亞麻葉白千層內(nèi)生真菌Penicillium citrinum YMY-1次生代謝產(chǎn)物研究

張莎，鄧小華，曠敏，彭偉偉，鄭雨婷，許立，曾廣源，艾衛(wèi)敏，鄒振興*（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 41001；2.慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 41001；.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系，長(zhǎng)沙 41001；4.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課部人體解剖學(xué)與生理學(xué)教研室，湖南 湘潭 411012）

青霉屬（Penicillium）真菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的一類腐生類真菌，目前在植物[1]、動(dòng)物[2]、海洋[3]、土壤[4]中均被報(bào)道過(guò)。青霉屬真菌也是目前研究最多的菌屬之一，被認(rèn)為是藥物發(fā)現(xiàn)的主要來(lái)源，包括來(lái)自Penicillium chrysogenum的抗生素青霉素和來(lái)自Penicillium griseofulvum的抗真菌藥物灰黃霉素[5]，其還能產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和脂肪酶等具有應(yīng)用前景的酶類，因此在藥物的研制、工業(yè)原材料的制備、新型酶制劑的篩選以及食品加工業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[6]。青霉屬真菌是多種活性代謝產(chǎn)物的主要生產(chǎn)者，因此目前仍然是廣大藥物研究者的關(guān)注焦點(diǎn)。

課題組前期對(duì)亞麻葉白千層（Melaleuca linariifolia）植株進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從中分離鑒定出多個(gè)活性天然產(chǎn)物[7-9]。為了進(jìn)一步尋找和發(fā)現(xiàn)更多活性天然產(chǎn)物，我們選取亞麻葉白千層植物作為分菌對(duì)象，從中分離出多株內(nèi)生真菌，經(jīng)活性篩選及TLC 薄層分析發(fā)現(xiàn)，有多株菌株代謝產(chǎn)物豐富，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）顯示出較好的抑制活性。菌株P(guān)enicillium citrinumYMY-1 是其中一株青霉屬真菌，對(duì)MRSA 的最小抑菌濃度（MIC）值為0.625 mg·mL－1。因此，為了進(jìn)一步深入挖掘其次級(jí)代謝產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定出12 個(gè)化合物（見圖1）。

圖1 化合物1～12 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structures of compounds 1～12

1 材料

Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200 型分析高效液相色譜儀、Agilent 1100 型半制備高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 科技公司）；YMC-pack ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；YMC-pack ODS-A 色譜柱（250 mm×10 mm，10 μm）；大孔樹脂D101（安徽三星樹脂科技有限公司）；C18反相硅膠（40～75 μm，日本Kasugai）；硅膠（60～100 目，200～300 目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20 凝膠（德國(guó)Healthcare Uppsala Swedeb）；所用試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株分離自亞麻葉白千層枝葉，亞麻葉白千層枝葉于2019年11月采自中國(guó)科學(xué)院華南植物園，由華南植物園譚海波副研究員鑒定。該真菌由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司經(jīng)ITS 序列分析鑒定為Penicillium citrinumYMY-1，目前該樣品標(biāo)本保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 菌株的發(fā)酵、萃取及其代謝產(chǎn)物的分離

用接種環(huán)挑取適量菌絲接種至裝有200 mL馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基的三角瓶中，在恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)5 d（28 ℃，130 r·min－1），制備得種子液。將種子液接種至無(wú)菌大米培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)60 瓶，室溫下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)30 d，得到固體發(fā)酵物。發(fā)酵完成后用乙酸乙酯將大米發(fā)酵物萃取3 次，并將有機(jī)溶劑在減壓下蒸發(fā)以獲得粗提物浸膏（60 g）。

乙酸乙酯浸膏經(jīng)大孔樹脂柱層析，采用20%、80%和100%乙醇水洗脫。80%部分經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）梯度系統(tǒng)，TLC 點(diǎn)板合并得8 個(gè)組分（Fr.A～Fr.H）。Fr.C 經(jīng)ODS 柱層析，采用30%～100%甲醇水梯度洗脫得5 個(gè)組分（Fr.C-1～Fr.C-5），化合物12（54 mg）在過(guò)柱中析出白色固體。Fr.C-1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析，最后經(jīng)Pre-HPLC 得化合物5（13.1 mg）和6（15.2 mg）。Fr.C-2 經(jīng)硅膠柱層析，再經(jīng)Pre-HPLC 得化合物2（9.5 mg）和7（3.2 mg）。

Fr.E 經(jīng)ODS 柱層析，采用20%～100%甲醇水梯度洗脫得8 個(gè)組分（Fr.E-1～Fr.E-8）。Fr.E-3 經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙醇（20∶1～0∶100）梯度洗脫，得5 個(gè)組分（Fr.E-3-1～Fr.E-3-5）。Fr.E-3-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析，再經(jīng)Pre-HPLC 得化合物3（30.6 mg）、10（16.1 mg）和11（5.7 mg）。Fr.E-3-4 經(jīng)Pre-HPLC 得化合物1（22.4 mg）。Fr.E-4 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析，以甲醇為洗脫劑，得4 個(gè)組分（Fr.E-4-1～Fr.E-4-4）。Fr.E-4-2 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，Pre-HPLC 得化合物8（7.8 mg）。Fr.E-4-3 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，Pre-HPLC 得化合物4（15.0 mg）和9（6.2 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕色無(wú)定型粉末，易溶于甲醇和二甲基亞砜（DMSO），HR-ESI-MSm/z：447.0727 [M＋Na]＋。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：12.24（1H，br s，8-OH），6.95（1H，s，H-11），6.69（1H，s，H-9），5.99（1H，br s，17-OH），5.88（1H，br s，2-OH），4.24（1H，t，J＝6.6 Hz，H-17），4.00（1H，t，J＝8.4 Hz，H-3），3.71（3H，s，H-15），3.66（3H，s，H-19），3.47（1H，dd，J＝17.4，8.4 Hz，H-4β），3.07（1H，dd，J＝17.4，9.0 Hz，H-4α），2.87（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-16α），2.79（1H，dd，J＝13.8，7.2 Hz，H-16β），2.38（3H，s，H-14）。13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：172.8（C-1），79.8（C-2），51.5（C-3），38.0（C-4），122.1（C-5），178.7（C-6），108.7（C-7），160.4（C-8），112.9（C-9），147.8（C-10），108.5（C-11），157.0（C-12），172.3（C-13），22.2（C-14），53.0（C-15），35.1（C-16），71.2（C-17），172.3（C-18），52.1（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，化合物1 鑒定為chromosulfine。

化合物2：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：285.0752 [M＋H]＋。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δH：7.93（1H，t，J＝8.5 Hz，H-3），7.73（1H，d，J＝8.5 Hz，H-4），7.45（1H，d，J＝8.5 Hz，H-2），6.92（1H，s，H-5），6.68（1H，s，H-7），3.90（3H，s，-OCH3），3.40（3H，s，6-CH3）。13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）δH：133.4（C-1），123.3（C-2），136.4（C-3），120.0（C-4），155.9（C-4a），155.9（C-4b），107.0（C-5），150.1（C-6），111.9（C-7），161.0（C-8），108.0（C-8a），180.4（C-9），117.1（C-9a），22.5（6-CH3），169.2（-COO-），53.2（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，化合物2 鑒定為methyl 8-hydroxy-6-methyl-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylate。

化合物3：深褐色無(wú)定型粉末，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：381.1697 [M＋H]＋。1H NMR（500 MHz，CD3OD）δH：6.28（1H，s，H-8），5.21（1H，q，J＝6.5 Hz，H-3），4.62（1H，m，H-2'），3.36（1H，m，H-3'），3.26（1H，m，H-4），2.22（3H，s，5'-CH3），2.12（3H，s，6-CH3），1.43（3H，d，J＝6.5 Hz，3-CH3），1.38（3H，d，J＝6.5 Hz，2'-CH3），1.35（6H，d，J＝6.5 Hz，4-CH3，3'-CH3）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δC：158.9（C-1），83.0（C-3），34.6（C-4），130.1（C-5），133.4（C-6），184.2（C-7），102.4（C-8），159.9（C-9），99.3（C-10），87.9（C-2'），44.5（C-3'），140.8（C-4'），117.3（C-5'），148.1（C-6'），101.4（C-7'），135.9（C-8'），137.6（C-9'），19.7（3-CH3），17.9（4-CH3），9.4（6-CH3），17.4（2'-CH3），18.0（3'-CH3），10.5（5'-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，化合物3 鑒定為penicitrinone A。

化合物4：深黃色無(wú)定型粉末，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：571.1601 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：15.17（1H，br s，5'-OH），15.01（1H，br s，5-OH），6.94（1H，s，H-7），6.54（1H，d，J＝2.4 Hz，H-7'），6.19（1H，s，H-10），6.18（1H，s，H-3'），6.11（1H，s，H-3），5.93（1H，d，J＝2.4 Hz，H-9'），4.08（3H，s，6-OCH3），3.93（3H，s，6'-OCH3），3.83（3H，s，8-OCH3），3.47（3H，s，8'-OCH3），2.20，（3H，s，2-CH3），2.04（3H，s，2'-CH3）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.1（C-2），107.0（C-3），184.1（C-4），163.4（C-5），161.7（C-6），93.8（C-7），160.1（C-8），107.5（C-9），98.3（C-10），153.0（C-11），103.6（C-12），108.0（C-13），139.5（C-14），169.1（C-2'），107.2（C-3'），184.5（C-4'），162.6（C-5'），161.5（C-6'），97.0（C-7'），161.9（C-8'），96.9（C-9'），106.9（C-10'），151.0（C-11'），104.0（C-12'），108.2（C-13'），140.6（C-14'），20.4（2-CH3），56.6（6-OCH3），56.7（8-OCH3），20.6（2'-CH3），56.5（6'-OCH3），55.4（8'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，化合物4 鑒定為rubasperone B。

化合物5：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：271.1452 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：8.24（1H，d，J＝8.0 Hz，H-8），7.83（1H，m，H-6），7.50（3H，m，H-6，H-8，-NH-），4.92（1H，s，H-3），3.85（3H，s，4-CH3），2.18（1H，m，H-1'），1.59（1H，m，H-2'a），1.39（1H，m，H-2'b），1.14（3H，d，J＝6.8 Hz，H-4'），0.65（3H，t，J＝7.2 Hz，H-3'）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.1（C-1），57.4（C-3），36.2（4-CH3），117.6（C-5），133.1（C-6），124.8（C-7），126.3（C-8），172.1（C-9），164.7（C-3a），141.7（C-4a），128.4（C-8a），110.7（C-9a），36.3（C-1'），27.8（C-2'），12.0（C-3'），12.4（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，化合物5 鑒定為quinolactacin Al。

化合物6：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：271.1449 [M＋H]＋。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：8.24（1H，d，J＝8.0 Hz，H-8），7.82（1H，m，H-6），7.50（3H，m，H-6，H-8，-NH-），4.84（1H，s，H-3），3.83（3H，s，4-CH3），2.18（1H，m，H-1'），1.00（3H，t，J＝7.2 Hz，H-3'），0.87（1H，m，H-2'a），0.81（1H，m，H-2'b），0.44（3H，d，J＝6.8 Hz，H-4'）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.0（C-1），59.5（C-3），36.5（4-CH3），117.7（C-5），133.1（C-6），124.9（C-7），128.4（C-8），172.1（C-9），165.0（C-3a），141.7（C-4a），126.3（C-8a），110.8（C-9a），36.6（C-1'），21.3（C-2'），12.1（C-3'），18.0（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，化合物6 鑒定為quinolactacin A2。

化合物7：白色固體，溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：153.0915 [M＋H]＋。1H NMR（500 MHz，CD3OD）δH：6.20（1H，s，H-6），2.13（3H，s，H-9），2.04（3H，s，H-7），2.03（3H，s，H-8）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δC：154.6（C-1），154.2（C-2），135.3（C-3），115.6（C-4），110.2（C-5），109.8（C-6），11.9（C-7），9.0（C-8），20.3（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，化合物7 鑒定為3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚。

化合物8：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：249.1112 [M＋H]＋。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.56（1H，s，H-6），7.45（1H，q，J＝10.8 Hz，H-9），7.23（1H，d，J＝14.4 Hz，H-8），6.63（1H，m，H-10），6.36（1H，m，H-11），4.24（2H，dd，J＝4.8，1.8 Hz，H-12），2.18（3H，s，3-CH3），2.08（3H，s，5-CH3）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δC：112.5（C-1），162.3（C-2），110.7（C-3），161.2（C-4），116.0（C-5），127.9（C-6），192.3（C-7），123.9（C-8），142.9（C-9），143.0（C-10），128.7（C-11），62.9（C-12），6.6（3-CH3），15.0（5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，化合物8 鑒定為12-hydroxysorbicillin。

化合物9：黃色油狀，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：250.1805 [M＋H]＋。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δH：5.39（2H，m，H-8，H-9），5.22（1H，t，J＝6.0 Hz，H-12），3.51（1H，m，H-15a），3.25（1H，m，H-15b），2.28（2H，m，H-13a，H-4a），2.16（1H，m，H-4b），2.00（1H，m，H-13b），1.98（2H，m，H-7），1.88（1H，m，H-14a），1.79（1H，m，H-14b），1.67（3H，s，2-CH3），1.61（3H，d，J＝4.0 Hz，H-10），1.45（2H，m，H-5），1.34（2H，m，H-6）。13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）δC：162.6（C-1），106.1（C-2），163.5（C-3），30.2（C-4），26.3（C-5），28.9（C-6），32.1（C-7），131.5（C-8），125.1（C-9），18.2（C-10），87.8（C-11），31.6（C-12），21.7（C-13），44.3（C-14），10.4（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，化合物9 鑒定為2-（hept-5-enyl）-3-methyl-4-oxo-6，7，8，8a-tetrahydro-4Hpyrrolo[2，1-b]-1，3-oxazine。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：267.0873 [M＋H]＋。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δH：4.43（1H，dd，J＝14.5，7.5 Hz，H-3），2.95（1H，dd，J＝14.5，7.5 Hz，H-4），1.98（3H，s，5-CH3），1.16（3H，d，J＝7.0 Hz，3-CH3），1.14（3H，d，J＝7.0 Hz，4-CH3）。13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）δC：166.4（C-1），77.0（C-3），35.0（C-4），111.3（C-5），164.7（C-6），100.3（C-7），161.3（C-8），146.5（C-9），102.4（C-10），20.1（3-CH3），19.3（4-CH3），10.3（5-CH3），175.8（-COOH）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，化合物10 鑒定為dihydrocitrinone。

化合物11：黃色油狀，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0965 [M＋H]＋。1H NMR（500 MHz，CD3OD）δH：4.67（1H，qd，J＝6.5，1.0 Hz，H-3），3.07（1H，qd，J＝6.5，1.0 Hz，H-4），2.10（3H，s，7-CH3），2.08（3H，s，5-CH3），1.28（3H，d，J＝7.0 Hz，3-CH3），1.26（3H，d，J＝7.0 Hz，3-CH3）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δC：171.1（C-1），81.7（C-3），35.8（C-4），140.9（C-4a），115.2（C-5），161.6（C-6），110.6（C-7），162.6（C-8），99.9（C-8a），20.3（3-CH3），20.1（4-CH3），10.9（5-CH3），8.3（7-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，化合物11 鑒定為6，8-dihydroxy-3，4，5，7-tetramethyl-3，4-dihydroisocoumarin。

化合物12：白色固體，易溶于氯仿，HRESI-MSm/z：397.3476 [M＋H]＋。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δH：5.57（1H，dd，J＝6.0，2.4 Hz，H-6），5.39（1H，m，H-7），5.19（1H，m，H-22），5.19（1H，m，H-23），3.64（1H，m，H-3），1.03（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-18），0.92（3H，d，J＝6.6 Hz，H-28），0.83（6H，d，J＝6.6 Hz，H-27，H-26），0.63（3H，s，H-19）。13C NMR（150 MHz，CDCl3）δC：38.4（C-1），32.0（C-2），70.5（C-3），40.8（C-4），139.8（C-5），119.6（C-6），116.3（C-7），141.4（C-8），46.3（C-9），37.0（C-10），21.1（C-11），39.1（C-12），42.8（C-13），54.6（C-14），23.0（C-15），28.3（C-16），55.7（C-17），12.1（C-18），16.3（C-19），40.4（C-20），21.1（C-21），135.1（C-22），132.0（C-23），42.8（C-24），33.1（C-25），20.0（C-26），19.7（C-27），17.6（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，化合物12 鑒定為β-麥角甾醇。

4 討論

本研究從亞麻葉白千層植物內(nèi)生真菌Penicillium citrinumYMY-1 乙酸乙酯提取物中分離鑒定出12個(gè)化合物，主要為聚酮和生物堿類成分，其中化合物4 和8 為首次從青霉屬真菌中分離得到。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，化合物1 和2 具有抗腫瘤活性[10，17]；化合物3、5 和6 對(duì)乙酰膽堿酯酶具有抑制活性[14，21]；化合物7、9 和10 具有抗菌活性[15，22]；化合物8 具有抗炎活性[16]。本研究結(jié)果不僅豐富了青霉屬真菌的化學(xué)成分多樣性，亦為該真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。