鵝源星狀病毒TaqMan探針和SYBR Green Ⅰ染料法熒光定量PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用比較

鄧昕竹,余 群，朱盈名，趙自亮，陸 婧，趙光偉,，張立武，程方俊*，楊曉偉,*

(1.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司，重慶 榮昌 402460)

近年來，我國養(yǎng)鵝場不斷發(fā)生一種以痛風(fēng)癥為主要特征的疾病，主要表現(xiàn)為采食量下降、精神沉郁、拉石灰樣稀便、脫水、消瘦、癱瘓，剖檢可見腎腫大斑駁、腎臟輸尿管有白色尿酸鹽沉積、內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)等處有白色尿酸鹽附著或沉積，臨床稱鵝“痛風(fēng)病”[1]。該病多發(fā)8～19日齡雛鵝，一旦感染，全群發(fā)病率80%以上，病死率23.6%～78.6%，朗德鵝和國內(nèi)地方品種如馬崗鵝、四川白鵝、皖西白鵝、獅頭鵝、籽鵝、五龍鵝、泰州鵝等均易感[2-4]。研究人員綜合分析認(rèn)為飼料蛋白含量高、鈣磷比例失調(diào)不是導(dǎo)致該病暴發(fā)流行的主要原因，經(jīng)病原分離鑒定、宏基因組測序及動物回歸試驗，證實該病由鵝源星狀病毒(goose astrovirus，GoAstV)引起[5-6]。

星狀病毒(astrovirus，AstV)是廣泛存在于人、多種哺乳動物和鳥類的一種RNA病毒。圓形、無囊膜，是單股正鏈RNA病毒，直徑為25～35 nm，屬于星狀病毒科[7-8]，因在電子顯微鏡下，病毒表面有5～6個突起，結(jié)構(gòu)呈星形，故稱之為星狀病毒[9]。全基因組長度為6.1～7.9 kb，含有3個開放閱讀框ORF1a、ORF1b和ORF2。根據(jù)其感染宿主的不同而劃分為2個病毒屬：哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬[10]。因為ORF1a 3′端基因片段為了適應(yīng)新宿主的插入或缺失[11]，AstV ORF1a、ORF1b和ORF2具有長度多樣性。AstV ORF1a和ORF1b閱讀框之間存在重疊區(qū)域，哺乳動物AstV重疊區(qū)域為10～148 nt，而禽AstV重疊區(qū)域為12～45 nt，同時重疊區(qū)包含1個對下游RNA依賴性RNA聚合酶的翻譯重要的核糖體移碼信號[12]。在不同種的AstV之間ORF1b基因長度差異最小，并且其編碼的RNA依賴性RNA聚合酶蛋白在AstV蛋白中最保守；ORF2其內(nèi)部基因高度變異，常出現(xiàn)基因突變現(xiàn)象，在3個ORFs中具有最大的變異性；AstV基因分型主要依據(jù)ORF2的核酸序列演化分析[13-14]。

目前針對GoAstV的檢測方法主要是普通RT-PCR方法，但與熒光定量PCR方法相比，其敏感性較低，因而為建立一種靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、重復(fù)性更好的臨床檢測手段，本試驗針對GoAstV的保守基因設(shè)計引物和熒光探針，分別建立基于TaqMan探針和SYBR Green Ⅰ染料的熒光定量PCR檢測方法，并比較兩者的檢測效果，為GoAstV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒與臨床病料GoAstV，小鵝瘟病毒(GPV)，鵝副黏病毒(GPMV)，鴨呼腸孤病毒(NDRV)，鴨圓環(huán)病毒(DuCV)，鴨肝炎病毒Ⅰ、Ⅲ型(DHV-1、DHV-3)和腺病毒Ⅱ型(DAdV-2)等病毒均由本實驗室分離鑒定并保存。臨床樣本來自2020年6月至2021年6月期間山東、四川、重慶等鵝場送檢的病料，實驗室-40℃保存。

1.2 主要試劑RNAiso Plus、rTaq Mix、瓊脂糖、溴化乙錠(EtBr EB)、DNA Marker(2000/5000)、Probe qPCR Mix、TB Green Premix Ex TaqⅡ購自TaKaRa公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pBLUE-T快速克隆、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 引物和探針基于GoAstV OFR1b的基因保守區(qū)域，利用軟件Primer 5.0設(shè)計1對TaqMan熒光引物Q1-F：ATTGACACAAGCCTATCATC-GC，Q1-R：CTGGCTCACCCATTTTGAGATAG，及探針5′-FAM-TGAGCGTCGGCAATGACCCA-TGCTGT-MGB-3′，擴(kuò)增目的片段大小為123 bp。1對SYBR GreenⅠ熒光引物Q2-F：TTATCCCTGAGTAATCTGA，Q2-R：GGAAATCCAAGTGGC，擴(kuò)增目的片段大小為134 bp；1對普通RT-PCR引物GAstV-F：5′-GATTGGACCCGTTATGAT-3′，GAstV-R：5′-TTTGACCCACATACCA-AA-3′，擴(kuò)增目的片段大小為434 bp。均由華大基因有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄將儲存于-80℃的GoAstV尿囊液按照RNAiso Plus說明書提取RNA，于-80℃保存；按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作得到病毒cDNA，于-20℃保存。

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的建立以獲取的cDNA為模板，和引物GAstV-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：rTaq Mix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，最后4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用膠回收試劑盒回收并純化目的片段，使用pBLUE-T快速克隆試劑盒進(jìn)行純化產(chǎn)物的連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送華大基因有限公司測序。將測序鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名pBLUE-T-GoAstV，采用超微量分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)品濃度，根據(jù)公式：(6.02×1023copies/mol)×DNA量(g)/[DNA長度(堿基數(shù))×660 g/(mol·堿基)]=拷貝數(shù)，計算標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。利用ddH2O將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pBLUE-T-GastV連續(xù)10倍梯度稀釋至10-10，將其作為模板按照已優(yōu)化的條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.6 熒光定量PCR方法的建立與優(yōu)化

1.6.1TaqMan探針法熒光定量PCR方法的建立 反應(yīng)體系為20 μL，其中Probe qPCR Mix 10 μL，特異性探針2 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s共40個循環(huán)。用單一變量法對反應(yīng)體系中上下游引物、特異性探針的濃度以及反應(yīng)條件依次進(jìn)行優(yōu)化。

1.6.2SYBR Green Ⅰ染料法熒光定量PCR方法的建立 反應(yīng)體系為20 μL，其中TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 5 s、60℃ 30 s共40個循環(huán)。用單一變量法對反應(yīng)體系中上下游引物的濃度和反應(yīng)條件依次進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 探針法和染料法熒光定量PCR的比較以倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板，對本試驗建立并優(yōu)化的2種熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性的驗證及比較。

1.7.1特異性試驗 用病毒RNA提取試劑盒提取GoAstV、NDRV、DHV-1和DHV-3基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用病毒DNA試劑盒提取GPV、GPMV、DadV-2和DuCV的基因組DNA。應(yīng)用本試驗已經(jīng)建立優(yōu)化的2種熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時設(shè)置陰性對照，驗證并比較2種方法的特異性。

1.7.2敏感性試驗 以稀釋濃度2.5×106～2.5×100copies/μL的質(zhì)粒為模板進(jìn)行敏感性檢測，以Ct < 35且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的“S”型擴(kuò)增曲線的最低濃度作為2種方法的檢測靈敏度。

1.7.3重復(fù)性試驗 每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)性試驗，通過計算重復(fù)性試驗中Ct值的變異系數(shù)來進(jìn)行檢測方法的穩(wěn)定性的評估和比較。

1.8 臨床樣品的檢測收集臨床上疑似GoAstV的雛鵝痛風(fēng)的病料，分別用本試驗建立的TaqMan熒光定量PCR方法、SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR和普通RT-PCR方法進(jìn)行檢測，并比較其檢出率。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果以GoAstV和重組質(zhì)粒pBLUE-T-GoAstV分別為模板，用引物GastV-F/R進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為430 bp，產(chǎn)物大小與預(yù)期片段大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1.GoAstV陽性樣品；2.重組質(zhì)粒pBLUE-T-GoAstV；3.陰性對照

2.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度測定及拷貝數(shù)計算通過核酸蛋白檢測儀測定陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度的平均值為94 mg/L，利用拷貝數(shù)計算公式將該結(jié)果換算為拷貝數(shù)，最終計算得到構(gòu)建的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為2.5×1010copies/μL。

2.3 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR溶解曲線重組質(zhì)粒pBLUE-T-GoAstV經(jīng)SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法擴(kuò)增，溶解曲線結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在82℃左右均出現(xiàn)單一波峰(圖2)，無引物二聚體和非特異擴(kuò)增峰。

1.GoAstV；2.陰性對照

2.4 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的優(yōu)化TaqMan探針法：反應(yīng)體系為20 μL，其中Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，探針0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。最終反應(yīng)條件為95℃ 1 min， 95℃ 5 s、60℃ 31 s共40個循環(huán)。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR：反應(yīng)體系為20 μL，其中TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。最終反應(yīng)條件為94℃ 1 min，94℃ 5 s、55℃ 31 s共40個循環(huán)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以2.5×102～2.5×108copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板分別用TaqMan熒光定量PCR方法和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進(jìn)行定量檢測，以讀取的Ct值為y軸，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析獲得TaqMan熒光定量PCR方法擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)R2為0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-3.026x+37.331(圖3A)；SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)R2為0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-3.407x+39.848(圖3B)。結(jié)果表明，2種熒光定量PCR方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線都能夠準(zhǔn)確地反映目的基因的擴(kuò)增。

A.探針法標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.染料法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 特異性試驗用所建立并優(yōu)化的2種熒光定量PCR方法對GPV、GPMV、NDRV、DuCV、DHV-1、DHV-3、DAdV-2和GoAstV的cDNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示2種熒光定量PCR方法均僅對GoAstV有特異性擴(kuò)增，其他病原及陰性對照均無特異性擴(kuò)增，特異性良好(圖4)。

A.TaqMan探針法；B.SYBR GreenⅠ染料法。1.GoAstV；2～8.GPV、GPMV、NDRV、DuCV、DHV-1、DHV-3、DAdV-2；9.陰性對照

2.7 敏感性試驗以2.5×100～2.5×106copies/μL 10×倍比稀釋的重組質(zhì)粒pBLUE-T-GoAstV為模板，用本試驗建立優(yōu)化的2種熒光定量PCR方法和普通RT-PCR方法分別進(jìn)行檢測。TaqMan熒光定量PCR方法的最低檢測濃度為2.5×101copies/μL(圖5A)，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的最低檢測濃度為2.5×102copies/μL(圖5B)，普通RT-PCR方法的最低檢測濃度為2.5×103copies/μL(圖5C)。結(jié)果表明：本試驗建立的TaqMan和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法分別比普通RT-PCR方法的靈敏度高100倍和10倍；TaqMan法比SYBR GreenⅠ染料法靈敏度高10倍，說明TaqMan探針法熒光定量PCR方法的靈敏性更高。

A.TaqMan探針法;B.SYBR Green Ⅰ染料法(1～6.2.5×106 ～2.5×101 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；7.2.5×100 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒)；C.普通RT-PCR(M.DL2000 DNA Marker；1～4.2.5×106 ～2.5×103 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；5～7.2.5×102 ～2.5×100 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒)

2.8 重復(fù)性試驗TaqMan熒光定量PCR：以5個稀釋度的重組質(zhì)粒pBLUE-T-GoAstV為模板分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示組內(nèi)Ct值變異系數(shù)(CV)為0.18%～0.70%，組間Ct值CV為0.17%～1.28%，均小于1.5%(表2)，表明該方法具有良好的可重復(fù)性。

表1 TaqMan探針法熒光定量PCR重復(fù)性檢測結(jié)果

表2 SYBR GreenⅠ染料法熒光定量PCR重復(fù)性檢測結(jié)果

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR：以5個稀釋度的重組質(zhì)粒pBLUE-T-GoAstV為模板分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示組內(nèi)Ct值CV為0.50%～1.85%，組間Ct值CV為1.19%～2.49%，均不超過2.50%(表3)，表明該方法也具有良好的可重復(fù)性。

對比2種方法，結(jié)果顯示TaqMan熒光定量PCR方法的組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR的組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)，說明TaqMan熒光定量PCR方法重復(fù)性更好，更加穩(wěn)定。

2.9 臨床樣品的檢測分別用本試驗建立的TaqMan熒光定量PCR方法、SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法和普通RT-PCR方法對臨床上71份樣品進(jìn)行檢測，TaqMan熒光定量PCR方法檢測出陽性35例，檢出率為49.30%；SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法檢測出陽性30例，檢出率為42.25%；普通RT-PCR方法檢測出陽性21例，檢出率為29.58%。結(jié)果顯示TaqMan熒光定量PCR方法的檢出率最高，與敏感性試驗結(jié)果相一致。

3 討論

A.tV的全基因組包含1個5′-非翻譯區(qū)(UTR)，3個開放的閱讀框(ORFs)，3′-UTR和poly(a)尾巴[15]。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼病毒粒子衣殼蛋白(Cap)，比較兩者ORF1更為保守。星狀病毒科病毒ORF1a、ORF1b蛋白通常含有某些具有特殊功能的保守氨基酸基序，編碼星狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，其中包括RNA依賴性RNA聚合酶[16]。ORF1b閱讀框內(nèi)RdRp結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有4個保守基序，并包含有AstV保守的RNA聚合酶基序[17]；蒲露莎[18]分離鑒定的GoAstV的2株分離株在ORF1b中沒有發(fā)生氨基酸的突變；張玉杰等[19]分離鑒定的GoAstV的2株分離株分別與GenBank上已發(fā)表的星狀病毒在ORF1a、ORF1b和ORF2所編碼氨基酸序列進(jìn)行比對分析，ORF1b氨基酸序列相似性均為最高；這些數(shù)據(jù)均表明，ORF1b序列高度保守，因此本試驗在ORF1b內(nèi)選取434 bp的片段作為檢測的靶標(biāo)，能夠保證本方法的準(zhǔn)確性。

電子顯微鏡是最初應(yīng)用于診斷AstV的病原學(xué)診斷方法，卻不適用于大量的臨床檢測，而GoAstV不產(chǎn)生凝血反應(yīng)，導(dǎo)致一些血清學(xué)診斷方法不能應(yīng)用。目前，臨床上檢測GoAstV的方法還是以普通RT-PCR為主，而該方法雖然操作簡易但耗時長、敏感性弱且需要凝膠電泳，不利于臨床上快速診斷病原；張玉霞等[20]建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測方法對GoAstV進(jìn)行檢測，該方法能在恒溫條件下快速擴(kuò)增核酸。但LAMP和普通RT-PCR一樣，只能做定性分析，不能準(zhǔn)確定量。實時熒光定量PCR作為近年來迅速發(fā)展起來的一種新興檢測技術(shù)，通過采集PCR反應(yīng)體系中的熒光信號實時檢測每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行精確的定量分析。與傳統(tǒng)PCR方法相比：它的敏感性、自動化程度更高，耗時短，能夠?qū)崿F(xiàn)實時監(jiān)控，既能定性又能定量，操作簡單；所以本試驗采用了熒光定量的檢測方法。

實時熒光定量PCR收集的熒光信號來源主要是熒光探針和熒光染料，分為探針法與染料法。TaqMan探針法通過將標(biāo)記有熒光素的探針引物加入模板DNA，反應(yīng)中切斷TaqMan探針，熒光素游離于反應(yīng)體系中，特定光激發(fā)熒光，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，實現(xiàn)熒光信號的累積同步于PCR產(chǎn)物的形成。TaqMan-MGB標(biāo)記技術(shù)在傳統(tǒng)TaqMan探針的基礎(chǔ)上，用MGB基團(tuán)修飾3′末端非熒光淬滅基團(tuán)，在不增加探針堿基數(shù)的條件下，將探針的溫度值提高至少10℃，特異性提高并且容易設(shè)計[21]。此外，TaqMan-MGB的3′末端標(biāo)記有非熒光淬滅基團(tuán)，可減少熒光背景并提高信噪比，特異性引物對和特異性探針序列可雙重保障反應(yīng)的特異性。SYBR Green Ⅰ染料法使用過量的熒光染料SYBR，熒光染料SYBR與DNA雙鏈結(jié)合發(fā)射熒光信號，而不與雙鏈結(jié)合的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，以保證熒光信號的增加同步于PCR產(chǎn)物的增加。有研究選取了GoAstV的ORF1a基因[23]或ORF2基因[24-25,17]建立GoAstV的熒光定量PCR檢測方法，本試驗選取GoAstV更為保守的ORF1b基因保守序列片段，分別建立了TaqMan熒光定量PCR方法和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，通過單一變量法優(yōu)化條件，分別建立了2種方法的最佳條件。研究也對2種熒光定量方法進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性的驗證，并從這幾個方面比較2種方法的優(yōu)劣。特異性試驗結(jié)果顯示2種方法均能特異性檢測出GoAstV，對GPV、GPMV、NDRV、DuCV、DHV-1、DHV-3和DAdV-2這些常見病毒檢測均呈陰性，說明2種方法均有良好的特異性；敏感性試驗結(jié)果顯示，TaqMan熒光定量PCR方法的最低檢測濃度為2.5×101copies/μL，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的最低檢測濃度為2.5×102copies/μL，說明2種方法均有較好的敏感性。但通過比較發(fā)現(xiàn)，TaqMan熒光定量PCR方法比SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法敏感10倍，具有更好的靈敏度，能更靈敏地檢測出低濃度病毒樣品；重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，TaqMan熒光定量PCR方法組內(nèi)與組間變異系數(shù)均小于1.5%，SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法組內(nèi)與組間變異系數(shù)均小于2.5%，說明2種方法均有良好的重復(fù)性，方法穩(wěn)定性高，檢出結(jié)果具有可靠性。對臨床樣本的檢測結(jié)果顯示2種方法對普通RT-PCR檢測結(jié)果陽性的樣品檢測結(jié)果也均為陽性，且TaqMan熒光定量PCR方法的陽性檢出率要高，符合本試驗的驗證結(jié)果。

本試驗成功建立了基于GoAstV保守基因ORF1b的TaqMan和SYBR GreenⅠ的實時熒光定量PCR方法，2種方法都具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性；相比之下，TaqMan探針法靈敏度更高。2種熒光定量PCR方法均可應(yīng)用于GoAstV的臨床檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查。