水產(chǎn)品中的微生物檢驗(yàn)方法研究進(jìn)展

張 雯

（大連海寶食品有限公司，遼寧大連 116041）

水產(chǎn)品中存在的微生物會(huì)威脅到消費(fèi)者的身體健康，易引發(fā)消費(fèi)者腹瀉、嘔吐等病癥，因此水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)一直以來都是食品安全防護(hù)的重點(diǎn)內(nèi)容。在水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)過程中，主要是對(duì)水產(chǎn)品中大腸桿菌、致病菌及菌落總數(shù)進(jìn)行研究。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，近年來出現(xiàn)了許多新興的微生物檢驗(yàn)方法，水產(chǎn)品檢驗(yàn)質(zhì)量、檢測(cè)效率得到了質(zhì)的提升，微生物檢驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確[1]。

1 水產(chǎn)品中的微生物檢驗(yàn)技術(shù)

1.1 水產(chǎn)品中的微生物儀器分析檢驗(yàn)技術(shù)

儀器分析檢驗(yàn)技術(shù)作為水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)技術(shù)之一，主要分為近紅外光譜技術(shù)、氣相色譜法以及高效液相色譜法。其中，近紅外光譜技術(shù)能對(duì)水產(chǎn)品中的有機(jī)化合物和含有不同含氫基團(tuán)的肉類成分含量進(jìn)行有效測(cè)定和檢驗(yàn)，進(jìn)而得出食品微生物情況。近紅外技術(shù)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在快速、準(zhǔn)確、方便的食品品質(zhì)分析、品種和產(chǎn)地來源鑒別、生產(chǎn)工藝鑒別和摻假鑒別等方面，我國(guó)近紅外光譜技術(shù)發(fā)展時(shí)間較短，目前主要應(yīng)用于煙草、制藥等領(lǐng)域，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少。氣相色譜法和高效液相色譜法是通過對(duì)微生物化學(xué)組成以及微生物所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)[2]。與其他微生物檢驗(yàn)技術(shù)相比，氣相色譜法和高效液相色譜法最明顯的檢驗(yàn)優(yōu)勢(shì)是靈敏性強(qiáng)、檢驗(yàn)速度快、檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。在微生物檢驗(yàn)過程中，這兩類技術(shù)獲取微生物成分的時(shí)間更短，需用到的檢驗(yàn)樣本更少，這兩類技術(shù)的未來發(fā)展?jié)摿烷_發(fā)性較強(qiáng)。

1.2 水產(chǎn)品中的微生物代謝分析檢驗(yàn)技術(shù)

微生物代謝分析檢驗(yàn)技術(shù)也是水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)常用的技術(shù)方法，其可以分為ATP生物發(fā)光檢驗(yàn)法和電特性參數(shù)測(cè)量檢驗(yàn)法。在水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)中使用ATP生物發(fā)光檢驗(yàn)方法主要是通過對(duì)水產(chǎn)品樣本的細(xì)菌ATP和體細(xì)胞ATP檢驗(yàn)達(dá)到檢測(cè)水產(chǎn)品微生物情況的目的。ATP生物發(fā)光檢驗(yàn)方法原理是在熒光素、ATP以及O2作為底物的時(shí)候，熒光素酶能在Mg2+存在的情況下，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，以此反映檢驗(yàn)樣本的微生物情況。從檢測(cè)原理上來說，電特性參數(shù)測(cè)量微生物檢驗(yàn)技術(shù)是一項(xiàng)較為直觀的檢驗(yàn)方法。由于在對(duì)水產(chǎn)品微生物進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中，需對(duì)檢驗(yàn)樣本的初始菌量進(jìn)行推算，因此電特性參數(shù)測(cè)量檢驗(yàn)方法會(huì)對(duì)電導(dǎo)時(shí)間以及微生物生長(zhǎng)情況建立曲線關(guān)系，以此反應(yīng)水產(chǎn)品微生物情況，獲得檢驗(yàn)結(jié)果，直接呈現(xiàn)水產(chǎn)品微生物情況。無論是哪一種微生物檢驗(yàn)方法，都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和檢驗(yàn)條件，具體的檢驗(yàn)方法選擇要以實(shí)際檢驗(yàn)需求以及檢驗(yàn)條件為主進(jìn)行考慮，各種方法都有其最適宜的檢測(cè)對(duì)象、適用的范圍和場(chǎng)合，也各有其特點(diǎn)和不足之處。

1.3 水產(chǎn)品中的微生物傳統(tǒng)PCR及改進(jìn)PCR檢驗(yàn)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、靈敏度高和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，在水產(chǎn)品微生物檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。PCR技術(shù)可有效檢測(cè)出水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌、腸出血性大腸桿菌等，運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，可有效避免具有安全隱患的食品流入市場(chǎng)，在保證水產(chǎn)品安全方面發(fā)揮著重要作用。

近幾年，在PCR技術(shù)的快速發(fā)展下，對(duì)原有PCR檢測(cè)技術(shù)不斷改進(jìn)與創(chuàng)新，改進(jìn)PCR檢驗(yàn)技術(shù)包括多重PCR、微滴數(shù)字PCR技術(shù)等[3]。①多重PCR檢測(cè)法是傳統(tǒng)PCR技術(shù)的創(chuàng)新，傳統(tǒng)PCR技術(shù)在檢測(cè)中利用單引物，而多重PCR技術(shù)是運(yùn)用多個(gè)DNA檢測(cè)引物檢測(cè)，由于在反應(yīng)前添加多個(gè)DNA引物，與聚合酶反應(yīng)后可獲得多個(gè)不同的DNA片段，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物多個(gè)致病菌的檢測(cè)，在檢測(cè)效果與效率方面都得到了大幅度提高。②PR-PCR檢測(cè)法是傳統(tǒng)PCR技術(shù)的升級(jí)，該技術(shù)的主要原理是通過提取組織中的總RNA，再以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。③微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是一種全新的定量核酸分子的方式，該技術(shù)通過PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)的積累，再對(duì)陽性反應(yīng)的單元數(shù)進(jìn)行讀取，進(jìn)而對(duì)樣本中的DNA分子數(shù)進(jìn)行計(jì)算，在檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、靈敏度方面效果更佳，并且能夠?qū)崿F(xiàn)絕對(duì)定量，在水產(chǎn)品微生物檢測(cè)方面發(fā)展前景廣闊[4]。

1.4 水產(chǎn)品中的微生物基因芯片檢驗(yàn)技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將寡核苷酸放在芯片的表面，提取其DNA，通過PCR技術(shù)，將其與芯片上的寡核苷酸進(jìn)行雜交，利用掃描系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行定量分析，從而判斷水產(chǎn)品中是否有特定的微生物?；蛐酒夹g(shù)能全面、高效、快速地檢測(cè)微生物。基因芯片技術(shù)對(duì)樣品需求量少，檢驗(yàn)自動(dòng)化程度高，與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)相比，基因芯片技術(shù)在確定病原體類型以及對(duì)抗體產(chǎn)生之前的感染情況進(jìn)行檢驗(yàn)方面體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還能有效確定感染程度及范圍[5]。基因芯片技術(shù)正在向著利用同一芯片同時(shí)檢測(cè)多種微生物的方向發(fā)展，能夠進(jìn)一步提升檢測(cè)準(zhǔn)確性和時(shí)效性。同時(shí)，在水產(chǎn)品的微生物檢測(cè)方面要不斷加強(qiáng)與完善，不斷優(yōu)化檢測(cè)程序、降低檢測(cè)成本和建立標(biāo)準(zhǔn)化流程。

1.5 水產(chǎn)品中的微生物檢驗(yàn)學(xué)技術(shù)

對(duì)微生物形態(tài)進(jìn)行檢查是檢驗(yàn)水產(chǎn)品中微生物的常用檢驗(yàn)手段之一。由于微生物個(gè)體微小，單靠檢驗(yàn)人員肉眼無法觀測(cè)到微生物的形態(tài)，因此在微生物形態(tài)檢查時(shí)，檢驗(yàn)人員會(huì)借助顯微鏡放大檢驗(yàn)樣本，仔細(xì)觀測(cè)記錄樣本微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)性，從而實(shí)現(xiàn)微生物檢驗(yàn)?zāi)康?。一般情況下，水產(chǎn)品微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)借助普通光學(xué)顯微鏡就能仔細(xì)觀察到，但如果還想進(jìn)一步觀察檢測(cè)樣本內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，就需借助電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

在水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)中，常用的光學(xué)顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。普通光學(xué)顯微鏡在檢測(cè)水產(chǎn)品樣本的微生物時(shí)，以自然光或燈光為光源，利用油（浸）鏡放大樣本，實(shí)現(xiàn)樣本直接觀察的目的。暗視野顯微鏡是在普通光學(xué)顯微鏡中安裝暗視野聚光器，使光源無法直接從顯微鏡中間透入，只能從暗視野聚光器的邊緣斜射到檢驗(yàn)樣本上，檢驗(yàn)樣本在接收到斜射光后會(huì)出現(xiàn)散射，樣本中的光亮微生物也能因此被觀察到。相差顯微鏡是借助相差板光珊作用改變直射光的光相位以及振幅，從而通過檢驗(yàn)樣本的光強(qiáng)度差異觀察到樣本微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)方式。熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的使用區(qū)別為熒光顯微鏡在微生物檢驗(yàn)過程中主要選用高壓汞燈作為觀察光源，選用不同的濾光片進(jìn)行配合實(shí)現(xiàn)微生物檢驗(yàn)?zāi)康模鄳?yīng)用于同熒光抗體結(jié)合或利用熒光素進(jìn)行染色的水產(chǎn)品微生物樣本檢測(cè)。電子顯微鏡是以電子流為微生物檢驗(yàn)光源，借助磁線電圈放大檢驗(yàn)樣本，從而達(dá)到觀察微生物結(jié)構(gòu)的目的，原理是電子束通過加速電壓作用于樣品上，電子與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生透射電子，從而進(jìn)行形貌觀察、成分分析等。

此外，在水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)中，還可采用不染色標(biāo)本檢驗(yàn)方式和染色標(biāo)本檢驗(yàn)方式進(jìn)行檢驗(yàn)。水產(chǎn)品檢驗(yàn)標(biāo)本在未染色時(shí)，可通過標(biāo)本的折光率以及檢驗(yàn)標(biāo)本環(huán)境差異觀察標(biāo)本微生物情況，常用的不染色標(biāo)本檢驗(yàn)方式有懸滴法、壓滴法以及毛細(xì)管法，具體檢驗(yàn)方式選擇以檢驗(yàn)要求、檢驗(yàn)樣本、檢驗(yàn)條件為主。染色標(biāo)本檢驗(yàn)方式是通過對(duì)檢驗(yàn)水產(chǎn)品標(biāo)本的染色，使標(biāo)本中的微生物與周邊環(huán)境在顏色上顯現(xiàn)出差異，通過顏色差異比對(duì)了解水產(chǎn)品檢驗(yàn)樣本微生物情況，并可以直接清晰地觀察到微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)。染色標(biāo)本檢驗(yàn)分為單染色法、復(fù)染色法、特殊染色法、負(fù)染色法和熒光染色法等，無論哪種染色方法都需要先進(jìn)行涂片制備，再利用火焰進(jìn)行固定，方便后續(xù)進(jìn)行標(biāo)本染色。當(dāng)干燥的水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)標(biāo)本迅速在火焰中通過3次后，即可選擇合適的染色方法進(jìn)行標(biāo)本染色。復(fù)染色法需再進(jìn)行一次脫色和復(fù)染過程，將水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)標(biāo)本染成不同的顏色，以此直接觀察標(biāo)本微生物情況[6]。

1.6 水產(chǎn)品中的微生物培養(yǎng)法檢驗(yàn)技術(shù)

微生物培養(yǎng)檢驗(yàn)技術(shù)主要是通過對(duì)菌體理化特性的分析達(dá)到微生物檢驗(yàn)?zāi)康模钦Q生于20世紀(jì)80年代的傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)技術(shù)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，微生物培養(yǎng)檢驗(yàn)技術(shù)也在不斷發(fā)展創(chuàng)新。微生物培養(yǎng)檢驗(yàn)技術(shù)主要是通過對(duì)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)進(jìn)行指標(biāo)劑、熒光物質(zhì)以及抑菌計(jì)量應(yīng)用進(jìn)行增菌時(shí)間檢驗(yàn)和微生物培養(yǎng)鑒定，并對(duì)鑒定情況進(jìn)行總結(jié)，確定檢驗(yàn)對(duì)象的安全性。在微生物培養(yǎng)檢驗(yàn)技術(shù)中，疏水網(wǎng)膜法以及葡萄糖苷酶熒光法都是常應(yīng)用的檢驗(yàn)技術(shù)，葡萄糖苷酶熒光法能快速檢驗(yàn)水產(chǎn)品中的大腸桿菌細(xì)菌含量，疏水網(wǎng)膜法能對(duì)水產(chǎn)品中的霉菌以及沙門氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)。

2 結(jié)語

綜上所述，水產(chǎn)品中的微生物含量對(duì)產(chǎn)品整體安全質(zhì)量有著直接的影響，做好水產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)工作能有效避免食源性疾病的發(fā)生，滿足消費(fèi)者當(dāng)下的食品健康要求。因此，相關(guān)部門必須重視食品安全檢驗(yàn)活動(dòng)的實(shí)施。目前，水產(chǎn)品微生物主要使用的檢驗(yàn)技術(shù)為儀器分析技術(shù)、代謝技術(shù)、環(huán)境溫濕度檢驗(yàn)控制、檢驗(yàn)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)以及微生物培養(yǎng)法檢驗(yàn)技術(shù)。不同的檢驗(yàn)技術(shù)有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，為保證微生物檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在檢驗(yàn)過程中最好結(jié)合實(shí)際檢驗(yàn)需求、檢驗(yàn)情況以及檢驗(yàn)條件選擇合適的檢驗(yàn)技術(shù)，從而保證產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，提升我國(guó)水產(chǎn)品行業(yè)的安全性。