傳染性法氏囊病毒VP2蛋白嵌合新城疫病毒樣顆粒的構建和鑒定

邵亞男,馮嘉軒，李金斗，郭春紅，丁佳欣，陳銘樺，丁 偉，單春暉，張 頔，丁 壯

(吉林大學 動物醫(yī)學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害3～6周齡雛雞,其屬于免疫抑制性疾病[1]。自1962年被首次報道后在全球范圍內廣泛傳播流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。我國于1979年由周蛟[3]首次發(fā)現(xiàn)并分離該病毒，而后在我國各地陸續(xù)有強毒株、超強毒株和變異株被分離，目前IBDV幾乎散布于我國所有養(yǎng)禽地區(qū)。臨床上感染IBDV后，會對法氏囊造成不可逆的損傷，其破壞雞群的體液免疫，造成免疫抑制，可提高其他疾病的易感率與病死率[4]，特別是致死率極高的新城疫(Newcastle disease，ND)，一旦感染將造成不可估量的損失。大量研究表明VP2蛋白是IBDV重要的保護性蛋白[5-6]，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是研制IBDV的主要候選抗原。IBDV通過VP2蛋白與受體細胞膜吸附結合，侵入細胞[7]，在病毒的感染復制中起到關鍵作用，因此本研究利用VP2蛋白作為疫苗的主要抗原蛋白。

ND是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性禽類傳染病[8]，被我國農業(yè)農村部列為一類動物疫病。NDV在感染宿主細胞時，首先由血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白與細胞膜上的唾液酸受體結合，進一步激活F蛋白(fusion protein)，由F蛋白參與促進病毒粒子與細胞膜融合過程[9]，這表明NDV的感染復制過程與HN、F蛋白密切相關。研究表明，HN、F蛋白作為抗原蛋白構建疫苗能夠誘導產(chǎn)生很高的抗體水平[10-11]。20世紀初，PANTUA等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，M蛋白(matrix protein)是NDV的驅動力蛋白，單獨表達M蛋白即可形成顆粒狀結構。因此本研究將IBDV強毒株保護性蛋白VP2替換NDV HN蛋白胞外域部分，與NDV的M、F和HN蛋白共轉染至昆蟲細胞，組裝成含有IBDV候選抗原表位的NDV病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)。因窗口期的存在，現(xiàn)有的IBDV疫苗與NDV疫苗不能同時使用，同時增加了人力物力和時間成本，因此研制一針多防、安全有效的新型疫苗刻不容緩。

自投射電子顯微鏡出現(xiàn)以來，VLPs也逐漸進入人們的視野[13]。VLPs具有類似于在有限空間內顯示密集重復表位特征的天然病毒粒子的形態(tài)[14]，屬于更結構化的重組疫苗，在刺激免疫系統(tǒng)方面具有“強激活劑”的美稱。此外，VLPs不具有病毒基因組，缺乏復制能力，是非感染性的重組疫苗，在生物安全性、免疫原性和平臺豐富性方面展示了極高的優(yōu)勢。近年來，一些VLPs產(chǎn)品獲得了人們的廣泛認可，并取得了顯著的臨床效果和經(jīng)濟價值。目前，市場上的乳頭瘤病毒(HPV)[14-16]、乙型肝炎病毒(HBV)[17-19]、戊型肝炎病毒(HEV)[20]、流感病毒(influenza virus)和甲型肝炎病毒(HAV)[21-22]幾種重組疫苗都基于高度純化的VLPs。此外，針對瘧疾[23]、諾沃克病毒[24]和基孔肯亞病毒(CHIK)[25]的VLPs疫苗目前正在臨床試驗中。這些有效的臨床應用和極高的市場認可度鼓勵了更多的疾病利用VLPs平臺開展臨床前和臨床上相關疫苗的開發(fā)和測試。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及載體Sf9昆蟲細胞(CRL-1711)、E.coliDH10Bac、E.coliDH5α感受態(tài)細胞、rBV NA-1 M、rBV NA-1 HN、rBV NA-1 F、桿狀病毒表達載體pFastBac1均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、X-gal購自北京全式金生物技術有限公司；SalⅠ、KpnⅠ限制性內切酶購自TaKaRa公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent購自ROCHE公司；Sf-900TMⅡ SFM無血清無蛋白昆蟲細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自BI公司；VP2多抗由本實驗室保存。

1.3 目的基因的優(yōu)化及合成根據(jù)昆蟲細胞密碼子偏好性和pFastbac-1載體信息對GenBank：SH99(LM651365.1)VP2核酸序列進行密碼子優(yōu)化，并依次引入蜂素信號肽序列、His標簽序列、TEV切割序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，命名為PUC-VP2。

1.4 引物設計根據(jù)生物公司合成的PUC-VP2與NA-1(DQ659677.1)HN核酸序列和pFastBac1載體信息分別設計含pFastBac1載體序列和柔性肽的VP2、含有柔性肽和pFastBac1載體信息且去除胞外域的HN引物及M13通用引物，詳細引物信息見表1。

表1 詳細引物信息

1.5 重組穿梭質粒的構建和鑒定以本實驗室保存的pCI-NA-1為模板，通過特異性引物rdHN+pFastBac1-F、rdHN+linker-R擴增出去除胞外域且含有柔性肽和pFastBac1載體信息的片段uniseamless-rdHN-linker，uniseamless-rdHN-linker片段在與pFastBac1同源臂部分引入酶切位點BamHⅠ；利用生物公司合成的PUC-VP2質粒為模板，以rdVP2+linker-F、rdVP2+pFastBac1-R為引物特異性擴增出含pFastBac1載體序列和柔性肽的VP2片段，并將pFastBac1載體信息引入添加到MCS區(qū)的KpnⅠ酶切位點處，命名為uniseamless-rdVP2-linker。將pFastBac1空載體信息利用BamHⅠ、KpnⅠ進行雙酶切，酶切后的pFastBac1與經(jīng)過PCR擴增的uniseamless-rdHN-linker、uniseamless-rdVP2-linker利用1%的瓊脂糖凝膠鑒定正確后，膠回收其目的片段。將線性化的pFastBac1載體片段、uniseamless-rdHN-linker、uniseamless-rdVP2-linker與無縫克隆盒子中的Assembly Mix混勻，在同源重組酶的作用下進行無縫克隆。作用完成后轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，次日挑取單菌落接種到LB中進行菌液PCR鑒定。利用特異性引物和pFastBac1通用引物鑒定正確后的菌株再提取質粒，雙酶切鑒定，送去生物公司測序。將測序正確的重組穿梭質粒命名為pFastBac-cHN+VP2。

1.6 重組桿粒的構建和鑒定將構建好的重組穿梭質粒pFastBac-cHN+VP2轉化入E.coliDH10Bac感受態(tài)細胞中，通過藍白斑篩選的方法，篩選轉座完成的陽性菌落。挑取大小均一的單一白色菌落加入LB培養(yǎng)，利用特異性引物與通用引物進行菌液PCR鑒定。陽性菌液在3次涂板篩選獲取陽性菌落后，送至生物公司測序，測序正確的陽性質粒通過無內毒素提取試劑盒提取桿粒，再利用PCR方法鑒定，鑒定正確得到的桿粒即為rBacmid-cHN+VP2。

1.7 重組桿狀病毒的拯救和基因組鑒定將重組桿粒利用轉染試劑X-tre006De GENE HP DNA Transfection Reagent轉染至Sf9細胞，持續(xù)觀察。第5天出現(xiàn)細胞病變，收取細胞上清，即為第一代桿狀病毒，繼續(xù)盲傳3代，收獲細胞上清得到P3代桿狀病毒。采用病毒基因組提取試劑盒提取重組桿狀病毒基因組，利用特異性引物和通用引物進行PCR鑒定，以確保重組桿狀病毒構建正確，將鑒定正確的重組桿狀病毒命名為rBv-cHN+VP2。

1.8 IFA檢測鑒定重組桿狀病毒將細胞爬片放入細胞培養(yǎng)板中，在爬片上培養(yǎng)Sf9細胞至細胞密度約為80%。將rBv-cHN+VP2、rBv-M、rBv-HN、rBv-F以MOI=5共感染Sf9細胞，同時設置未感染組作為陰性對照，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，使用4%多聚甲醛溶液固定后，再通過Triton通透處理，一抗為NDV M、NDV F、NDV HN以及IBDV VP2的兔源多抗，二抗為FITC標記的豬抗兔IgG抗體，操作時嚴格避光。用Hoechst室溫避光進行染核后處理封片，利用熒光顯微鏡觀察。

1.9 IBD-ND cVLPs的產(chǎn)生與鑒定將Sf9細胞懸浮培養(yǎng)至2×106/mL，以MOI=5接種P4代rBv-cHN+VP2、rBv-M、rBv-HN、rBv-F，27℃、200 r/min環(huán)境下培養(yǎng)3 d，收集細胞上清經(jīng)高速離心機離心處理，繼續(xù)用超速離心機過20%，30%，60%蔗糖純化VLPs。將純化后的VLPs制樣通過Western blot鑒定，鑒定正確后再利用透射電鏡觀察VLPs的形態(tài)。

2 結果

2.1 目的基因的擴增以實驗室保存的pCI-NA-1為模板，通過特異性引物rdHN+pFastBac1-F、rdHN+linker-R擴增出去除胞外域且含有柔性肽和pFastBac1載體信息的片段uniseamless-rdHN-linker(圖1)，利用生物公司合成的PUC-VP2質粒為模板，以rdVP2+linker-F、rdVP2+pFastBac1-R為引物特異性擴增出含pFastBac1載體序列和柔性肽的VP2片段(圖2)，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小與預期相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.特異性引物PCR擴增cVP2基因產(chǎn)物

M.DL2000 DNA Marker；1.特異性引物PCR擴增cHN基因產(chǎn)物

2.2 重組穿梭質粒的鑒定線性化的pFastBac1載體片段與uniseamless-rdHN-linker、uniseamless-rdVP2-linker通過無縫克隆方法連接形成重組穿梭質粒pFastBac-cHN+VP2，重組穿梭質粒pFastBac-cHN+VP2利用pFastBac1通用引物鑒定以及BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，由pFastBac1通用引物鑒定結果(圖3)以及BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定結果(圖4)可知目的條帶與理論值相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.pFastBac通用引物鑒定

2.3 重組桿粒的鑒定將構建好的重組穿梭質粒轉化到E.coliDH10Bac菌中完成轉座過程，通過3次劃線涂板實現(xiàn)藍白斑篩選后，挑取完全的白斑接種到液體LB中，用M13通用引物和特異性引物進行菌液PCR。菌液PCR鑒定結果顯示目的條帶與理論值相符，重組桿粒rBacmid-cHN+VP2構建正確(圖5)。

M.DL5000 DNA Marker；1.cHN+VP2-pFastBac酶切鑒定

M.DL5000 DNA Marker；1.rBacmid-cHN+VP2 M13鑒定；2.rBacmid-cHN+VP2特異性引物鑒定

2.4 重組桿狀病毒的鑒定

2.4.1Sf9細胞病變 狀態(tài)良好的Sf9細胞在感染拯救的桿狀病毒后盲傳，持續(xù)用光學顯微鏡觀察，結果出現(xiàn)腫大變圓甚至破裂的狀態(tài)(圖6)，且生長速度較正常細胞緩慢。

A.正常Sf9細胞；B.rBv cHN+VP2感染后Sf9細胞

2.4.2基因組鑒定 將重組桿狀病毒rBv-cHN+VP2感染Sf9細胞后盲傳3代，收獲Sf9細胞培養(yǎng)上清提取重組桿狀病毒基因組，將獲得的重組桿狀病毒基因組通過PCR方法鑒定，鑒定引物包括特異性引物與M13通用引物，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示條帶大小與預期值相符(圖7)。

M.DL5000 DNA Marker；1.rBv-cHN+VP2基因組M13鑒定；2.rBv-cHN+VP2基因組特異性引物鑒定

2.4.3IFA鑒定 將處理好的桿狀病毒細胞爬片使用熒光倒置顯微鏡觀察，可見各試驗組均出現(xiàn)綠色熒光信號，而陰性對照組無熒光信號出現(xiàn)(圖8)，顯示各組分蛋白表達狀況正確。

圖8 IFA鑒定蛋白表達

2.5 IBD-ND cVLPs的產(chǎn)生與鑒定

2.5.1Western blot鑒定 純化后的IBD-ND cVLPs制樣后，分別用多克隆抗體NDV M、NDV F、NDV HN和IBDV VP2為一抗，F(xiàn)ITC標記的豬抗兔IgG抗體為二抗，通過Western blot鑒定，結果顯示各組分蛋白表達良好，cVLPs構建正確(圖9)。

圖9 IBD-ND cVLPs的Western blot鑒定

2.5.2電鏡觀察 取適量樣品置于銅網(wǎng)上處理觀察，發(fā)現(xiàn)純化后的IBD-ND cVLPs具有囊膜和纖突結構(圖10)。

圖10 IBD-ND cVLPs的透射電鏡觀察

3 討論

自IBD流行肆虐以來，給養(yǎng)殖業(yè)造成了無可估量的經(jīng)濟損失，因其給雞群帶來的病理變化和致病特點，它有“禽腎病”、“雞艾滋病”這些別名[26]。近20年來，IBD防控態(tài)勢逐年升級，變異株和超強毒株出現(xiàn)頻率增加[27]，且具有多樣的血清亞型和抗原變異，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)禽業(yè)最棘手最嚴重的病毒性傳染病之一，引起了我國獸醫(yī)領域的廣泛重視。一旦感染IBDV，對禽類的免疫系統(tǒng)造成的是不可逆轉的損傷，進一步提高繼發(fā)感染NDV、大腸桿菌和支原體的可能性，致使病死率提高，造成嚴重的經(jīng)濟損失。NDV、IBD這2種傳染病預防都使用弱毒疫苗防控，存在接種窗口期，大大增加了患病的風險。我國預防和防制IBD主要使用弱毒疫苗B87株，與目前我國出現(xiàn)頻率越來越高的超強毒株和變異株同源性降低，而且存在著變異和散毒的風險。這與我國NDV防制出現(xiàn)的問題相仿，LaSota弱毒疫苗株與目前國內流行株NA-1株同源性僅82%左右。這些問題都限制著我國動物傳染病的防制進程，因此本研究中NDV的主要保護性抗原和基質蛋白來自國內流行株NA-1株，IBD的主要保護性抗原部分來自于當前流行的IBDV強毒株SH99株，這為我國這兩類禽病防控提供高度同源的疫苗選擇。綜合以上原因研制無核酸、綠色安全有效、無需等待免疫窗口期的二聯(lián)疫苗相當有必要。

IBDV的VP2蛋白作為病毒外衣殼的唯一成分，位于病毒粒子的最外層[28]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，在IBDV感染早期，VP2蛋白可以通過抑制AKT-MTOR通路的活性，誘導自噬的發(fā)生，進而抑制IBDV的復制[29]。VP2蛋白具有的20個獨立的VP2亞單位，可以作為中和抗體結合的靶標，同時，成熟的VP2蛋白能夠誘導產(chǎn)生保護宿主的保護性抗原[30]。綜合以上原因，針對VP2蛋白的疫苗廣泛應用于預防IBD。因此本試驗利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構建了含有IBDV候選抗原表位的VP2蛋白，與NDV-HN、NDV-F、NDV-M組裝成cVLPs，形成含有IBDV候選抗原表位的IBD-ND二聯(lián)病毒樣顆粒。

病毒樣顆粒(VLPs)被認為是疫苗開發(fā)的有用工具，因為它們能誘導免疫反應并且是安全的。VLPs保留了免疫原性蛋白的天然抗原構象和原始病毒顆粒的重復結構，可以被抗原呈遞細胞(APC)，尤其是樹突狀細胞(DC)有效識別，然后被MHCⅡ類分子加工和呈遞以刺激CD4+T輔助細胞[31]，也能在經(jīng)過DC處理后通過交叉呈遞機制由MHCⅠ類分子呈遞給細胞毒性CD8+T細胞，有效激活體液免疫、黏膜免疫、細胞免疫。VLPs技術的靈活性允許VLPs成為在結構內或顆粒表面摻入和顯示異源抗原或特定表位的平臺[32-33]。NDV VLPs因其極高的釋放率是極好的載體選擇。因此，嵌合IBD-ND VLPs是一個很有前景的疫苗平臺。此外，某些VLPs還被用作潛在的藥物載體和生物醫(yī)學成像劑。它們缺乏病毒遺傳物質，由具有固有自組裝能力的結構蛋白形成，可作為比全病毒疫苗更安全的展示外來抗原的疫苗平臺[34]。除GPI錨定策略外，NDV VLPs的F蛋白和HN蛋白跨膜蛋白的特點允許通過胞外域替換的方式構建嵌合VLPs，因此本研究將IBDV強毒株保護性蛋白VP2替換NDV HN蛋白胞外域部分，與NDV-HN、NDV-F、NDV-M組裝成cVLPs，利用Western blot和透射電鏡鑒定cVLPs各組分組裝正確，充實了NDV VLPs作為載體平臺的使用方向，為ND和IBD的防制提供了疫苗儲備。