蛋白質(zhì)提取液中的蛋白沉淀，通過離心分離得到粗蛋白質(zhì)。工藝流程圖如下：

該方法不會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，可以有效的減少環(huán)境污染，且發(fā)酵液中含有大量的微生物和生物活性大分子，如酶、菌肽、細(xì)菌素等，促進(jìn)了其聚集作用，同時(shí)在一定程度上可降低粗蛋白質(zhì)中有害物質(zhì)的含量。但發(fā)酵時(shí)間較長，如果要大規(guī)模生產(chǎn)，就要求企業(yè)配備發(fā)酵設(shè)備，生產(chǎn)成本較高。屈紅森（2012）利用響應(yīng)面優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵法提取桑葉蛋白的條件，桑葉蛋白得率和蛋白質(zhì)含量分別提高了10.57%和21.53%，且發(fā)酵后桑葉蛋白的體外消化能力也得到了顯著提高，桑葉蛋白的品質(zhì)得到改善。

2.5 超聲波輔助法 超聲波輔助法是利用超聲波產(chǎn)生的空化、振動(dòng)、粉碎、攪拌等輔以其他方法提取葉蛋白，加快蛋白的溶出，有效減少提取時(shí)間，提高提取效率，常與其他方法聯(lián)用。工藝流程圖如下：

有研究表明，超聲波輔助提取葉蛋白在蛋白質(zhì)產(chǎn)量上優(yōu)于非超聲法，且增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的乳化性、發(fā)泡性、吸油性、熱穩(wěn)定性等功能特性（Saha等，2017）。許英一（2013）在堿法提取苜蓿葉蛋白基礎(chǔ)上加以超聲波輔助，并對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，粗蛋白質(zhì)提取率可達(dá)51.09%，提高了提取率，并大大縮短了提取時(shí)間。職士淇（2020）應(yīng)用超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水溶液提取苧麻葉蛋白的起泡性優(yōu)于大豆分離蛋白，且超聲波輔助鹽提法提取率可達(dá)61.95%，為青葉苧麻葉的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)。

2.6 其他 目前，提取葉蛋白的方法除了以上所提到的還有泡沫分離法、微波輔助法、酶輔助法、超高壓等，但由于這些方法有能耗大、不易操作、效率低等局限性，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用較少。劉龍（2017）以回收率和富集比為指標(biāo)，利用泡沫分離技術(shù)提取菠菜葉中的蛋白質(zhì)，并優(yōu)化其提取條件，回收率和富集比可達(dá)81.56%、14.94。證明了泡沫分離技術(shù)是一種實(shí)現(xiàn)菠菜葉蛋白粗分離的有效的、低成本的方法，但是大多適用于低濃度，具有表面活性物質(zhì)的分離提取。有關(guān)菠菜葉蛋白功能性質(zhì)的改善及高濃度下的泡沫分離技術(shù)還需要進(jìn)一步研究。Moreno-Nájera（2020）利用超聲波輔助、微波輔助、超高壓等技術(shù)提取菠蘿蜜葉蛋白，發(fā)現(xiàn)以0.5 mol/L NaCl為環(huán)境友好溶劑的超高壓法可獲得較高的蛋白質(zhì)得率，提供了一系列綠色技術(shù)提取蛋白的可能性。

3 應(yīng)用前景

3.1 飼用價(jià)值 植物葉蛋白廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)，有效緩解了我國飼料行業(yè)資源短缺的現(xiàn)狀，改善了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。我國的研究工作主要集中在苜蓿、黑麥草、桑葉等，均可簡單加工為優(yōu)質(zhì)蛋白飼料飼喂動(dòng)物，也可作為添加劑加入到飼料中提高其營養(yǎng)價(jià)值。比如苜蓿、木薯葉蛋白富含各類氨基酸，可滿足動(dòng)物的營養(yǎng)需求。不僅成本低，且提高了作物的附加值。食葉草也是近年來出現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)新資源，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類較為豐富，能夠滿足動(dòng)物的生長需求，有巨大的發(fā)展前景。例如，飼料中添加濃縮苜蓿葉蛋白不僅可以提高飼料中蛋白質(zhì)含量，也提高了牛奶中高純度多不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性，利用此方法提高牛奶抗氧化水平來減少氧化（Fauteux等，2016）。范利花（2012）提取檸條葉蛋白后產(chǎn)生的殘?jiān)捎没炀l(fā)酵，得到的發(fā)酵飼料是一種品質(zhì)良好的動(dòng)物飼料。整個(gè)過程操作簡單、成本低廉，改變了檸條的傳統(tǒng)利用方式。

3.2 食用價(jià)值 當(dāng)今時(shí)代，人們逐漸意識(shí)到膳食結(jié)構(gòu)對于身體健康的重要性，這導(dǎo)致葉蛋白作為原料在肉類替代品、乳制品類似物、休閑食品等產(chǎn)品中被廣泛應(yīng)用。目前，已經(jīng)出現(xiàn)了很多葉蛋白延伸產(chǎn)品，以及將提取所得葉蛋白以添加劑的方式應(yīng)用于食品中，用以提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，改善人們的膳食結(jié)構(gòu)。如以小麥、綠豆和大米為原料，添加用雜交莧、辣木和白銀合歡3種不同葉片為材料制備混合葉蛋白濃縮物L(fēng)PC制成斷奶食品。使食物更有營養(yǎng)，從而解決營養(yǎng)不良問題（Meda等，2017）。

3.3 醫(yī)用價(jià)值 除卻用作動(dòng)物飼料與食品，很多葉蛋白表現(xiàn)出抑菌、防癌、降血脂等功效，對醫(yī)療行業(yè)的發(fā)展有一定的推動(dòng)作用。近年來，研究將視線聚焦于葉蛋白內(nèi)功能性物質(zhì)的提取并對蛋白進(jìn)行改性，研究其作用機(jī)制及其應(yīng)用。如桑葉蛋白水解物通過整合腸道菌群和免疫功能來緩解結(jié)腸炎，維持腸道健康，降低結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)（Sun等，2021）；苜蓿葉蛋白及其水解肽具有一定的抗氧化活性，同時(shí)具有降血脂、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等功能，已有研究者采用一些小分子糖類物質(zhì)對苜蓿葉蛋白進(jìn)行糖基化改性，有效改善了苜蓿葉蛋白的功能特性，拓寬了其應(yīng)用范圍；辣木葉蛋白對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有降血糖和抗氧化作用，對小鼠無急性毒性，是一種很有前途的糖尿病替代或補(bǔ)充藥物（Paula等，2017）。

4 結(jié)束語

葉蛋白來源廣泛，營養(yǎng)豐富。近年來對于葉蛋白的研究，提高了作物的附加值，最大程度上利用了作物資源，緩解了我國蛋白資源短缺的現(xiàn)狀，進(jìn)一步完善優(yōu)化了國民膳食結(jié)構(gòu)。目前已有很多提取葉蛋白的方法，提取率在逐漸提升，但大多僅限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方法比較局限，仍然需要進(jìn)一步研究產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中如何降低原料成本和能耗，提高提取效率。且大部分葉蛋白制品普遍為深綠色或棕色，有一定青草味，顏色和口感均限制了其應(yīng)用范圍及商業(yè)價(jià)值?，F(xiàn)在常用到吸附法、有機(jī)溶劑和超臨界CO2流體萃取技術(shù)等進(jìn)行脫色，獲取高品質(zhì)葉蛋白。采用有機(jī)溶劑法脫色分離對溶劑消耗量大，成本較高；而超臨界CO2流體萃取以CO2為萃取劑，設(shè)備投資較高?，F(xiàn)用的提取和脫色方法均存在一定的缺陷，且在加工過程中如何最大限度保護(hù)維生素、活性物質(zhì)等有效成分，去除葉蛋白制品中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和毒素，保證葉蛋白的營養(yǎng)性和安全性是有待解決的問題。因此探索低成本、安全、高效的提取和脫色方法是獲取高品質(zhì)葉蛋白的必要途徑。