肉及肉制品真實性鑒別技術(shù)的研究進展

王柏輝，周晉堯，周霞，孫亞婷，薛彥倫，呂樹梅

1. 鄂爾多斯市檢驗檢測中心（鄂爾多斯 017000）；2. 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學研究院（鄂爾多斯 017000）

根據(jù)《中國居民膳食指南》要求，肉及肉制品是日常飲食中必不可少的一部分，每人每天應攝入100 g左右的肉制品。肉制品中蛋白質(zhì)含量約占20%，同時畜肉中的營養(yǎng)物質(zhì)，如亞油酸、維生素、礦物元素等比較豐富[1]。伴隨著市場經(jīng)濟的高質(zhì)量發(fā)展，消費者對肉及肉制品的需求越來越多樣化，對肉制品的感官質(zhì)量和營養(yǎng)品質(zhì)愈加重視，而在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，近年來肉制品摻假摻雜事件頻頻發(fā)生[2]。2013年歐洲的“馬肉風波”事件和2016年大潤發(fā)肉類摻假事件揭示商家以廉價肉代替高價肉售賣，以牟取暴利。肉制品的摻假主要體現(xiàn)在：原料肉的摻假；肌肉組織替換，如用動物脂肪組織替換肌肉組織；添加植物蛋白等。

針對肉制品安全性監(jiān)管和保護消費者利益，全球各個國家食品安全部門對肉及肉制品生產(chǎn)者和經(jīng)營者具有明確的法律法規(guī)約束，但也需要借助科學技術(shù)手段以保障食品安全。常見的肉制品真實性鑒別方法包括分子生物學技術(shù)、振動光譜技術(shù)、質(zhì)譜和色譜技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和代謝組學技術(shù)。肉制品真實性鑒別技術(shù)是監(jiān)管肉制品摻假摻雜和維護市場安全流通的有效保障，同時肉制品摻假摻雜形式的多樣化決定了鑒別技術(shù)的準確性和多樣性，如何提升肉制品鑒別技術(shù)的準確性和便利性以及擴大鑒別技術(shù)的應用范圍是目前保障肉制品安全的發(fā)展方向。

1 分子生物學技術(shù)在肉及肉制品真實性鑒別中的應用

分子生物學技術(shù)已成為肉及肉制品真實性分析領(lǐng)域的常規(guī)工具，允許在復雜基質(zhì)中對不同物種進行精準鑒別。DNA是生物體細胞中主要遺傳物質(zhì)，在不同物種中具有較高的保守性。生物體細胞中DNA具有耐熱性和穩(wěn)定性的特性，被廣泛用于肉制品摻假摻雜檢測中[3]。分子生物學技術(shù)主要包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、基因芯片、DNA條形碼和電化學DNA傳感器。

1.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是針對指定的DNA序列設(shè)計引物，利用DNA聚合酶在體外循環(huán)擴增，實現(xiàn)目標DNA快速擴增。PCR技術(shù)因具有特異性高、靈敏度強、反應效率高且成本相對較低等優(yōu)點，已成為肉制品真實性鑒別的常用技術(shù)方法。應用在肉及肉制品真?zhèn)螜z測的PCR技術(shù)主要包括多重PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)。

多重PCR技術(shù)是基于在同一PCR反應體系當中加入2對及以上的引物，對單一樣本同時準確擴增多個核酸片段，進而完成對多個肉類品種的準確分析。Prusakova等[4]基于8個物種線粒體ATPase基因序列間的差異，設(shè)計特征引物，引物對于不同的DNA來源沒有交叉反應。用建立的多重PCR技術(shù)鑒別牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、火雞肉、貓肉、狗肉和老鼠肉，該方法可以同時精準鑒別8種肉類，靈敏度能達到30 pg DNA。Ali等[5]基于ND5、ATPase6和CytB基因設(shè)計5對引物，利用多重PCR技術(shù)可同時鑒別5種動物（貓、狗、豬、猴和鼠），該方法的靈敏度在0.01～0.02 ng DNA。

實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR體系中加入染料或者探針等熒光基團，通過熒光信號強度變化實時監(jiān)控反應中DNA濃度的變化，從而實現(xiàn)對肉及肉制品進行鑒別，通過DNA的濃度和CT值間的線性關(guān)系實現(xiàn)定量。Wang等[6]建立利用實時定量PCR技術(shù)鑒別山羊肉中豬肉的方法，豬肉添加量在5%～80%之間，山羊肉和豬肉的比值與CT值間的線性條件較好。同時，Xu等[7]建立實時定量多重PCR技術(shù)鑒別不同肉源（鴨肉、豬肉、雞肉和牛肉），該方法效果較好，準確度約98%，單個物種的靈敏度為0.01%。

微滴數(shù)字PCR是近年來迅速發(fā)展的一種核酸精準定量技術(shù)，通過將模板大量稀釋到單個反應單元進行目標分子的PCR擴增，根據(jù)熒光信號，通過陽性反應器的數(shù)量計算目標序列的拷貝數(shù)。其優(yōu)點是直接完成DNA的絕對定量，而不需要標準曲線。Chen等[8]應用微滴數(shù)字PCR技術(shù)分別建立牛肉及其制品中豬肉和鴨肉的含量檢測的方法，該方法樣品中DNA濃度的最低檢出限和最低定量限分別為0.001%和0.01%，并應用該方法對市場樣品檢測，效果良好。Cao等[9]基于細胞色素B基因（cytB基因）應用微滴數(shù)字PCR法建立鯧魚物種鑒定和定量的方法，該方法的絕對檢測限和定量限分別為2拷貝/mL和21拷貝/mL。

1.2 DNA條形碼技術(shù)

針對未知樣品檢測，DNA條形碼技術(shù)是近年來興起的用于肉類真?zhèn)舞b定的新型技術(shù)。該技術(shù)其原理就是依靠標準、能夠變異、容易擴增并且相對較短的DNA片段，該片段在物種內(nèi)具有足夠的特異性和種間足夠的多樣性，能夠?qū)崿F(xiàn)對物種進行快速、準確識別和未知物種鑒定，類似于商店的商品標簽碼。勵炯等[10]基于線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因（COI基因）的DNA微條形碼技術(shù)建立牛羊肉制品中6種廉價肉的摻假鑒定方法，所有肉類的擴增效率都為100%，廉價肉的檢出限都在10%以內(nèi)，該方法靈敏度合適，前處理簡單，可用于高經(jīng)濟價值的熟肉制品中摻雜摻假鑒定。Cottenet等[11]利用高通量測序技術(shù)構(gòu)建復雜樣品的多物種DNA條形碼鑒別技術(shù)，成功分析46種純?nèi)忸惡突旌先忸愇锓N，包括一些近緣物種，如野牛與牛肉。此外，該方法也適用于加工肉制品的鑒定。

2 光譜技術(shù)在肉及肉制品真實性鑒別中的應用

近年來光譜技術(shù)逐漸被應用于食品安全分析，是無損檢測的重要技術(shù)之一。光譜技術(shù)應用原理是在不同波長下肉及肉制品中一些基本營養(yǎng)成分如水分、脂肪、蛋白質(zhì)、脂肪酸或氨基酸等小分子化合物產(chǎn)生光譜不同。該技術(shù)具有前處理方法簡單、檢測速度快和不破壞樣品營養(yǎng)物質(zhì)等優(yōu)點。光譜技術(shù)在肉及肉制品真實性檢測方面，主要有紅外光譜法、拉曼光譜技術(shù)和高光譜成像技術(shù)。

紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）是指頻率在780～25 000 μm之間的電磁波，能引起分子中振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，不同物質(zhì)通過檢測分析紅外線被吸收情況而得到的紅外光譜。近紅外光譜法和中紅外光譜被廣泛應用于肉制品摻雜摻假的檢測控制。Leng等[12]利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLSR）建立牛肉制品中豬肉和鴨肉成分鑒別方法，結(jié)果表明，判別分析模型能夠區(qū)分牛肉與豬肉和鴨肉的比率分別為100%和91.5%，而PLSR模型區(qū)分牛肉與豬肉和鴨肉的比率95.80%和95.69%。MAbood等[13]利用傅里葉近紅外光譜對38種肉源中豬肉進行檢測，結(jié)果表明，基于PCA分析和PLS-DA都能夠快速準確地區(qū)分豬肉與其他肉類，且所建立的PLSR模型對摻假鑒別準確率為97.74%。另外，國外研究者采用中紅外光譜結(jié)合PLS-Kernel預測模型分析建立牛肉及其制品中豬肉的鑒別方法，該方法的豬肉最低檢出限為1.4%，該方法的應用對于清真食品安全管理具有廣闊的前景[14]。

拉曼光譜（Raman spectra，RS）是由物質(zhì)分子對光源的散射產(chǎn)生的一種非破壞性的指紋成像技術(shù)。拉曼光譜與入射光強度無關(guān)，與樣品組成物質(zhì)本身的極化率有關(guān)，并結(jié)合化學計量學實現(xiàn)肉制品摻假鑒別。Nunes等[15]基于功能性成分氨基酸、脂肪和蛋白質(zhì)建立RS結(jié)合PLS-DA的模型，可以準確分析出豬肉產(chǎn)品中的非肉類成分卡拉膠，該方法效果顯著。Al-Sarayreh等[16]利用拉曼光譜建立不同動物油脂（牛油、豬油、雞油和鴨油）的鑒別方法，在牛油中從0～50%添加豬油和鴨油進行檢測，表明該方法線性條件較好。

高光譜成像光譜技術(shù)（Hyperspectral imaging spectroscopy，HIS）是將光譜技術(shù)與圖像處理技術(shù)相結(jié)合，可以同時獲得光譜分辨率和空間分辨率，快速高效的獲得光譜數(shù)據(jù)信息和空間信息。由于快速、無損和無復雜的前處理等優(yōu)點，被用于肉制品摻雜摻假的鑒定研究中。Zhang等[17]利用高光譜成像收集不同狀態(tài)的羊肉、牛肉和豬肉肌肉的掃描圖像數(shù)據(jù)集，并使用深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）模型提取光譜和空間特征，對紅肉制品摻假進行綜合分析，結(jié)果表明，CNN模型在不依賴于產(chǎn)品狀態(tài)的情況下，總體分類準確率達到94.4%，可以作為快速、可靠、無損檢測紅肉制品摻假的有力工具。Jiang等[18]基于高光譜成像技術(shù)研究肉餡中內(nèi)臟摻雜摻假情況，通過對180個摻假樣品分析，建立PLSR模型，該模型的預測系數(shù)為98%，誤差為4.25%。

3 色譜、質(zhì)譜技術(shù)在肉及肉制品真實性鑒別中的應用

色譜、質(zhì)譜技術(shù)是定性和定量肉及肉制品中蛋白質(zhì)和多肽的基本常用工具，色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合可精準分析復雜物質(zhì)的成分和含量，該技術(shù)具有檢測速度快，儀器靈敏度高，應用范圍廣的優(yōu)點。色譜技術(shù)是基于蛋白質(zhì)和多肽的特性，選擇合適的流動相在相應的固定相進行洗脫，不同物質(zhì)或成分以不同速度在固定相中移動，最終達到分離的效果。質(zhì)譜技術(shù)是利用蛋白質(zhì)組學的研究思路，基于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物多肽的離子質(zhì)荷比，得到每個肽段的一級和二級質(zhì)譜圖，依靠蛋白數(shù)據(jù)庫（Uniprot和NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫）進行比對，尋找特異性多肽。因此，基于色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合使用可實現(xiàn)蛋白或多肽的鑒別。Wang等[19]基于LC-QTOF-MS技術(shù)從5種動物肉源（牛、羊、豬、雞和鴨肉）中篩選出56個特征多肽，再通過LC-MS/MS對特征肽段的特異性進行篩查，最終分別得到4，3，3，6和4條多肽片段被用于牛、羊、豬、雞和鴨肉的鑒別。Hu等[20]基于特征肽段GDSVAYGLK作為標記物，利用UPLC-MS/MS技術(shù)建立測定水牛、牦牛、綿羊和山羊肉中骨橋蛋白含量的方法，該方法的測定結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附試驗實驗結(jié)果一致。李瑩瑩等[21]利用LC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對羊肉中鴨肉摻假情況進行研究，篩選出鴨肉的專屬多肽152條。利用LC-MS/MS技術(shù)對鴨肉特異性進行篩查，最終確定10條鴨肉肽段作為定性離子的母離子，并通過不同比例添加模擬摻假樣品進行定量研究，研究結(jié)果表明該方法的鴨肉的最低檢出限是0.5%。Stachniuk等[22]基于LC-QTOF-MS/MS技術(shù)在兔肉中篩選了區(qū)別于其他物種的49個熱穩(wěn)定性肽段，而在兔肉加工肉制品中只檢測到穩(wěn)定性強的3個肽段，分別為SSVFVADPK，AFFGHYLYEVAR和PHSHPALTPEQK，可被用于兔肉加工肉制品的鑒別分析。Fornal等[23]通過不同的食品加工方式，比如均質(zhì)化、蒸煮、烤制、干燥和殺菌處理后，篩選出雞、鴨和鵝肉中熱穩(wěn)定性較強的特征肽段。利用LC-MS技術(shù)建立快速篩查加工肉制品中雞、鴨和鵝肉的鑒別方法，該方法可用于肉制品摻假和食品標簽與成分相符檢測等食品安全監(jiān)管領(lǐng)域。

4 免疫學檢測技術(shù)在肉及肉制品真實性鑒別中的應用

免疫學檢測技術(shù)是基于抗原和抗體的特異性結(jié)合，實現(xiàn)樣品的分析檢測。其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)是免疫學檢測技術(shù)的常用的技術(shù)手段，主要包括間接酶聯(lián)免疫分析和夾心酶聯(lián)免疫分析。酶聯(lián)免疫技術(shù)的工作原理是抗原或抗體吸附在固相載體表面，酶結(jié)合抗原或抗體后仍保持其酶活性與免疫活性，通過加入相應的抗原或抗體進行反應，根據(jù)底物顏色的變化來判斷免疫反應的進程。ELISA技術(shù)具有特異性強、成本低和操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用到肉及肉制品真實性的甄別。國外研究者開發(fā)一種夾心ELISA試劑盒能夠快速量化檢測在煮熟馬肉、豬肉、牛肉、雞肉和羊肉中豬肉的含量，該方法中蒸煮和高壓處理得到的熟制豬肉的檢出靈敏度分別為0.000 14%和0.000 4%，且定量分析范圍為0.05%～3.2%[24]。Kuswandi等[25]基于抗豬免疫球蛋白G抗體開發(fā)一種橫向流動免疫傳感器用于牛肉加工制品中豬肉摻假檢測，該方法檢出限為0.01%，并與市售ELISA試劑盒比對，試驗發(fā)現(xiàn)結(jié)果準確可靠。Benli等[26]利用酶聯(lián)免疫技術(shù)和PCR技術(shù)對60份商業(yè)牛肉發(fā)酵香腸中雞肉摻假現(xiàn)象進行研究，結(jié)果表明，2種檢測方法的檢測結(jié)果一致，5份樣品存在雞肉摻假情況。由于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)對抗體的特異性要求高，且受到肉制品的加工方式等條件的影響較大，因此，需要其他技術(shù)手段的輔助檢測。

5 代謝組學技術(shù)在肉及肉制品真實性鑒別中的應用

組學技術(shù)是較熱門的科學研究手段，其中代謝組學是以高通量檢測技術(shù)和多元數(shù)據(jù)分析為手段，通過研究機體代謝物（分子量＜1 500 Da）的差異變化，進而探究代謝機制的新技術(shù)。在肉品科學領(lǐng)域隨著代謝組學技術(shù)的不斷拓展和應用，涉及肉品安全、肉品營養(yǎng)與風味和肉品加工等多個方面。代謝組學的基本原理是基于代謝圖譜分析和代謝標志物的篩選來實現(xiàn)肉及肉制品安全性和真實性分析和鑒別。

根據(jù)肉及肉制品中代謝物的差異，代謝組學技術(shù)實現(xiàn)對牛肉、羊肉和豬肉的有效鑒定。Pavlidis等[27]利用頂空固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜法對牛肉中添加不同比例的豬肉進行代謝物分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合樣品中2-丁醇和1-辛烯-3-醇是主要代謝物，同時建立一種基于揮發(fā)性指紋圖譜的鑒別方法，鑒別正確率達99%。同時，對牛肉和馬肉樣品中甘油三酯圖譜的差異研究表明，馬肉中含有較高比例的多不飽和脂肪酸，因此可根據(jù)脂質(zhì)組學分析結(jié)果來判別牛肉中馬肉的摻假情況[28]。另外，孟新濤等[29]研究基于氣相離子遷移譜技術(shù)建立羊肉中豬肉和雞肉摻假鑒別的方法，結(jié)果表明羊肉中豬肉的添加比例大于5%時，正己醇、2, 3-丁二酮、羥基丙酮等39種主要風味物質(zhì)的含量在增加，而2-乙基-1-己醇、芝麻酚、2-戊酮的含量在降低；羊肉中雞肉的添加比例大于10%時，混合物的主要風味物質(zhì)正己醇、3-甲硫基丙醛、反-2-辛烯醛的含量在降低，而甲醛等風味物質(zhì)在增加。

6 結(jié)語

肉及肉制品的摻假現(xiàn)象是畜肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展中存在的重要問題，所涉及的鑒別技術(shù)方法是近幾年應用于肉及肉制品真實性鑒別的主要技術(shù)手段。分子生物學技術(shù)的優(yōu)點在于特異性強、靈敏度高，對肉及肉制品摻假檢測應用廣泛，但需要開發(fā)精準的定量檢測方法。光譜技術(shù)具有制樣簡便、無損、綠色與高效等特點，但基于化學計量學所建立的模型預測效果受諸多外界條件的影響，通用性不強。ELISA技術(shù)的優(yōu)點是易于操作，使用范圍廣泛，分析時間短、靈敏度和通量較高，但尋找一個熱穩(wěn)定的抗原和研制出針對此抗原的特異性單克隆抗體難度較大。組學技術(shù)是未來發(fā)展方向，基于質(zhì)譜技術(shù)的精準定性定量分析可為肉類成分的檢測開辟一個新途徑。肉制品加工工藝從簡單到復雜的轉(zhuǎn)變，進一步對肉制品真實性鑒別技術(shù)提出更高要求，預期未來可通過多組學、多技術(shù)相互融合發(fā)展。因此，發(fā)揮肉及肉制品安全檢測技術(shù)的互補優(yōu)勢，將成為重要的技術(shù)開發(fā)的發(fā)展方向，為檢測肉及肉制品真實性問題提供更為完善的技術(shù)支撐，保障肉及肉制品的安全性。