過表達(dá)miR-126對(duì)急性呼吸窘迫綜合征模型大鼠右心功能的影響①

龍光文 張 謙 楊秀林 吉春玲 董?？担ㄙF州省人民醫(yī)院急診內(nèi)科，貴陽 550002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床上常見的急危重癥，以頑固性低氧血癥、呼吸窘迫為臨床表現(xiàn)，肺泡毛細(xì)血管通透性增加、透明膜形成為病理生理改變的臨床綜合征［1］。隨著對(duì)ARDS病理生理改變的再認(rèn)識(shí)，右心功能在ARDS發(fā)生發(fā)展中的變化引起了關(guān)注，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)ARDS患者不僅會(huì)出現(xiàn)肺損傷，還會(huì)出現(xiàn)循環(huán)損傷，導(dǎo)致右心功能不全以及急性肺源性心臟病的發(fā)生［2-3］。近年來報(bào)道m(xù)iR-126參與多種疾病的炎癥、免疫及肺臟損傷的調(diào)控，其在ARDS相關(guān)患者中低表達(dá)，高表達(dá)可以改善ARDS相關(guān)肺損傷，可作為ARDS診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物［4-6］。同時(shí)研究也顯示，miR-126還具有改善心功能的作用［7-8］，但miR-126對(duì)ARDS相關(guān)心功能障礙是否有改善作用目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過氣道內(nèi)滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制備ARDS相關(guān)右心功能障礙大鼠模型，探討miR-126在ARDS模型大鼠心肌組織中的表達(dá)變化及過表達(dá)miR-126對(duì)模型大鼠右心功能的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，鼠齡6～7周，體質(zhì)量（220±10）g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（黔）2018-0001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃、濕度40%～70%，自由進(jìn)食飲水，每日光照12 h。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器miR-126激動(dòng)劑（agomir）及其陰性對(duì)照（agomir NC）購自廣州銳博生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海碧云天公司；心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、肌紅蛋白（Mb）、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和GAPDH抗體購自Proteintech公司。血?dú)夥治鰞x（Rapidlab 348）購自德國BD公司；多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax Paradigm）購自上海美谷分子儀器；超聲診斷儀（Vivid Dimension 7）購自美國通用公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模與分組60只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Model組）、agomir陰性對(duì)照組（agomir-NC組）和miR-126 agomir組（agomir組），每組15只。其中agomir-NC組和agomir組在造模前24 h，經(jīng)尾靜脈注射agomir-NC或miR-126 agomir（10 nmol/只，200μl），Sham組和Model組注射等量生理鹽水。采用頸部氣管滴注10 mg/kg LPS建立ARDS模型［9］，以動(dòng)脈血液氧合指數(shù)（OI）＜200 mmHg為造模成功標(biāo)準(zhǔn)［10］。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)估右心功能 造模成功后24 h，采用超聲心動(dòng)圖于大鼠胸前右心長軸上測(cè)量三尖瓣環(huán)收縮期位移（TAPSE）、右心面積變化分?jǐn)?shù)（FAC）、肺動(dòng)脈加速時(shí)間（PAAT）和肺動(dòng)脈收縮壓（PASP），均測(cè)量3次后取均值。

1.2.3 動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（OI）測(cè)定 造模成功后24 h，分離大鼠股動(dòng)脈，取股動(dòng)脈血1 ml，立即進(jìn)行血?dú)夥治?，記錄?dòng)脈血氧分壓（PaO2），根據(jù)吸入氣中的氧濃度分?jǐn)?shù)（FiO2）計(jì)算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.2.4 HE染色觀察肺及右心組織病理學(xué)變化取大鼠右肺中葉和心臟右心室，10%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備4μm石蠟切片進(jìn)行HE染色。于光鏡下觀察肺組織和右心組織病理學(xué)改變。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)血清中心肌損傷標(biāo)志物及心肌組織中炎癥因子水平 收集大鼠下腔靜脈血，3 000 r/min離心15 min取血清；同時(shí)收集心肌組織，用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨制備心肌組織勻漿，充分裂解后10 000 r/min離心20 min取上清。按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb以及心肌組織中IL-1β和IL-18含量。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)心肌組織中miR-126表達(dá)水平以及NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA水平 取適量心肌組織，采用Trizol法提取各樣本總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA合成為cDNA，然后以cDNA為模板，取10μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6和GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot檢測(cè)心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)水平 取各組心肌組織100 mg，加入預(yù)冷的組織裂解液1 ml，在冰浴中超聲破碎勻漿后離心取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。向SDS-PAGE通道中加入等體積蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBS洗滌3次，加入一抗NLRP3、ASC、caspase-1和GAPDH（1∶1 000）一起孵育過夜。再用TBST漂洗40 min，分為3次漂洗，加入HRP標(biāo)記二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影、定影，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的影響 如表2所示，與Sham組比較，Model組大鼠TAPSE、FAC和PAAT顯著減少，PASP顯著升高（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠TAPSE、FAC和PAAT顯著升高，PASP顯著減少（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠右心功能參數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of functional parameters of right heart among groups（±s）

表2 各組大鼠右心功能參數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of functional parameters of right heart among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups TAPSE/mm FAC（%）PAAT/ms PASP/mmHg Sham Model Agomir-NC Agomir 3.44±0.32 2.28±0.201）2.21±0.16 3.14±0.262）57.73±5.03 32.88±2.341）33.00±1.71 52.90±3.452）32.55±3.07 22.43±1.171）21.01±1.00 29.65±1.342）28.66±1.79 64.07±3.221）65.00±2.63 35.54±1.402）

2.2 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠動(dòng)脈血氧分壓和氧合指數(shù)的影響 如表3所示，與Sham組比較，Model組大鼠動(dòng)脈PaO2和OI值顯著降低（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠PaO2和OI值顯著增加（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠動(dòng)脈PaO2和OI比較（±s）Tab.3 Comparison of PaO2 and OI in arteries among groups（±s）

表3 各組大鼠動(dòng)脈PaO2和OI比較（±s）Tab.3 Comparison of PaO2 and OI in arteries among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model agomir-NC agomir PaO2/mmHg 103.00±7.01 60.49±2.681）61.22±3.07 93.55±4.462）OI/mmHg 503.00±12.77 168.00±8.451）172.00±6.00 377.86±10.932）

2.3 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠心肌組織中miRNA-126表達(dá)水平的影響 如圖1所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中miRNA-126表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠心肌組織中miRNA-126表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織中miR-126表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of miR-126 expression levels in myocardial tissue of rats among groups

2.4 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠肺組織和右心肌組織病理學(xué)的影響 如圖2所示，Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，未見明顯異常；Model組和agomir-NC組大鼠肺部充血水腫、形態(tài)紊亂，肺泡間質(zhì)增厚，肺不張且有透明膜形成，同時(shí)伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；agomir組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯恢復(fù)，肺泡出血減少，肺泡腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。Sham組大鼠右心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤；Model組和agomir-NC組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，排列紊亂，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；agomir組大鼠心肌細(xì)胞損傷程度減輕，細(xì)胞排列大致有序，伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤。

圖2 各組大鼠肺組織和心肌組織病理學(xué)觀察（HE染色，×200）Fig.2 Histopathological observation of lung tissue and myocardial tissue among groups（HE staining，×200）

2.5 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物含量的影響 如表4所示，與Sham組比較，Model組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著增加（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著減少（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比較（±s）Tab.4 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum among groups（±s）

表4 各組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比較（±s）Tab.4 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model Agomir-NC Agomir cTnⅠ/（ng·ml-1）0.66±0.02 2.58±0.101）2.53±0.11 1.04±0.092）CK-MB/（U·L-1）26.50±4.61 128.46±9.501）124.33±8.60 56.66±3.062）Mb/（ng·ml-1）37.57±3.44 166.40±7.761）164.34±6.89 65.57±2.562）

2.6 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠心肌組織中炎癥因子含量的影響 如表5所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含量顯著增加（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含 量顯著減少（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含量比較（±s）Tab.5 Comparison of contents of IL-1βand IL-18 in myocardial tissue among groups（±s）

表5 各組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含量比較（±s）Tab.5 Comparison of contents of IL-1βand IL-18 in myocardial tissue among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model Agomir-NC Agomir IL-1β/（pg·ml-1）18.83±2.56 90.65±5.501）87.64±4.00 34.99±2.932）IL-18/（pg·ml-1）36.60±2.39 119.46±6.781）115.06±5.30 65.49±2.002）

2.7 過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS大鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1表達(dá)水平的影響 如圖3所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of mRNA and protein expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 of myocardial tissue among groups

3 討論

miRNAs是一類進(jìn)化上高度保守的非編碼小分子RNA，早期對(duì)其研究主要集中在機(jī)體發(fā)育的調(diào)控及腫瘤形成方面，但近些年來的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs能特異性表達(dá)于心肌細(xì)胞，參與心肌重塑、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程［11］。miR-126是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)miRNA，存在于哺乳動(dòng)物內(nèi)血管豐富的組織中，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的生物合成、血管發(fā)育和維持血管的完整性，是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有改善心功能的作用。成力等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子A參與先天性心臟病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓發(fā)??；譚順林等［13］研究指出，慢性心力衰竭患者血清miR-126水平異常表達(dá)，其可能參與了慢性心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展；高威等［14］提出，過表達(dá)miR-126能顯著抑制急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡。但miR-126對(duì)ARDS相關(guān)心功能障礙是否有改善作用目前未知，本研究通過頸部氣管滴注LPS構(gòu)建ARDS大鼠模型，經(jīng)尾靜脈注射miR-126激動(dòng)劑探討miR-126對(duì)ARDS大鼠右心功能的保護(hù)作用及具體機(jī)制，研究結(jié)果顯示，miR-126在ARDS模型大鼠心肌組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR-126可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化來改善ARDS大鼠右心功能障礙。

本研究通過氣管滴注LPS的方法建立大鼠ARDS模型，結(jié)果顯示，模型大鼠動(dòng)脈OI＜200 mmHg，同時(shí)HE染色結(jié)果顯示大鼠肺部充血水腫、形態(tài)紊亂，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，伴有肺不張、透明膜形成等ARDS的典型病理學(xué)改變，提示ARDS模型制備成功，與馬紹磊等［15］研究結(jié)果相符。超聲心動(dòng)圖是評(píng)估右心功能的良好手段，本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)是探討出現(xiàn)ARDS時(shí)心功能的變化情況，并觀察過表達(dá)miR-126對(duì)ARDS時(shí)心臟功能的影響。肺動(dòng)脈高壓是右心功能障礙最常見的原因，PASP越高，提示肺動(dòng)脈壓力越高，PAAT縮短則提示肺血管阻力增加，肺動(dòng)脈壓力增高；TAPSE和FAC是反映右心室收縮功能的主要指標(biāo)，其值降低提示右室收縮功能減退。本研究結(jié)果顯示，ARDS大鼠的TAPSE、FAC和PAAT顯著減小，而PASP顯著增加，心肌組織HE染色結(jié)果也顯示，大鼠心肌細(xì)胞增大、排列紊亂，間質(zhì)有炎癥細(xì)胞聚集，說明ARDS在引起肺功能損傷的同時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致右心功能不全，與相關(guān)研究一致［15］。進(jìn)一步通過qRT-PCR法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中miR-126的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌組織中miR-126表達(dá)水平明顯降低，初步提示miR-126在ARDS相關(guān)心功能障礙方面可能發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證其具體作用，本研究通過尾靜脈注射的方式給模型大鼠注射miR-126激動(dòng)劑，結(jié)果顯示模型大鼠心肌組織中miR-126表達(dá)水平明顯上調(diào)，動(dòng)脈OI值回升，右心功能指標(biāo)得到明顯改善，同時(shí)心肌組織和肺組織病理性改變明顯減輕，提示過表達(dá)miR-126可改善ARDS大鼠心功能。

NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是機(jī)體固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，通常情況下機(jī)體NLRP3活性處于抑制狀態(tài)，當(dāng)NLRP3受外界刺激被激活時(shí)，活化的效應(yīng)蛋白caspase-1可促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟與釋放，造成組織損傷并加劇炎性疾病的發(fā)展。心肌組織的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致右心功能障礙的主要原因之一，這可能是右心功能障礙的基礎(chǔ)［16］。cTnⅠ、CK-MB和Mb為心肌損傷特異性標(biāo)志物，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)其在血液中的含量會(huì)異常升高［17］。為進(jìn)一步探究miR-126改善ARDS大鼠心功能的作用機(jī)制，本研究對(duì)大鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平、炎癥因子以及心肌損傷標(biāo)志物含量進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，模型大鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及IL-1β、IL-18、cTnⅠ、CK-MB和Mb含量均顯著增加，過表達(dá)miR-126可顯著降低以上指標(biāo)在心肌組織中的含量，提示miR-126可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化，抑制炎癥因子釋放，從而減輕ARDS大鼠心肌損傷，發(fā)揮其心功能保護(hù)作用。

綜上所述，本研究從超聲心動(dòng)圖、心肌組織病理學(xué)改變、蛋白分子水平及心肌組織炎癥指標(biāo)等不同層面，證實(shí)過表達(dá)miR-126可通過抑制NLRP3炎癥小體活化、減輕炎癥反應(yīng)對(duì)ARDS相關(guān)右心功能障礙發(fā)揮保護(hù)作用。