瑞格列奈在人肝微粒體中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及葛根素對(duì)其代謝的影響

何文娟，劉秀菊，孫倩，李丹，王淑梅（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

隨著人們生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率不斷攀升，成為繼心血管疾病和癌癥之后，威脅人類生命健康的第三大殺手[1]。葛根味甘、辛，性涼，具有解肌退熱、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的功效[2-3]。已有研究顯示，葛根主要通過(guò)減輕β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，改善胰島素抵抗，促進(jìn)糖代謝等多種途徑發(fā)揮降糖作用[4]。目前，葛根已成為多種治療糖尿病中成藥的主要成分，如玉泉丸、芪藥消渴膠囊、復(fù)方葛根膠囊等，并在糖尿病心腦血管并發(fā)癥的治療上取得了一定療效。因此，研究葛根活性成分與降糖藥合用的相互作用對(duì)糖尿病患者的用藥安全具有重大意義。

瑞格列奈為臨床常用的降糖藥，是一種胰島素促泌劑，其主要通過(guò)CYP2C8 和CYP3A4 進(jìn)行代謝[5]。葛根素（puerarin）是葛根的主要活性成分，具有降血糖和改善患者糖尿病并發(fā)癥等作用[6]。臨床治療過(guò)程中，葛根素和瑞格列奈會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)合用的情況。且已有研究表明，葛根素對(duì)CYP2B6、CYP2C9 及CYP3A4 均有一定的抑制作用，葛根素對(duì)肝組織CYP3A4 蛋白的表達(dá)具有明顯的抑制作用[7-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)將基于人肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)研究葛根素對(duì)瑞格列奈酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，進(jìn)而考察葛根素對(duì)瑞格列奈代謝的影響，為兩藥合用的安全性提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器廠）；超低溫冰箱（MDF-U 3386S，Panasonic）；恒溫混勻儀（MTH-100，杭州米歐儀器有限公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；電子分析天平（CPA225D，德國(guó)Sartorius）；恒溫氮吹儀（KL512J，北京康林科技有限公司）；超聲波清洗器（KQ-300B，昆山市超聲儀器有限公司）；臺(tái)式酸度計(jì)（哈納PH213）。

1.2 試藥

瑞格列奈（批號(hào)：100753-201303，純度：99.8%）、葛根素（批號(hào)：110752-201816，純度：95.4%）、阿托伐他?。ㄅ?hào)：100590-201804，純度：95.0%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）?；旌蟂D 人肝微粒體原液（20 mg·mL－1），NADPH發(fā)生系統(tǒng)[NRS（A）M10001.2018001，武漢普萊特生物醫(yī)藥有限公司）。乙酸乙酯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161203）；乙酸銨（Aladdin，批號(hào)：I1903034）；高純氮?dú)猓ㄊ仪f京聯(lián)實(shí)用氣體有限公司，批號(hào)：20211110），乙腈（HPLC 級(jí)）、甲酸（色譜純）（Fisher Chemical），水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 瑞格列奈對(duì)照品溶液 稱取瑞格列奈對(duì)照品適量，乙腈溶解，定容，制成濃度為1.1×104μmol·L－1的儲(chǔ)備液，依次精密量取儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋成8800.00、6600.00、4400.00、2200.00、1100.00、55.00、27.50、13.75 和6.87 μmol·L－1的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 葛根素對(duì)照品溶液 稱取葛根素對(duì)照品適量，乙腈溶解，定容，制成濃度為200 μmol·L－1的儲(chǔ)備液，依次精密量取儲(chǔ)備液適量，用乙腈稀釋成50、25、10、5、2.5 μmol·L－1的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 阿托伐他?。▋?nèi)標(biāo)）對(duì)照品溶液 稱取阿托伐他汀對(duì)照品適量，乙腈溶解，定容，稀釋成濃度為300 μmol·L－1的溶液。

2.1.4 空白溫孵液 取肝微粒體，經(jīng)高溫滅活后，采用0.1 mol·L－1K2HPO4緩沖液（pH 7.4）稀釋成蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1的空白溫孵液。

2.2 人肝微粒體溫孵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫孵條件 K2HPO4緩沖液（pH 7.4）176 μL，NADPH 發(fā)生系統(tǒng)12 μL（A 液10 μL，B 液2 μL），人肝微粒體10 μL，底物瑞格列奈（5.5 μmol·L－1）2 μL。以上試劑均置于37℃水中，預(yù)熱5 min 后混合，得到肝微粒體孵育體系，終體積為200 μL。該體系于37℃，恒溫震蕩（150 r·min－1）一定時(shí)間后，取出并立即放至－40 ℃冰箱，冷凍10 min 終止反應(yīng)，每個(gè)樣品平行處理3 次。為排除肝微粒體內(nèi)基質(zhì)及NADPH 發(fā)生系統(tǒng)成分的干擾，配置滅活肝微粒體＋NADPH 發(fā)生系統(tǒng)＋等量溶劑作為空白溫孵樣品。

2.2.2 樣品處理 從冰箱中取上述處理后的溫孵反應(yīng)體系，迅速解凍，加入阿托伐他汀溶液2 μL，渦旋混勻，加入乙酸乙酯1000 μL，渦旋5 min，進(jìn)行萃取，10 800 r·min－1離心10 min，取上清液900 μL，于40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，用乙?0 μL 復(fù)溶，再次渦旋振蕩、離心，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：10 mmol·L－1乙酸銨（pH 4.0）-乙腈（45∶55），流速：0.15 mL·min－1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取肝微粒體溫孵樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定；用等量溶劑替代瑞格列奈溶液制備空白樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定（不加內(nèi)標(biāo)）；取等量的瑞格列奈對(duì)照品溶液和阿托伐他汀對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，瑞格列奈和阿托伐他汀的保留時(shí)間分別為6.25 min和2.34 min，與其他雜質(zhì)峰分離良好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相特征色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以滅活的肝微粒體制備空白溫孵液，加入系列濃度的瑞格列奈對(duì)照品溶液，配制成終濃度分別為0.6875、1.375、2.75、4.4、5.5 μmol·L－1的模擬溫孵樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定。瑞格列奈與阿托伐他汀峰面積比值為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為瑞格列奈濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明，瑞格列奈在0.6875～5.5 μmol·L－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（Y＝0.2138X－0.0135，R2＝0.9995）。

2.4.3 精密度 制備溫孵體系，其中瑞格列奈高、中、低濃度分別為4.4、2.75、1.375 μmol·L－1，每個(gè)濃度制備6 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法于同一日進(jìn)行處理并測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.4 回收試驗(yàn) 制備溫孵體系，其中瑞格列奈高、中、低濃度分別為4.4、2.75、1.375 μmol·L－1的溫孵體系，每個(gè)濃度制備6 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的測(cè)得濃度與相應(yīng)理論濃度的比值，計(jì)算方法回收率；分別進(jìn)樣等量的瑞格列奈對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，根據(jù)溫孵體系中瑞格列奈或內(nèi)標(biāo)峰面積與等量瑞格列奈或內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液峰面積的比值，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率Tab 1 Precision，accuracy and extraction recovery

2.5 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1 溫孵時(shí)間的影響 人肝微粒體孵育體系中，瑞格列奈的濃度為5.5 μmol·L－1，人肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1，37℃溫孵，分別于10、20、30、40、60 min 取樣，處理后進(jìn)樣測(cè)定（n＝3）。最終選擇40 min 為最佳反應(yīng)孵育時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 孵育時(shí)間對(duì)人肝微粒體中瑞格列奈濃度的影響Fig 2 Effect of incubation time on the concentration of repaglinide in human liver microsomes

2.5.2 蛋白濃度的影響 人肝微粒體孵育體系中，肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度依次為1.0、0.7、0.5、0.2、0.1 mg·mL－1，瑞格列奈濃度為5.5 μmol·L－1，溫度37℃孵育40 min，孵育完成后，處理并進(jìn)樣測(cè)定（n＝3），計(jì)算瑞格列奈的減少量。瑞格列奈減少量在肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg·mL－1內(nèi)增加，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白濃度對(duì)人肝微粒體中瑞格列奈濃度的影響Fig 3 Effect of protein concentration on the concentration of repaglinide in human liver microsomes

2.5.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 孵育體系中瑞格列奈的初始濃度依次為5.5、4.4、2.75、1.76、1.375、0.6875 μmol·L－1，人肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度均為0.5 mg·mL－1，37℃孵育40 min，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。每個(gè)濃度處理3 份樣品，計(jì)算瑞格列奈平均剩余量。采用底物消除法，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 軟件處理，計(jì)算最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km），結(jié)果Km值為5.66 μmol·L－1，Vmax為1.71 μmol·min－1·（mg·protein）－1。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 瑞格列奈在人肝微粒體中酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Fig 4 Enzymatic kinetics of repaglinide in human liver microsomes

2.6 葛根素對(duì)瑞格列奈代謝的影響研究

肝微粒體孵育體系中，葛根素的濃度分別50、25、10、5、2.5、0 μmol·L－1，瑞格列奈的濃度為5.5 μmol·L－1，蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1，37℃孵育40 min，處理后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算瑞格列奈剩余量。結(jié)果葛根素對(duì)瑞格列奈的代謝未產(chǎn)生明顯影響（見(jiàn)圖5）。

圖5 葛根素對(duì)瑞格列奈在人肝微粒體中代謝的影響Fig 5 Effect of puerarin on the metabolism of repaglinide in human liver microsomes

3 討論

目前，基于藥物代謝酶的體外藥物代謝方法得到廣泛應(yīng)用，如體外肝微粒體孵育、器官灌流、重組肝微粒體酶、細(xì)胞模型等。肝微粒體孵育法，不僅操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期短，且重現(xiàn)性好，故本實(shí)驗(yàn)選擇肝微粒體孵育法進(jìn)行研究。

孵育時(shí)間0～40 min，瑞格列奈的減少量呈線性減少，40～60 min 減少速率減慢。為了實(shí)現(xiàn)底物耗盡方法的最佳效用，應(yīng)使用低酶濃度和短孵育時(shí)間[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇40 min 為最佳孵育時(shí)間。對(duì)于微粒體孵育，使用較低的酶濃度可以更好地預(yù)測(cè)體內(nèi)值，且根據(jù)所研究的化合物類別，理想條件是酶質(zhì)量濃度低于0.5 mg·mL－1[9]。綜合考慮酶蛋白質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mg·mL－1作為最佳反應(yīng)蛋白濃度。

瑞格列奈可作為CYP2C8 的探針底物，故通過(guò)考察葛根素對(duì)瑞格列奈的影響，可進(jìn)一步考察葛根素對(duì)CYP2C8 活性的影響。細(xì)胞色素CYP2C8占人體 CYP 酶系總量的 6%～7%，代謝至少1%經(jīng)Ⅰ相代謝的藥物。但目前對(duì)于中藥及其有效成分對(duì)CYP2C8 介導(dǎo)的藥物相互作用研究尚不完善。已有研究顯示，同為黃酮類化合物的苦參酚Ⅰ、苦參黃酮G 等對(duì)CYP2C8 的活性具有較強(qiáng)的抑制作用。然而尚未見(jiàn)葛根素對(duì)CYP2C8 活性影響的研究[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出Km＝5.66 μmol·L－1。Km值的大小與酶的親和力成反比，與先前的大鼠肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)相比[11]，提示瑞格列奈與人肝微粒體具有更強(qiáng)的親和性。本實(shí)驗(yàn)以瑞格列奈為底物，通過(guò)建立葛根素與瑞格列奈在人肝微粒體中的共同孵育體系，考察葛根素對(duì)瑞格列奈代謝的影響。結(jié)果顯示，葛根素在0～50 μmol·L－1內(nèi)，瑞格列奈在人肝微粒體中的代謝沒(méi)有發(fā)生明顯變化。因10 μmol·L－1＜IC50＜50 μmol·L－1，即為弱抑制作用[12]，故葛根素對(duì)瑞格列奈幾乎未產(chǎn)生抑制作用。兩藥聯(lián)用可能不會(huì)因藥物代謝性相互作用而影響療效和患者的安全性。

當(dāng)然，體外研究結(jié)果并不能代表體內(nèi)過(guò)程，有時(shí)與體內(nèi)過(guò)程存在差異。因此，尚需體內(nèi)研究進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。但體外實(shí)驗(yàn)可為體內(nèi)研究提供理論基礎(chǔ)及作用機(jī)制分析，對(duì)體內(nèi)研究具有重要意義。