青蒿油對皮膚屏障損傷模型小鼠及皮膚微生態(tài)的干預(yù)作用研究

黃 虎，楊志波，萬江波，陶 侃，郭莉莉，秦紫嫣，何彰華，劉 興

（1.上海上美化妝品股份有限公司全球研發(fā)中心，上海 200065；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410005；3.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650106；4.湖南謳睿生物科技有限公司，湖南 長沙 410205）

皮膚是機體抵御外界有害刺激的保護屏障。長時間暴露在紫外線（UV）下對皮膚屏障的結(jié)構(gòu)和功能存在直接損害作用，可誘發(fā)皮膚過早的光老化、色素沉著、炎性反應(yīng)和癌變[1]。因此，需尋找一種天然的皮膚保護化合物以避免UV對皮膚帶來的損傷。青蒿是中醫(yī)治療中常用的中草藥[2]，研究發(fā)現(xiàn)[3]，青蒿以及其有效成分可通過調(diào)控T淋巴細胞功能以及IL-10、TNF-α治療光敏感性皮膚病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、濕疹等疾病，還可通過抑制皮膚癬菌、痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌及糠秕孢子菌等治療感染性皮膚疾病。青蒿油（artemisia naphta oil，AN）作為在青蒿素中提取的活性成分，在治療皮膚病方面也存在巨大潛力?；诖耍狙芯繑M探討AN對UV誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷模型小鼠的干預(yù)作用及對皮膚微生物的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）80只。本研究通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準，所有小鼠飼養(yǎng)溫度為20 ℃～26 ℃，相對濕度為40%～70%，自由攝食、飲水，嚴格遵循國家動物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試劑與儀器 無菌無酶水（北京索萊寶生物科技有限公司），吐溫20、無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），AN（上海上美化妝品股份有限公司）；皮膚測試儀（德國CK公司，型號：Derma-Expert MC760）。

1.3 AN的提取與配制 共同加熱青蒿葉與石油醚后過濾出含AN的溶液，蒸發(fā)去除過濾液中的石油醚，100 ℃～110 ℃下蒸餾得到AN粗產(chǎn)物；將AN粗產(chǎn)物放入精煉罐中110 ℃加熱30 min后冷卻；加入硅膠，攪拌30 min后過濾脫色。配制0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%AN（換算成人體使用濃度分別為0.055%、0.11%、0.16%、0.30%和0.55%）：分別將50 μl、100 μl、150 μl、300 μl、500 μl AN加入至400 μl吐溫20中，使用無菌無酶水稀釋至10 ml。

1.4 動物分組及皮膚屏障損傷模型構(gòu)建 80只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為Control組、Model組、NC組、0.5%AN組、1.0%AN組、1.5%AN組、3.0%AN組、5.0%AN組，每組10只。Control組不做任何處理，其余組小鼠進行紫外線燈照射，單位面積能量為1200 MJ/cm2，每次照射20 min，1次/d，連續(xù)照射7 d，至小鼠皮膚有明顯干燥、皮屑、泛紅、角質(zhì)層變薄癥狀，構(gòu)建皮膚屏障損傷模型。造模成功后開始進行相應(yīng)濃度的AN或Base水（NC組）干預(yù)，將不同濃度AN按照相應(yīng)分組進行噴霧給藥，連續(xù)干預(yù)兩周后取材并進行相應(yīng)檢測。

1.5 小鼠背部皮膚損傷觀察 肉眼觀察小鼠背部皮膚屏障損傷情況；使用皮膚測試儀檢測小鼠皮膚水分、油份、紋理、膚色、色素等皮膚指標，并在鏡下觀察拍照對比，正白光下觀察小鼠背部皮膚的干性、油性及毛囊堵塞、頭皮衰老情況；UV光下觀察皮膚感染情況。

1.6 16 S rRNA測序流程 每組隨機收集4只小鼠的皮膚拭子，采用Illumina NovaSeq PE250系統(tǒng)（上海偉寰生物科技有限公司）進行16S擴增子測序，獲取下機原始數(shù)據(jù)，并對原始數(shù)據(jù)進行去接頭、過濾及去除嵌合體序列等操作，得到可以用于后續(xù)分析的有效序列。本研究采用Qiime 2分析流程，基于下機原始數(shù)據(jù)獲得OTU、ASV等信息，通過進行物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況，確定各組皮膚菌群結(jié)構(gòu)；進一步觀察各組小鼠的α多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù)及PCA分析，根據(jù)樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度等信息分析不同樣本和分組的群落結(jié)構(gòu)差異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad 7.0處理本研究數(shù)據(jù)，最終數(shù)據(jù)由三次獨立實驗結(jié)果的（±s）表示；統(tǒng)計顯著性采用LSD-t檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01、P＜0.001表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚表面變化比較 Control組小鼠皮膚組織完好；與Control組比較，Model組小鼠皮膚局部泛紅，并出現(xiàn)白色鱗屑；與Model組及NC組比較，不同濃度的AN處理后的小鼠局部泛紅程度、白色鱗屑情況均有不同程度的改善，見圖1。

圖1 各組小鼠的皮膚組織變化情況

2.2 各組小鼠背部皮膚損傷比較 根據(jù)各組小鼠皮膚白光圖像（圖2）及UV光圖像（圖3），Control組小鼠皮膚無異常變化；與Control組小鼠比較，Model組油脂分泌旺盛，存在嚴重的炎癥反應(yīng)及感染現(xiàn)象；與Model組及NC組比較，不同濃度的AN處理后的小鼠皮膚受損狀況均有不同程度的改善。其中，5%AN干預(yù)效果較為明顯。

圖2 各組小鼠的皮膚白光圖像比較

圖3 各組小鼠的皮膚UV光圖像比較

2.3 各組小鼠皮膚指數(shù)比較 各組小鼠油份、膚色指數(shù)、色素水平、體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Model組小鼠的皮膚水份指數(shù)低于Control組，紋理指數(shù)高于Control組（P＜0.01）；1.0%及以上濃度AN組小鼠的皮膚水份指數(shù)高于Model組，紋理指數(shù)低于Model組（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠的皮膚指數(shù)

2.4 各組小鼠皮膚微生物多樣性比較 α多樣性分析結(jié)果顯示，皮膚屏障損傷模型組小鼠的皮膚豐富度相較于正常小鼠發(fā)生一定程度的下調(diào)，但AN干預(yù)后上調(diào)，見圖5；組內(nèi)β多樣性分析結(jié)果顯示，各組間的皮膚菌群比較，統(tǒng)計學(xué)意義顯著（P＜0.01）；主成分分析結(jié)果表明，Model組小鼠皮膚菌群發(fā)生顯著變化，而AN干預(yù)使得皮膚屏障損傷小鼠菌群的失衡狀態(tài)得到部分改善。

圖5 各組小鼠皮膚菌群測序結(jié)果的α多樣性分析

2.5 各組小鼠皮膚微生物組成比較八組樣本的優(yōu)勢菌群主要為：葡萄球菌（Staphylococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、線粒體（Mitochondria）、葉綠體（Chloroplast）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）、布勞特氏菌屬（Blautia）、藍綠藻菌屬（Lachnoclostridium）等10種菌群，見表1；Model組布勞特氏菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群豐度低于Control組，葡萄球菌菌群豐度高于Control組（P＜0.05）；不同濃度AN組中布勞特氏菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群豐度高于Model組，葡萄球菌菌群豐度低于Model組（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組優(yōu)勢菌群豐度比較

表1 各組樣本優(yōu)勢菌群比較（%）

3 討論

皮膚是機體的保護屏障，可阻止病原體進入，防止物理和化學(xué)作用刺激損傷以及過多的水分流失。研究發(fā)現(xiàn)[4]，長時間UV照射對未受保護的皮膚屏障帶來較強的損傷。較短的UVB可導(dǎo)致DNA損傷和炎癥的發(fā)生，而較長的波長UVA可更加深入地滲透至皮膚，不僅會導(dǎo)致皮膚過早老化和誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，還可損傷皮膚屏障的完整性。中國藥學(xué)家屠呦呦教授研制出新型抗瘧疾藥物青蒿素和雙氫青蒿素掀起一股青蒿素及其衍生物的研究熱潮，越來越多研究發(fā)現(xiàn)[5]，青蒿在治療皮膚疾病中也存在廣泛的應(yīng)用前景。

惠海英等[4]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素對UV所致小鼠光損傷的炎癥因子IL-10、TNF-α的產(chǎn)生有一定的抑制作用，提示系統(tǒng)性應(yīng)用青蒿素對UVB致小鼠光損傷有保護作用?；诖?，本研究通過照射UV構(gòu)建皮膚屏障損傷模型，并使用不同濃度的AN干預(yù)2周，觀察干預(yù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組小鼠比較，Model組小鼠的皮膚局部泛紅，出現(xiàn)白色鱗屑；油脂分泌旺盛，存在嚴重的炎癥反應(yīng)及感染現(xiàn)象且皮膚水份指數(shù)減少，紋理指數(shù)增加。不同濃度的AN干預(yù)對于小鼠皮膚水份指數(shù)、紋理等問題均有不同程度的改善，其中5.0% AN組小鼠的皮膚水分指數(shù)和紋理指數(shù)等問題改善最顯著，即5% AN干預(yù)效果最為明顯。皮膚微生態(tài)與UV照射引起的皮膚損傷之間的密切關(guān)聯(lián)研究層出不窮，Suh MG等[6]研究發(fā)現(xiàn)，使用膠原蛋白三肽和低聚半乳糖混合物可有效改善UVB暴露下對無毛小鼠的皮膚損害，且其嗜黏蛋白阿克曼菌屬的相對豐度較對照組更高，該菌可能在UVB照射中對皮膚起到保護作用。一項通過收集暴露在UV下的皮膚樣本，進一步分離DNA進行測序以確定各樣本微生物組成的研究中發(fā)現(xiàn)，UV照射24 h后即可改變微生物組成，特別是藍細菌門的增加，乳桿菌科和假單胞菌科的減少[7，8]。青蒿素及其衍生物通過對皮膚菌群的影響緩解皮膚相關(guān)疾病的功能作用也逐步被揭示，青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌具有體外抑菌的作用，余紅等[9]提出青蒿素及其衍生物可通過抗真菌、抗細菌發(fā)揮治療皮膚相關(guān)疾病的觀點。此外，青蒿素衍生物雙氫青蒿素可抑制UVB反復(fù)照射小鼠皮膚中c-kit和PAR-2的表達，進而對UVB照射小鼠皮膚損傷具有光保護作用[10，11]。因此，本研究進一步通過16S rRNA測序檢測各組小鼠皮膚菌群的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與皮膚屏障損傷模型小鼠皮膚葡萄球菌菌群豐度增加，勞特氏菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群豐度相對降低；而在不同劑量AN干預(yù)后，葡萄球菌菌群豐度降低，勞特氏菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌菌群豐度相對增加。其中，葡萄球菌是革蘭氏陽性球菌，多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病[12]。根據(jù)生化反應(yīng)和產(chǎn)生色素不同，可分為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和腐生葡萄球菌（S.saprophytics）等，其中金黃色葡萄球菌引起的慢性或急性傳染病的主要原因[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，屏障功能破壞會促進金黃色葡菌球菌的定植，而該菌可進一步延緩皮膚屏障功能的恢復(fù)。金黃色葡萄球菌可引發(fā)細胞焦亡、誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而抑制創(chuàng)傷的愈合作用[15]。布勞特氏菌屬屬于厚壁菌門，毛螺菌科，該菌具有抑制炎癥進展，產(chǎn)生包括乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸的能力；布勞特氏菌存在益生菌特性，可有效維持腸道穩(wěn)態(tài)活性，還可抑制機體的炎癥反應(yīng)進展，與一些炎癥性皮膚疾病的發(fā)展也密切相關(guān)[16]。嗜黏蛋白阿克曼菌是一種粘蛋白分解細菌，為革蘭陰性的厭氧菌，是疣微菌門的代表。上述研究顯示，AN可通過上調(diào)有益菌群豐度，下調(diào)有害菌群豐度來改善UV照射引起的皮膚屏障損傷。

綜上所述，不同濃度AN可不同程度改善皮膚屏障損傷，其中5% AN的干預(yù)效果最佳。AN對皮膚屏障損傷的干預(yù)作用可能與抑制葡萄球菌，促進布勞特氏菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌有關(guān)。