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    粗壯潤(rùn)楠化學(xué)成分及其活性研究

    2022-11-16 08:49:24里艷茹黃勝男尋園程林友謝百波中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)北京100050北京慧寶源生物技術(shù)股份有限公司北京1006中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院南區(qū)北京10618廣西慧寶源醫(yī)藥科技有限公司廣西欽州55008
    中南藥學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:苯甲酸甲氧基石油醚

    里艷茹,黃勝男,尋園,程林友,謝百波,*(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,天然活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn),北京 100050;.北京慧寶源生物技術(shù)股份有限公司,北京 1006;.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院南區(qū),北京 10618;.廣西慧寶源醫(yī)藥科技有限公司,廣西 欽州 55008)

    潤(rùn)楠屬(Machilus)植物為常綠喬木或灌木,在全世界約有100 余種,分布于亞洲東南部和東部的熱帶、亞熱帶,中國(guó)西南部及印度為其主要產(chǎn)地。我國(guó)約有68 種3 變種,產(chǎn)于長(zhǎng)江流域及以南各省區(qū)和山東東部,以云南和華南為主要產(chǎn)地,是當(dāng)?shù)刂饕慕?jīng)濟(jì)林木[1]。粗壯潤(rùn)楠為高大喬木,樹(shù)皮粗糙,灰黑色。我國(guó)主要分布于云南南部、貴州南部、廣西、廣東[2]。潤(rùn)楠屬植物資源豐富,在我國(guó)民間作為草藥廣泛使用,具有溫中順氣、舒筋活血、消腫止痛等較強(qiáng)的生物活性,治療各種皮膚病和風(fēng)濕性疾病,臨床上用于治療胃呆食少、腹脹、腹瀉、扭挫傷等[3]。前文主要報(bào)道了粗壯潤(rùn)楠中的木脂素和苷類化合物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定及其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和保肝活性[4-6]。本文繼續(xù)報(bào)道該植物化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定及其活性篩選結(jié)果。

    1 材料

    Perkin-Elmer 343 型旋光測(cè)定儀;美國(guó)Varian 公司Mercury-300、Mercury-400、Inova-500 或SYS-600 核磁共振儀(測(cè)定溫度297 K,以溶劑峰信號(hào)作為參照);Micromass Autospec-Ultima ETOF 型質(zhì)譜儀和 Q-Trap LC/MS/MS(Turbo Ionspray source)型質(zhì)譜儀(Waters 公司);R-205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司);閃式快速分離系統(tǒng)(AB SCIEX 公司);Waters 600 高效液相色譜儀和Agilent HP 1100、1200型高效液相色譜儀;柱色譜硅膠(200~300目)(青島海洋化工廠);高效制備薄層硅膠板(HSGF)(煙臺(tái)江友硅膠發(fā)展有限公司);Sephadex LH-20(瑞典Amersham Pharmacia 公司);MCI Gel CHP-20 樹(shù)脂(70~150 μm)(日本三菱公司);Thermo SKANIT SOFTWARE 3.2(Thermo 公司);DMEM及馬血清(Gibco 公司);胎牛血清(Hyclone 公司);細(xì)胞株P(guān)C12 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

    植物樣品采自廣西壯族自治區(qū)大瑤山,經(jīng)廣西林業(yè)局龍光日工程師鑒定為粗壯潤(rùn)楠Machilus robusta,標(biāo)本現(xiàn)存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所標(biāo)本室,標(biāo)本號(hào)為(No.041)。

    2 提取與分離

    稱取粉碎干燥的粗壯潤(rùn)楠莖皮5.3 kg,用95%乙醇45 L 于室溫浸漬提取3 次,每次48 h。提取液減壓濃縮,得干浸膏535.0 g,混懸于2000 mL 水中,用乙酸乙酯萃?。?×2000 mL),乙酸乙酯萃取部分(261.0 g)進(jìn)行硅膠柱(100~200目,1000 g,8 cm×100 cm)色譜分離,用石油醚-丙酮(100∶0~0∶100)梯度洗脫,最后用甲醇洗脫;洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測(cè),TLC 暗斑在紫外燈254 nm 或365 nm 下觀察,通過(guò)碘熏或噴5%硫酸乙醇溶液后加熱顯色檢測(cè)。合并組成相似的流分,回收溶劑得到9 個(gè)部分(Fr.A~Fr.I)。

    Fr.B(石油醚-丙酮=20∶1 洗脫)部分析出紅色針晶,經(jīng)過(guò)濾,用石油醚反復(fù)洗滌得到化合物6(2 mg)。剩余Fr.B 母液減壓蒸干(17.5 g),經(jīng)硅膠柱(200~300 目,150 g)色譜分離,石油醚-乙酸乙酯(100∶5~100∶20)梯度洗脫得到5 個(gè)洗脫部分(B1~B5),B1經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇=5∶5∶1 洗脫)分離純化析出白色結(jié)晶,經(jīng)石油醚-丙酮重結(jié)晶純化得化合物14(5053 mg),B2硅膠柱色譜分離(石油醚-乙酸乙酯=50∶1 洗脫),經(jīng)反相HPLC 半制備色譜(MeOH-H2O=91∶9)洗脫,分離純化得化合物10(2.5 mg)和11(1.6 mg)。B3部分經(jīng)反相Flash 柱色譜分離,50%~100%甲醇水溶液洗脫得到6 個(gè)亞組分(B3-1~B3-6)。B3-2部分析出白色結(jié)晶,經(jīng)石油醚-丙酮重結(jié)晶純化得化合物15(25 mg)和16(20 mg)。B4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇=5∶5∶1 洗脫)分離純化,再經(jīng)反相HPLC 半制備(C18,5 μm,10 mm×250 mm)色譜,以MeOH-H2O(89∶11)為流動(dòng)相,制備純化得到化合物8(2 mg)。B5經(jīng)硅膠柱色譜 [氯仿-丙酮(0%~100%)]洗脫,得到B5-1~B5-4。B5-2經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇=5∶5∶1 洗脫)分離純化,得到B5-2-1~B5-2-11,B5-2-3再經(jīng)反相HPLC 半制備(C18,5 μm,10 mm×250 mm) 色譜,以MeOH-H2O(93∶7)為流動(dòng)相,制備純化得到化合物3(1.5 mg)和4(2 mg)。Fr.C(70 g)經(jīng)MCI 凝膠柱色譜(以30%~100%甲醇梯度洗脫),除去色素,分成兩部分C1和C2,C2部分經(jīng)硅膠柱色譜分離(石油醚-乙酸乙酯=50∶1 洗脫),經(jīng)反相HPLC 半制備色譜(MeOH-H2O=95∶5 洗脫)分離純化得化合物1(1.0 mg)和2(3.0 mg)。

    Fr.D(2.0 g)經(jīng)MCI 凝膠柱色譜(30%~100%甲醇梯度洗脫),分成6 個(gè)部分(D1~D6)。D5部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯體系洗脫)和反相HPLC 半制備色譜(MeOH-H2O系統(tǒng)洗脫)分離純化得到化合物5(2.0 mg)。

    Fr.E(15.0 g)經(jīng)MCI 凝膠柱色譜(10%~100%甲醇梯度洗脫)得到5 個(gè)部分(E1~E5)。E1部分經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇=2∶2∶1)洗脫,分離純化得到化合物19(4.1 mg)。E2部分再經(jīng)反相Flash 柱色譜分離,30%~70%甲醇水溶液洗脫得到3 個(gè)洗脫部分(E2-1~E2-3),E2-1經(jīng)反相HPLC 半制備(C18,5 μm,10 mm×250×250 mm)色譜,以MeOHH2O=8∶2 為流動(dòng)相,制備純化得到化合物12(1.0 mg)和13(1.1 mg)。E4反復(fù)經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇=2∶2∶1)洗脫,得到化合物17(4.5 mg)和18(3.0 mg)。E5經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇=2∶2∶1)洗脫,再經(jīng)反相HPLC 半制備色譜(MeOH-H2O=58∶42 洗脫)分離純化得到化合物9(1.1 mg)。

    Fr.F(25.0 g)經(jīng)MCI 凝膠柱色譜(10%~100%甲醇梯度洗脫),分成5 個(gè)部分(F1~F5)。F3部分經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(氯仿-甲醇=5∶1)洗脫,分離純化得到化合物7(5.0 mg)。

    3 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1:白色結(jié)晶(氯仿);ESI-MSm/z465 [M+Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ4.84(2H,s,H-26a,H-27a),4.56(2H,s,H-26b,H-27b),3.25(2H,dd,J=11.5,4.0 Hz,H-3 和H-21),2.41(2H,d,J=13.0 Hz,H-5 和H-15),1.97(2H,dt,J=13.0,5.0 Hz,H-7 和H-15),1.75(2H,m,H-6 和H-16),1.72(2H,m,H-1 和H-19),1.67(2H,m,H-2 和H-20),1.57(2H,m,H-10 和H-18),1.55(2H,m,H-6 和H-16),1.53(2H,m,H-11 和H-12),1.38(2H,m,H-1 和H-19),1.11(2H,m,H-5和H-17),0.99(2H,s,H-23 和H-30),0.76(2H,s,H-24 和H-29),0.64(2H,s,H-25 和H-28);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ37.0(C-1和C-19),28.0(C-2 和C-20),78.9(C-3 和C-21),39.1(C-4 和C-22),54.7(C-5 和C-17),24.0(C-6 和C-16),38.3(C-7 和C-15),148.4(C-8 和C-14),57.6(C-9 和C-13),39.3(C-10和C-18),22.6(C-11 和C-12),28.3(C-23 和C-30),15.4(C-24 和C-29),14.5(C-25 和C-28),106.7(C-26 和C-27)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的α-芒柄花萜醇數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物1 為α-芒柄花萜醇。

    化合物2:白色無(wú)定形粉末;(-)-ESIMSm/z455 [M-H]-;1H NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ5.49(1H,brs,H-12),3.46(1H,m,H-3),2.64(1H,m,H-18),1.24(3H,s,H-27),1.23(3H,s,H-26),1.05(3H,s,H-23),1.00(3H,d,J=6.5 Hz,H-30),1.00(3H,s,H-25),0.95(3H,d,J=6.0 Hz,H-29),0.88(3H,s,H-24);13C NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ39.2(C-1),28.0(C-2),77.9(C-3),38.9(C-4),55.6(C-5),18.6(C-6),33.4(C-7),39.8(C-8),47.9(C-9),39.2(C-10),17.3(C-11),125.4(C-12),139.1(C-13),42.3(C-14),28.6(C-15),24.7(C-16),47.9(C-17),53.4(C-18),39.3(C-19),37.3(C-20),30.9(C-21),37.1(C-22),28.5(C-23),16.4(C-24),15.5(C-25),17.3(C-26),23.7(C-27),179.9(C-28),23.4(C-29),21.2(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的熊果酸的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物2 為熊果酸。

    化合物3:白色結(jié)晶(氯仿);ESI-MSm/z455 [M-H]-;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ3.19(1H,dd,J=11.0,4.5 Hz,H-3),3.00(1H,ddd,J=10.0,10.0,6.0 Hz,H-19),0.94(3H,s,H-23),0.75(3H,s,H-24),0.82(3H,s,H-25),0.97(3H,s,H-26),0.98(3H,s,H-27),4.61,4.74(each,1H,brs,H2-29),1.67(3H,s,H-30);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ38.8(C-1),27.4(C-2),79.0(C-3),38.7(C-4),55.3(C-5),19.4(C-6),34.3(C-7),40.7(C-8),50.5(C-9),37.2(C-10),20.8(C-11),25.5(C-12),38.4(C-13),42.4(C-14),30.5(C-15),32.1(C-16),56.2(C-17),46.9(C-18),49.3(C-19),150.4(C-20),29.7(C-21),37.0(C-22),28.0(C-23),15.3(C-24),16.0(C-25),16.1(C-26),14.7(C-27),180.1(C-28),18.2(C-29),109.7(C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的白樺脂酸數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物3 為白樺脂酸。

    化合物4: 白色晶體(丙酮),1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ5.14(1H,t,J=3.5 Hz,H-12),3.53(1H,q,J=11.0 Hz,H-28),3.24(1H,dd,J=11.0,5.0 Hz,H-3),3.19(1H,d,J=11.0 Hz,H-28),1.10(3H,s,Me-27),1.00(3H,s,Me-26),0.98(3H,s,Me-25),0.96(3H,s,Me-23),0.94(3H,d,J=6.0 Hz,Me-29),0.81(3H,d,J=5.5 Hz,Me-30),0.79(3H,s,Me-24);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ38.8(C-1),27.2(C-2),79.0(C-3),38.8(C-4),55.2(C-5),18.3(C-6),32.8(C-7),40.0(C-8),47.7(C-9),36.9(C-10),23.4(C-11),125.0(C-12),138.7(C-13),42.0(C-14),26.0(C-15),23.3(C-16),38.0(C-17),54.0(C-18),39.4(C-19),39.4(C-20),30.6(C-21),35.2(C-22),28.1(C-23),15.6(C-24),15.7(C-25),17.3(C-26),23.3(C-27),69.9(C-28),21.3(C-29),16.8(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的熊果醇數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物4 為熊果醇。

    化合物5:無(wú)色粉末,ESI-MSm/z:571 [M+H]+,593 [M+Na]+,569 [M-H]-;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ6.30(1H,d,J=1.8 Hz,H-4'),6.25(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.22(2H,d,J=1.8 Hz,H-2'和H-6'),6.19(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),5.25(1H,m,H-14'),2.88(2H,m,H-7),2.49(2H,m,H-7'),1.67~1.74(4H,m,H-8 和H-8'),1.39~1.60(26H,m,H-9~H-16 和H-9'~H-12'),1.33(2H,m,H-16'),1.31(2H,m,H-13'),0.88(2H,t,J=7.2 Hz,H-17'),0.85(2H,t,J=7.2 Hz,H-17);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ149.0(C-1),105.4(C-2),160.1(C-3),101.4(C-4),165.2(C-5),101.4(C-6),34.2(C-7),32.2(C-8),28.8~30.1(C-9~C-14 和C-9'~C-12'),31.9(C-15),22.7(C-16),13.9(C-17),171.7(C=O),146.0(C-1'),110.8(C-2'和C-6'),156.6(C-3'和C-5'),108.0(C-4'),36.6(C-7'),30.8(C-8'),25.3(C-13'),75.8(C-14'),37.0(C-15'),18.8(C-16'),14.1(C-17')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的8-(3,5-二羥基苯基)-1-丙基辛醇2,4-二羥基-6-十一烷基苯甲酸酯的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物5 為8-(3,5-二羥基苯基)-1-丙基辛醇2,4-二羥基-6-十一烷基苯甲酸酯。

    化合物6:紅色針晶;ESI-MSm/z:283 [MH]-;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ12.31(1H,s,OH),12.12(1H,s,OH),7.63(1H,s,4-H),7.37(1H,d,J=2.5 Hz,5-H),7.08(1H,s,2-H),6.69(1H,d,J=2.5 Hz,7-H),3.94(3H,s,OMe),2.45(3H,s,Ar-CH3)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ165.2(C-1),124.5(C-2),148.4(C-3),121.3(C-4),133.2(C-4a),110.3(C-5),162.5(C-6),106.8(C-7),166.5(C-8),108.2(C-8a),190.8(C-9),113.7(C-9a),182.0(C-10),135.2(C-10a),56.1(OMe),22.2(Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道的大黃素甲醚基本一致,確定化合物6 為大黃素甲醚。

    化合物7:白色針狀結(jié)晶;ESI-MSm/z433 [M+Na]+;在3 種不同展開(kāi)溶劑(氯仿-乙酸乙酯=4∶1,Rf值為0.5;正己烷-乙酸乙酯=2∶1,Rf值為0.5;氯仿-甲醇=40∶1,Rf值為0.7)系統(tǒng)中,其薄層色譜Rf值與對(duì)照品β-谷甾醇一致,確定化合物7 為β-谷甾醇。

    化合物8:無(wú)色油狀物;[R]20D+11(c 0.03,CHCl3);ESI-MSm/z261 [M+Na]+,237 [M-H]-;1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ6.82(1H,d,J=1.5 Hz,H-2),6.89(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.78(1H,dd,J=8.0,1.5 Hz,H-6),4.11(1H,d,J=10.0 Hz,H-7),2.84(1H,dq,J=7.5,10.0 Hz,H-8),2.26(3H,s,H3-9'),0.77(3H,d,J=6.5 Hz,H3-9),3.91(3H,s,OMe-3),3.10(3H,s,OMe-7);13C NMR(125 MHz,acetone-d6)δ212.1(C-8'),146.9(C-3),145.6(C-4),131.2(C-1),121.2(C-6),113.9(C-5),108.9(C-2),86.3(C-7),56.5(OMe-3),56.0(OMe),53.5(C-8),29.9(C-9'),13.7(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的(+)-(7S,8R)-4-羥基-3,7-二甲氧基-1',2',3',4',5',6',7'-降七碳木脂烷-8'-酮的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物8為(+)-(7S,8R)-4-羥基-3,7-二甲氧基-1',2',3',4',5',6',7'-降七碳木脂烷-8'-酮。

    化合物9:無(wú)色膠狀物;(+)-ESI-MSm/z245[M+Na]+;1H NMR(500 MHz,acetone-d6)δ7.05(1H,d,J=15.1 Hz,H-7),6.44(1H,d,J=15.1 Hz,H-8),5.89(1H,s,H-4),2.62(1H,d,J=18.5 Hz,H-2a),2.10(1H,d,J=18.5 Hz,H-2b),2.40(3H,s,H3-10),1.85(3H,s,H3-13),1.18(3H,s,H3-11),0.96(3H,s,H3-12);13C NMR(125 MHz,acetone-d6)δ42.0(C-1),50.2(C-2),196.9(C-3),127.9(C-4),167.4(C-5),79.6(C-6),136.9(C-7),131.6(C-8),201.2(C-9),24.5(C-10),23.8(C-11),23.5(C-12),19.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]中報(bào)道的(+)-去氫催吐蘿芙木醇數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物9為(+)-去氫催吐蘿芙木醇。

    化合物10:白色粉末,ESI-MS 223 [M+H]+,245 [M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ1.33(t,J=7.2 Hz,3H,CH3),3.93(s,3H,ArOCH3),4.26(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),5.83(s,1H,ArOH),6.29(d,J=16.2 Hz,1H,ArCH=CH),6.92(d,J=8.4 Hz,1H,6-ArH),7.08(dd,J=8.4,1.8 Hz,1H,5-ArH),7.03(d,J=1.8 Hz,1H,2-ArH),7.61(d,J=16.2 Hz,ArCH=CH);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ125.6(C-1),114.7(C-2),148.5(C-3),146.7(C-4),115.7(C-5),123.0(C-6),144.7(C-7),109.3(C-8),178.5(C-9),60.4(C-10),14.4(C-11),55.9(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道的3-羥基-4-甲氧基苯丙烯酸乙酯的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物10 為3-羥基-4-甲氧基苯丙烯酸乙酯。

    化合物11:白色粉末;ESI-MS 223 [M+H]+,245 [M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ1.33(t,J=7.2 Hz,3H,CH3),3.93(s,3H,ArOCH3),4.26(q,J=7.2 Hz,2H,CH2),5.83(s,1H,ArOH),6.29(d,J=16.2 Hz,1H,ArCH=CH),6.92(d,J=8.4 Hz,1H,6-ArH),7.08(dd,J=8.4,1.8 Hz,1H,5-ArH),7.03(d,J=1.8 Hz,1H,2-ArH),7.61(d,J=16.2 Hz,ArCH=CH);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ127.1(C-1),115.7(C-2),147.9(C-3),146.7(C-4),114.7(C-5),123.0(C-6),144.6(C-7),109.3(C-8),168.0(C-9),60.3(C-10),55.9(-OCH3),14.4(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20-23]報(bào)道的4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸乙酯ethyl ferulate 的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物11 為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸乙酯。

    化合物12:白色針晶(丙酮);EIMS 176[M]+;1H NMR(300 MHz,acetone-d6)δ7.58(1H,d,J=9.0 Hz,H-4),7.26(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.22(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),6.60(1H,s,H-8),6.54(1H,d,J=9.0 Hz,H-3),3.58(3H,s,OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的7-甲氧基香豆素的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物12 為7-甲氧基香豆素。

    化合物13:黃色無(wú)定形固體;(+)-ESI-MSm/z223 [M+H]+,245 [M+Na]+;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ7.59(1H,d,J=9.6 Hz,H-4),6.28(1H,d,J=9.6 Hz,H-3),6.65(1H,s,H-8),3.94(3H,s,OMe-5),3.88(3H,s,OMe-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的5,7-二甲氧基-6-羥基香豆素的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物13 為5,7-二甲氧基-6-羥基香豆素。

    化合物14:白色針晶(氯仿);ESI-MSm/z197 [M-H]-;1H NMR(300 MHz,acetone-d6)δ7.37(2H,s,H-2,H-6),3.88(6H,s,OMe-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物14 為4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸。

    化合物15:白色針狀結(jié)晶(氯仿);(-)-ESIMSm/z121 [M-H]-;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ12.40(1H,brs,COOH),8.14(2H,d,J=7.5Hz,H-2,6),7.63(1H,m,H-4),7.49(2H,m,H-3,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物15 為苯甲酸。

    化合物16:白色無(wú)定型粉末;ESI-MSm/z123 [M+H]+,145 [M+Na]+,121 [M-H]-;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ9.88(1H,s,H-7),7.81(2H,d,J=8.0 Hz,H-2,H-6),6.95(2H,d,J=8.0 Hz,H-3,H-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道的對(duì)羥基苯甲醛的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物16 為對(duì)羥基苯甲醛。

    化合物17:白色無(wú)定型粉末;ESI-MSm/z139 [M+H]+,161 [M+Na]+;1H NMR(500 MHz,acetone-d6)δ8.08(1H,s,HO-6),7.03(2H,d,J=8.0 Hz,H-2,H-6),6.73(2H,d,J=8.0 Hz,H-3,H-5),3.66(2H,m,H-8),2.69(2H,t,J=7.5 Hz,H-7),3.57(1H,m,HO-8);13C NMR(125 MHz,acetone-d6)δ131.0(C-1),130.7(C-2,C-6),115.8(C-3,C-5),156.5(C-4),39.4(C-7),64.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的對(duì)羥基苯乙醇的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物17 為對(duì)羥基苯乙醇。

    化合物18:白色針狀結(jié)晶(丙酮);ESI-MSm/z153 [M-H]-;1H NMR(300 MHz,acetone-d6)δ10.8(1H,s,COOH),9.19(2H,s,OH),7.52(1H,d,J=1.2Hz,H-2),7.48(1H,dd,J=8.1,1.2 Hz,H-6),6.89(1H,d,J=8.1 Hz,H-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]報(bào)道3,4-二羥基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物18 為3,4-二羥基苯甲酸。

    化合物19:白色針狀結(jié)晶(氯仿);(-)-ESIMSm/z167 [M-H]-;1H NMR(300 MHz,acetone-d6)δ10.82(1H,brs,COOH),8.34(1H,brs,HO-3),7.59(1H,dd,J=8.5,1.5 Hz,H-6),7.55(1H,d,J=1.5 Hz,H-2),6.90(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),3.90(3H,s,OCH3);13C NMR(75 MHz,acetone-d6)δ124.8(C-1),115.5(C-2),148.0(C-3),152.0(C-4),113.4(C-5),122.8(C-6),167.4(C-7),56.3(OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]報(bào)道的3-羥基-4-甲氧基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物19 為3-羥基-4-甲氧基苯甲酸。

    各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

    圖1 各化合物的結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of compounds

    4 生物活性測(cè)定

    4.1 神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性篩選

    PC12 細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的96 孔板中,密度為每孔3.0×10 個(gè)。培養(yǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后,換液,對(duì)照組加入含5%胎牛血清、5%馬血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基,模型組加入終濃度為150 μmol·L-1MPP+的 DMEM 完全培養(yǎng)基,各給藥組在MPP+模型基礎(chǔ)上加入終濃度為1.0×10-5mol·L-1的化合物1~19(用DMSO配制);于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT(終濃度0.5 mg·mL-1)再培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀于570 nm 處測(cè)定吸光度(A)。細(xì)胞活力以相對(duì)保護(hù)率評(píng)價(jià)[32]。

    相對(duì)保護(hù)率(%)=[樣品組的OD(光密度)值-模型組OD值]/[對(duì)照組的OD值-模型組的OD值]×100%

    測(cè)定化合物1~19 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷保護(hù)的影響,結(jié)果表明,在1.0×10-5mol·L-1下,化合物9 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷顯示出一定的保護(hù)作用,其相對(duì)保護(hù)率為(76.60±10.67)%。與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    4.2 其他生物活性篩選

    與此同時(shí),對(duì)得到的單體化合物分別進(jìn)行了抗氧化[33]、人腫瘤細(xì)胞毒(HCT28、Bel-7402、BGC-823、A549 和A2780 細(xì)胞株)[34]、肝細(xì)胞保護(hù)[35]和抗人類免疫缺陷病毒(HIV)(VsVG/HIV模型)[36]等生物活性篩選。在相同濃度下,所有化合物在藥理模型篩選中均未顯示明顯活性。

    5 討論

    本研究對(duì)樟科植物粗壯潤(rùn)楠中的化學(xué)成分及其生物活性進(jìn)行探討。首次從該科中分離得到α-芒柄花萜醇和8-(3,5-二羥基苯基)-1-丙基辛醇2,4-二羥基-6-十一烷基苯甲酸酯。并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行生物活性篩選。在1.0×10-5mol·L-1下,(+)-去氫催吐蘿芙木醇(9)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷顯示出一定的保護(hù)作用,其相對(duì)保護(hù)率為(76.60±10.67)%。下一步應(yīng)通過(guò)更廣泛的生物活性及其作用機(jī)制的深入研究,明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點(diǎn),為后續(xù)臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù),促進(jìn)民間習(xí)用藥材粗壯潤(rùn)楠的藥學(xué)研究及資源開(kāi)發(fā)利用。

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