火棘果原花青素的提取優(yōu)化與抗氧化活性研究

張星和 楊曉娜 鄒章玉 左榮艷

（1.保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院；2.云南省高校怒江河谷生物質(zhì)資源高值轉(zhuǎn)化與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 保山 678000）

火棘Pyracantha fortuneana（Maxim．）Li是一種薔薇科蘋果亞科火棘屬植物，為常綠野生灌木[1]。據(jù)《中國植物志》記載，火棘屬有10種，在我國主要分布有7種，云南地區(qū)多為火棘[2-3]?；鸺粌H資源豐富，具有很多的營養(yǎng)成分，而且藥用價(jià)值高，為“藥食同源”植物?！侗静菥V目》和《滇南本草》記錄，火棘果性味甘酸，具有健脾消積、生津止渴、清熱解毒、活血止血等作用，用來治積食、崩漏等[4-6]。目前對(duì)火棘果中黃酮類、多糖、維生素及色素等研究較多[7-14]，而對(duì)其原花青素提取及抗氧化性報(bào)道相對(duì)較少[15-18]。鄢又玉[19]等以湖北恩施地區(qū)火棘果為原料，先做單因素實(shí)驗(yàn)，后利用中心組合和響應(yīng)面法優(yōu)化了火棘果原花青素的提取工藝，結(jié)果表明：提取溫度，乙醇量以及酸量對(duì)原花青素的提取影響顯著；隨后將火棘果原花青素抗氧化能力與其總抗氧化能力比較，證明了原花青素所貢獻(xiàn)的抗氧化能力在火棘果總抗氧化能力中占了很大比例。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是以黃烷醇為基本結(jié)構(gòu)的一類聚多酚化合物的總稱，是目前世界上清除人體自由基最好的天然抗氧化劑之一，體內(nèi)活性非常強(qiáng)[20-24]。人們對(duì)于原花青素作為抗氧化劑認(rèn)可度非常高。高純的原花青素一般為紅棕色粉末，可溶于水和丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑。其提取方法主要有溶劑提取法、酶提法、超聲波輔助法、超臨界CO2萃取和微波輔助法等[25-28]。微波輔助是一種具有很強(qiáng)化學(xué)效應(yīng)和熱效應(yīng)的高頻電磁波，能使目標(biāo)分子相互摩擦碰撞，從而提高粉末溫度并促進(jìn)細(xì)胞破裂，使原花青素更好地滲出到提取液中，提高得率。關(guān)于微波輔助提取火棘果原花青素尚未見報(bào)道。本文采用了微波輔助法提取楚雄地區(qū)野生火棘果原花青素，用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝，并采用OH˙、DPPH˙、ABTS+、普魯士藍(lán)法、鉬酸銨法、金屬螯合能力6種方法測(cè)定火棘果原花青素的抗氧活性，補(bǔ)充和完善了火棘果原花青素抗氧化活性，為火棘果這一特色“藥食同源”植物的開發(fā)和高值轉(zhuǎn)化、利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料（野生火棘果）：采自云南楚雄武定[成熟、飽滿果實(shí)采摘→沖洗→晾曬→60℃烘干→粉碎→過篩（100目）→火棘果粉末備用]。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院，純度99.2%；香草醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度99.0%；ABTS，酷爾化學(xué)，純度98%；DPPH，阿拉丁試劑網(wǎng)，純度≥97.0%；菲洛嗪水合物，酷爾化學(xué)，純度97%；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

M1-211A微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司；721-可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；DFT-250A250克手提式高速萬能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；TDL-4型離心機(jī)：安亭儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取工藝及最佳條件確定

取1 g火棘果粉末放入100 mL錐形瓶，倒入一定體積和濃度的乙醇溶液封口、浸泡，分別在不同微波時(shí)間、功率下進(jìn)行提取數(shù)次，將提取液抽濾后離心，得到上清液，按含量測(cè)定方法于499 nm處測(cè)定其吸光度A，以縱坐標(biāo)A求出橫坐標(biāo)x，即提取液中原花青素含量，從而計(jì)算原花青素的提取率。分別對(duì)乙醇濃度、水料比、微波時(shí)間和微波功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)（如表1所示），探討最佳提取條件。每個(gè)樣品均做3個(gè)平行。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.2 原花青素含量測(cè)定及提取率計(jì)算

以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，無水乙醇為溶劑配制一系列濃度的溶液，再按香草醛-鹽酸法顯色：1.0 mL溶液+6 mL 4%香草醛-甲醇溶液+3 mL濃鹽酸。30℃恒溫水浴保溫避光反應(yīng)10 min，于499 nm測(cè)定吸光度A。以兒茶素濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)作圖添加趨勢(shì)線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=18.522x+0.012 8，R2=0.999。說明在操作范圍內(nèi)濃度與吸光度呈線性，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。

用1.0 mL樣品溶液代替標(biāo)準(zhǔn)品，同樣的方法避光反應(yīng)、顯色后測(cè)定吸光度。將測(cè)定出的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算含量，按式（1）計(jì)算原花青素提取率：

式中c為提取液濃度mg/mL，V為提取液的體積mL，m為稱取粉末質(zhì)量g。

1.3.3 原花青素的鑒定及最大吸收波長確定

分別取1 mL提取液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1.3.2水浴顯色，用紫外可見分光光度計(jì)于320～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，比較二者的最大吸收波長。

1.3.4 抗氧化活性研究

1.3.4.1 OH·（羥基自由基）的清除能力測(cè)定

采用水楊酸法[29,30]，先用無水乙醇配制相同濃度如7.5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸溶液，等比例混合均勻，作為儲(chǔ)備液。然后按1 mL原花青素提取液（或超純水）+2 mL檢測(cè)儲(chǔ)備液（或超純水）+超純水=5 mL于526 nm波長處測(cè)定溶液體系的吸光度。根據(jù)三個(gè)不同的吸光度按式（2）計(jì)算OH·的清除率。

式中A1為提取液+儲(chǔ)備液，A2為提取液+水，A0為儲(chǔ)備液+水。

1.3.4.2 DPPH·（DPPH自由基）的清除能力測(cè)定

方法同（1），2 mL 0.2%mmol/L DPPH溶液為儲(chǔ)備液在517 nm下測(cè)定吸光度。

1.3.4.3 ABTS+·的清除能力

參考HUANG W Y和劉玉革等[31,32]方法，由7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合反應(yīng)12 h來提供ABTS+·。0.5 mL提取液+2 mL ABTS+·反應(yīng)30 min在734 nm測(cè)定其吸光度A2。以乙醇溶液作對(duì)照測(cè)得A1。清除率計(jì)算見公式（3）。

1.3.4.4 鐵離子的螯合能力測(cè)定

方法同（3），于562 nm波長處測(cè)定反應(yīng)物的吸光度。螯合率（MCC）計(jì)算見公式（3）。

1.3.4.5 總抗氧化性的測(cè)定

鉬酸銨法測(cè)定提取物的總抗氧化性。稱取6.67 mL濃硫酸+2.13 g磷酸鈉+0.99 g四水合鉬酸銨+200.0 mL蒸餾水，充分溶解為鉬酸銨工作液。0.3 mL提取液+3.0 mL鉬酸銨溶液，90℃恒溫水浴條件下加熱1.5 h，靜置，冷卻，3 000 r/min離心15 min，鉬酸銨溶液作空白，于695 nm處測(cè)定溶液中鉬離子的吸光度。

1.3.4.6 原花青素還原能力的測(cè)定

1 mL提取液+1 mL0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.6)+1 mL 1%K3Fe(CN)6溶液50℃恒溫水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸離心10 min。取2 mL上清液+3 mL去離子水+2 mL 0.1%FeCl3溶液于700 nm波長下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定提取物的吸收波長

根據(jù)1.3.3將標(biāo)準(zhǔn)品、提取物顯色后進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 紫外吸收光譜

圖（a）為標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖，圖（b）為提取物的光譜圖，結(jié)果顯示二者最大吸收波長均為499 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道500 nm基本一致。同時(shí)也表明微波輔助提取火棘果產(chǎn)物確實(shí)為原花青素。此后測(cè)定含量均在499 nm。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取率受乙醇濃度的影響情況

分別用55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液對(duì)火棘果粉末進(jìn)行提取，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度與提取率的關(guān)系

從圖2看出，隨著所用提取劑濃度的增加，火棘果原花青素提取率先逐漸增大，然后減小。當(dāng)提取劑濃度達(dá)85%時(shí)，提取率為11.34 mg/g，為原花青素的最大溶出量；當(dāng)濃度為55%～65%范圍內(nèi)提取率相對(duì)較低，可能由于水分含量相對(duì)較高，提取劑極性相對(duì)較大。根據(jù)極性溶劑利于極性相對(duì)較大物質(zhì)的溶解而抑制細(xì)胞中原花青素溶出，導(dǎo)致提取率相對(duì)較低。此后隨著乙醇濃度增加，結(jié)果與上述相反。綜上所述，選取乙醇濃度75%、85%、95%為正交試驗(yàn)水平。

2.2.2 提取率受水料比的影響情況

分別按30、40、50、60、70 mL的乙醇溶液與1 g火棘果粉末比即水料比（mL/g）進(jìn)行原花青素的提取，結(jié)果如圖3所示。

圖3 水料比與提取率的關(guān)系

從圖3看出，隨著乙醇溶液體積的不斷增加，原花青素提取率先上升，當(dāng)水液比在50 mL/g時(shí)，提取率為5.179 mg/g。當(dāng)繼續(xù)增加乙醇溶液的用量，提取率出現(xiàn)降低?？赡苁窃谌軇w積小時(shí)火棘果粉末沒有得到充分浸泡，且溶劑量較少溶劑僅能溶解有限的原花青素，使提取出的溶液容易達(dá)到飽和狀態(tài)，從而抑制原花青素溶解于溶劑中，所以提取率偏低。當(dāng)提取溶劑增加時(shí)，在溶劑浸泡下火棘果粉末能在短時(shí)間被微波破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使原花青素能被快速溶解到溶劑中。綜上所述，選取40、50、60 mL/g水料比作為正交試驗(yàn)考察水平。

2.2.3 提取率受微波功率的影響情況

分別按140 W、280 W、420 W、560 W、700 W的功率進(jìn)行提取，結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波功率與提取率的關(guān)系

從圖4看出，提取工藝中微波功率的不同會(huì)造成提取率的變化。當(dāng)功率不斷增加時(shí)，火棘果原花青素提取率先不斷增加，然后逐漸降低。當(dāng)功率為420 W時(shí)，原花青素提取率為5.02 mg/g達(dá)到最大值?？赡苁请S微波功率增大，能量增大，有利于原花青素的擴(kuò)散、溶出；當(dāng)功率過大時(shí)，體系溫度過高，導(dǎo)致原料可能發(fā)生化學(xué)變化，產(chǎn)生雜質(zhì)過多。此外，高溫會(huì)造成原花青素?zé)峤到?，使提取率降低。綜上所述，選取微波功率280 W、420 W、560 W為正交試驗(yàn)考察水平。

2.2.4 提取率受微波時(shí)間的影響情況

按照20 s、40 s、60 s、80 s、100 s微波加熱進(jìn)行原花青素的提取，結(jié)果見圖5。

圖5 微波時(shí)間與提取率的關(guān)系

從圖5看出，微波時(shí)間影響火棘果原花青素的提取。隨著時(shí)間增長，火棘果原花青素提取率先呈現(xiàn)不斷增加趨勢(shì)，然后逐漸減少。當(dāng)提取時(shí)間為60 s時(shí)，提取率為4.62 mg/g達(dá)到最大值?？赡芏虝r(shí)提取不利于提取物從細(xì)胞中溶出，當(dāng)微波60 s時(shí)，火棘果果肉細(xì)胞內(nèi)外兩部分有效成分濃度接近于達(dá)到平衡狀態(tài)，故提取效果最佳。而繼續(xù)延長提取時(shí)間又會(huì)使溶出的原花青素的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)改變，提取率再次下降。綜上所述，選取提取時(shí)間40 s、60 s、80 s為正交試驗(yàn)考察水平。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與驗(yàn)證

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

通過R值比較各因素對(duì)火棘果提取物原花青素提取率的影響關(guān)系為A＞B＞D＞C，即乙醇濃度＞水料比＞時(shí)間＞功率。說明乙醇濃度對(duì)火棘果原花青素提取率的影響最大，水料比其次，提取率受時(shí)間和功率的影響相對(duì)較小。比較k值大小，得最佳提取組合為（A2B1C3D3）：乙醇濃度85%、水料比40 mL/g、微波功率560 W、微波時(shí)間80 s。在最優(yōu)條件下做三個(gè)平行試驗(yàn)，平均提取率為12.51 mg/g，提取率比表2最高提取率稍高。

2.4 抗氧化性結(jié)果

2.4.1 對(duì)OH·的清除能力

火棘果原花青素對(duì)OH·的清除結(jié)果見圖6。

圖6 原花青素提取物與OH·清除率的關(guān)系

從圖6看出，火棘果提取物與OH·的清除存在某種量效關(guān)系，在57～172 μg/mL范圍內(nèi)OH·的清除率隨火棘果原花青素濃度增加而逐漸增大。當(dāng)原花青素濃度為172 μg/mL時(shí)，清除率為65.11%。表明：火棘果提取物原花青素對(duì)OH·具有一定的清除能力。

2.4.2 對(duì)DPPH·的清除能力

火棘果原花青素對(duì)DPPH·的清除結(jié)果見圖7。

圖7 原花青素提取物與DPPH·清除率的關(guān)系

從圖7看出，火棘果原花青素在體外可使DPPH·被清除，當(dāng)濃度為6～30 μg/mL時(shí)，其濃度與清除率近似于呈現(xiàn)正相關(guān)，且DPPH·清除率與火棘果原花青素質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。當(dāng)原花青素濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，原花青素對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到了68%。結(jié)果說明火棘果提取物原花青素可使三分之一以上的DPPH·被清除，清除能力一般。

2.4.3 對(duì)ABTS+·的清除能力

火棘果原花青素對(duì)ABTS+·的清除結(jié)果見圖8。

圖8 原花青素提取物與ABTS+·清除率的關(guān)系

從圖8看出，當(dāng)原花青素濃度為4.80～12.49 μg/mL時(shí)，ABTS+·的清除率隨原花青素濃度增加而不斷增加，而且增長速度相對(duì)較快，在濃度為12.49 μg/mL時(shí)，清除率高達(dá)94%。因此，火棘果原花青素對(duì)ABTS+·的清除能力非常強(qiáng)，適用于陽離子自由基豐富的體系。通過三種自由基清除試驗(yàn)可看出，火棘果提取的原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基能力，具備了作為食品中天然抗氧化劑的可能。

2.4.4 對(duì)金屬離子的螯合能力

火棘果原花青素對(duì)鐵離子的螯合率結(jié)果見圖9。

圖9 原花青素提取物對(duì)金屬螯合能力的影響

由圖9可知，火棘果提取物原花青素濃度在91.8～150 μg/mL范圍內(nèi)，螯合率隨原花青素濃度增加而不斷增加，小于110 μg/mL時(shí)增長趨勢(shì)相對(duì)較緩慢，在110～150 μg/mL范圍內(nèi)增長較快，濃度為153 μg/mL時(shí)，螯合率達(dá)到21.97%?？赡苡捎谔崛∥镌ㄇ嗨貪舛仍黾?，體系所含有效濃度增加，進(jìn)而金屬離子與原花青素碰撞、結(jié)合的幾率增加，最終導(dǎo)致螯合率隨濃度呈現(xiàn)一定的增長趨勢(shì)。結(jié)果說明火棘果提取物原花青素?fù)碛幸欢ǖ尿夏芰ΓF離子的鰲合作用較差，不大明顯。

2.4.5 總抗氧化活性分析

可用測(cè)定綠色Mo5+磷酸鹽的吸光度大小間接判斷原花青素的總抗氧化性，結(jié)果如圖10所示。

圖10 原花青素提取物與抗氧化能力的關(guān)系

從圖10看出，當(dāng)原花青素濃度為74～223 μg/mL時(shí)，原花青素濃度與生成物質(zhì)吸光度趨近于線性正相關(guān)，在濃度為223 μg/mL時(shí)，Mo5+磷酸鹽吸光度達(dá)到0.782，再次表明火棘果提取物原花青素存在一定抗氧化活性，且對(duì)ABTS+·的清除最顯著。

2.4.6 還原能力的分析

采用普魯士藍(lán)法表征原花青素的還原能力：鐵氰化鉀與火棘果提取物原花青素反應(yīng)生成亞鐵氰化鐵。其生成量越多，顏色越明顯，提取物還原能力也越強(qiáng)。結(jié)果見圖11。

圖11 原花青素提取物對(duì)還原能力的影響

從圖11看出，當(dāng)火棘果原花青素濃度在37～112 μg/mL時(shí)，吸光度隨原花青素含量增加而呈現(xiàn)增大，并在原花青素濃度為112 μg/mL時(shí)，吸光度達(dá)到0.751。結(jié)果表明：火棘果原花青素濃度與普魯士藍(lán)生成量呈一定的量效關(guān)系，原花青素還原性與濃度有關(guān)。

3 結(jié)論與展望

以微波輔助法提取火棘果中原花青素，最佳提取條件為：微波時(shí)間80 s、功率560 W、水料比40（mL/g）、乙醇濃度85%，由此條件下得火棘果原花青素提取率為12.51 mg/g。然后采用6種常用抗氧化活性的檢測(cè)方法：OH·、DPPH·、ABTS+·、金屬螯合能力、普魯士藍(lán)法、鉬酸銨法分別對(duì)火棘果原花青素提取物進(jìn)行抗氧化性質(zhì)研究。結(jié)果顯示火棘果原花青素具有多種抗氧化活性，且與濃度呈正向量效關(guān)系。其中，火棘果原花青素對(duì)ABTS+·效果最明顯，當(dāng)原花青素濃度為12.49 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)94%。為了更好地實(shí)現(xiàn)火棘果的高值轉(zhuǎn)化與利用，后續(xù)可將原花青素純化，然后作為抗氧化劑應(yīng)用于某一具體的食品體系中，比較與常見抗氧劑如Vc和BHT性能的差異，從而使提取物更符合應(yīng)用理念。