含硫正離子聚類肽水凝膠的合成與性能

顏舒婷，姚遠，陶鑫峰，林紹梁

（華東理工大學材料科學與工程學院,上海市先進聚合物材料重點實驗室,上海 200237）

水凝膠具有水含量高、生物相容性好、比表面積大和結構可控等優(yōu)點，且具有與細胞外基質相似的彈性，在藥物輸送、組織工程、傷口敷料、人造皮膚等生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景［1～9］.其中抗菌水凝膠由于具有保護傷口、減少感染和加速傷口愈合的作用，逐漸成為研究的熱點.通常，水凝膠的抗菌能力來自于負載的各種納米粒子［10～15］（Ag納米粒子［11～13］和Au納米粒子［14，15］等）、抗菌劑（環(huán)丙沙星［16］、強力霉素［17］等）和生物提取物［18］等，這些釋放類抗菌材料有一定的局限性，包括導致細菌耐藥性、重金屬對人體的毒副作用、價格高等.因此開發(fā)不會導致細菌耐藥性的本征抗菌水凝膠具有重要意義.陽離子型水凝膠可以通過靜電作用吸附在微生物的細胞膜表面，使細胞膜穿孔并裂解起到殺菌作用，因為其無需與細胞膜上的特定靶點結合就能起到抗菌作用，所以不會引起細菌的耐藥性［19，20］.

帶正電的硫正離子化合物廣泛存在于天然的動植物中［21］，具有顯著的抗菌作用，而且烷基化的硫正離子相對于銨或鏻類物質而言，具有更好的生物相容性［22］，更適合用于制備具有固有抗菌能力的水凝膠.與小分子相比，含硫正離子的聚合物［23］通常表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和可加工性.但目前關于含硫正離子的聚合物報道較少，且主要集中在聚氨基酸材料上，利用聚合物側鏈中的硫醚基團與環(huán)氧化合物反應即可生成硫正離子［24，25］.

聚類肽是一種新興的聚氨基酸材料，與聚肽具有相似的結構，但其側鏈在氮原子上，而不是在α-碳上，通過改變氮原子上的取代基可以得到各種功能化的聚類肽［26～29］.聚類肽因具有優(yōu)良的溶解性［30］、可加工性［31］、酶穩(wěn)定性［27，32］、可氧化降解性［33］、生物相容性［34］和無免疫原性而受到越來越多的關注［30，35］.其中，聚肌氨酸（PSar）具有優(yōu)異的水溶性、生物相容性、蛋白酶穩(wěn)定性以及非免疫原性［36］，被看作是聚乙二醇的替代物［30，32，37］，是制備水凝膠的理想材料.通過調(diào)節(jié)聚類肽氮原子上的取代基［30，35，38］，并選用合適的交聯(lián)方式，如具有高選擇性、高效率、反應條件溫和的點擊化學反應，有望得到具有可控力學性能、降解速率、凝膠形態(tài)、優(yōu)異生物相容性且無免疫原性的聚類肽水凝膠.

本文結合了硫正離子基團和聚類肽的優(yōu)點，通過伯胺引發(fā)的肌氨酸-N-硫代羧酸酐（Sar-NTA）和N-烯丙基甘氨酸-N-硫代羧酸酐（NGA-NTA）的可控開環(huán)聚合制備了三嵌段聚類肽，即聚（N-烯丙基甘氨酸）-b-聚肌氨酸-b-聚（N-烯丙基甘氨酸）（PNAG-b-PSar-b-PNAG，PASA），再通過巰-烯“點擊”反應制備了聚類肽水凝膠（HG），然后與環(huán)氧化合物反應，將聚合物網(wǎng)絡中的硫醚基團轉變?yōu)榱蛘x子，制備了一種具有本征抗菌能力的含硫正離子聚類肽水凝膠（S+HG）（Scheme 1）.研究了不同Sar摩爾分數(shù)的S+HG的吸水能力、微觀形貌、力學性能以及廣譜抗菌性能.S+HG對革蘭氏陰性的大腸桿菌（E.coli）和革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌（S.aureus）均表現(xiàn)出較高的抗菌活性.

Scheme 1 Schematic diagram of polypeptoid hydrogel(HG)and sulfonium-containing polypeptoid hydrogel(S+HG)

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

烯丙基胺（60%水溶液）、2-羥基-4′-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮（I2959，純度98%）、乙醛酸水合物（純度98%）和超干乙腈（純度99.9%），安耐吉化學技術（上海）有限公司；肌氨酸（Sar，純度98%），上海阿達瑪斯試劑有限公司；三溴化磷（純度99%）、氫氧化鈉（純度99%）、聚乙二醇二環(huán)氧乙烷甲基醚（純度99%），上海麥克林生化科技有限公司；2，2-二甲基-1，3-丙二胺（純度98%）、3，6-二氧雜-1，8-辛烷二硫醇（純度97%），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；濃鹽酸（質量分數(shù)37%）、三氯甲烷、無水乙醚均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；碳酸氫鈉（純度99.5%）、無水硫酸鎂（純度98%）、乙酸（純度99%）、石油醚（精餾級）、乙酸乙酯（精餾級）、無水乙醇（純度99.7%）和磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4），上海泰坦科技股份有限公司；參照文獻［39，40］方法合成S-乙氧基硫代羰基巰基乙酸（XAA）和N-取代甘氨酸-N-硫代羧酸酐（NNTA）.

AVANCEⅢ400型核磁共振波譜儀（1H NMR），瑞士Bruker公司；PL-50型凝膠滲透色譜儀（GPC），日本Agilent公司；Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Thermo Scientific公司；S-3800型掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司；RL-MARS3型平板流變儀，美國Thermo Hakke公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 NAG-NTA的合成圖S1（見本文支持信息）給出NAG-NTA的合成路線.在燒瓶中加入92.05 g（1.0 mol）一水合乙醛酸、78.00 g（0.5 mol）烯丙基胺水溶液和300 mL水，室溫下攪拌反應24 h.加入240 mL（2.8 mol）濃鹽酸，油浴加熱至120℃，回流12 h.旋轉蒸發(fā)除去溶劑，粗產(chǎn)物在甲醇/丙酮溶劑體系中重結晶，干燥后得到37.21 g白色晶體，即為產(chǎn)物N-烯丙基甘氨酸鹽酸鹽（NAG·HCl），產(chǎn)率50.0%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：3.57（d，2H），3.79（s，2H），5.43（dd，2H），5.93（m，1H），9.55（s，2H）.

將30.00 g（0.75 mol）NaOH用300 mL水溶解，冷卻至室溫.將37.20 g（0.25 mol）NAG·HCl和45.06 g（0.25 mol）XAA溶解在NaOH溶液中，45℃下攪拌反應3 d后，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH=1.然后用三氯甲烷萃取，加入無水MgSO4干燥1 h，過濾、旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到白色固體N-乙氧基硫代羰基-N-烯丙基甘氨酸.抽真空通N2氣3次，在N2氣氛圍下加入無水CH3Cl溶解上述白色固體.在冰水浴保護下緩慢滴加28 mL（0.30 mol）PBr3，反應10 min后撤去冰水浴，繼續(xù)反應1 h.分別用飽和NaHCO3溶液和去離子水洗滌反應溶液，再用無水MgSO4干燥，過濾、旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到粗產(chǎn)物.用柱色譜提純粗產(chǎn)物，展開劑為石油醚-乙酸乙酯（體積比為8∶1）.最終得到純凈的黃色油狀產(chǎn)物12.10 g，即NAG-NTA，產(chǎn)率30.8%.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：4.14（d，2H），4.16（s，2H），5.31（dd，2H），5.80（m，1H）.

1.2.2 Sar-NTA的合成圖S1給出Sar-NTA的合成路線.以肌氨酸為原料，粗產(chǎn)物用柱色譜分離提純，展開劑為石油醚-乙酸乙酯（體積比為4∶1），得到淺黃色油狀產(chǎn)物，產(chǎn)率22.9%.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：3.11（s，3H），4.21（s，2H）.

1.2.3 三嵌段聚類肽PASA的合成聚合操作均在預先除水、N2氣保護的聚合瓶中使用Schlenk技術進行.以PASA-Sar49%的合成為例，［Sar］0/［NAG］0/［I］0=60/60/1（［Sar］0，［NAG］0和［I］0分別表示Sar-NTA、NAG-NTA和引發(fā)劑的起始摩爾濃度）：向聚合瓶中依次加入0.35 g（2.67 mmol）Sar-NTA和7 mL超干乙腈后，通過注射器加入0.30 mL配制好的0.15 mol/L 2，2-二甲基-1，3-丙二胺的乙腈溶液，在60℃下密閉反應24 h.用注射器加入0.83 mL（3.12 mol/L）的NAG-NTA的乙腈溶液，繼續(xù)反應36 h.將反應液緩慢滴入劇烈攪拌的冰無水乙醚中，然后離心得到白色沉淀，用無水乙醚洗滌白色固體3次，最后真空干燥，得到0.40 g白色固體，即為PASA-Sar49%.

將NAG-NTA乙腈溶液的加入量調(diào)整為0.58 mL（3.12 mol/L），采用相同的方法合成PASA-Sar64%.

1.2.4 S+HG的制備將0.1 g PASA-Sar49%溶解在1 mL乙醇中，加入7 mg（0.03 mmol）光引發(fā)劑I2959和55 mg（0.3 mmol）3，6-二氧雜-1，8-辛烷二硫醇（［C=C］∶［SH］∶［I2959］＝1∶1∶0.05）.用波長365 nm的紫外燈（1.125 W/cm2）照射15 min后，用水透析3次，然后冷凍干燥，得到白色干凝膠.將0.1 g干凝膠和0.47 g（3.0 mmol）聚乙二醇二環(huán)氧乙烷甲基醚加入到5 mL醋酸中，在37℃下反應3 d，反應后凝膠用超純水透析，得到S+HG.

1.2.5 水凝膠的溶脹動力學將一定質量（m0，g）的S+HG浸入5 mL PBS緩沖鹽溶液中，在特定的時間段（0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 min）將水凝膠取出，用干燥的濾紙吸掉表面多余的水分后稱重（m1，g）.重復實驗3次，按下式計算溶脹率（Swelling ratio，%）：

1.2.6 水凝膠的流變性能用平板流變儀測量S+HG的流變性能.流變儀裝有直徑為25 mm的平行板，實驗條件為37℃.測試過程中首先對水凝膠進行動態(tài)應變掃描，頻率為1.0 Hz，振幅在0.1%～500%之間.然后進行動態(tài)頻率掃描，振幅為5%，頻率在0.1～100 rad/s.

1.2.7 水凝膠的抗菌性能采用振蕩法測試水凝膠的抗菌性能，具體過程如下：（1）將0.1 g凍干的S+HG樣品剪碎；（2）將槍頭、試管、玻璃棒等實驗用品高溫滅菌；（3）取1 mL 1×108cfu/mL的菌液加入裝有9 mL PBS緩沖液的試管中，渦旋振蕩，按梯度稀釋至1×105cfu/mL，加入剪碎的S+HG樣品，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩24 h，轉速250 r/min；（4）振蕩結束后，用PBS緩沖溶液將菌液稀釋到1×104cfu/mL，并取0.1 mL接種在瓊脂培養(yǎng)皿上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)，取3次實驗的平均值.

2 結果與討論

2.1 三嵌段聚類肽PASA的合成

參照本課題組已報道的方法合成并表征了Sar-NTA和NAG-NTA［41，42］（圖S1～圖S3，見本文支持信息）.Sar-NTA聚合生成PSar，其具有良好的水溶性，可作為水凝膠中的親水鏈段.NAG-NTA聚合后生成聚（N-烯丙基甘氨酸）（PNAG），其側鏈含有雙鍵，可以作為水凝膠中的交聯(lián)位點.為了制備基于PSar的水凝膠，可以將PSar作為中間嵌段，兩端再接上可以進行交聯(lián)的PNAG鏈段，得到三嵌段聚合物PASA.伯胺引發(fā)的N-取代甘氨酸-N-硫代羧酸酐（NNTA）開環(huán)聚合具有活性特征，通過順序投料的方式可以制備嵌段聚類肽［33］.因此，可以利用2，2-二甲基-1，3-丙二胺引發(fā)Sar-NTA在乙腈中于60℃下聚合得到親水的PSar，24 h后取少量反應溶液用于1H NMR分析，以保證Sar-NTA已經(jīng)消耗完畢，然后再加入NAG-NTA繼續(xù)聚合36 h，最終得到三嵌段聚合物PASA（Scheme 2）.由于伯胺引發(fā)的NNTA聚合具有良好的可控性，通過調(diào)節(jié)投料比［Sar］0/［NAG］0/［I］0，制備得到兩種不同嵌段比例的PASA，聚合數(shù)據(jù)總結于表1.

Scheme 2 Synthetic pathway of PASA

Table 1 Synthesis and characterization of PASA with different Sar molar fractionsa

在PASA的1H NMR譜圖中可清楚地觀察到Sar與N-烯丙基甘氨酸（NAG）重復單元的特征信號（圖1）.其中，引發(fā)劑的甲基質子信號（Ha）位于0.76，Sar單元的甲基質子信號（Hd）位于2.62～3.07，NAG單元的雙鍵質子特征信號Hh和Hg分別位于4.95～5.38和5.54～5.94，而聚類肽主鏈和側鏈的亞甲基質子信號（Hc+e+f）位于3.65～4.60.根據(jù)引發(fā)劑與重復單元特征信號的積分比例，得到各嵌段的聚合度（DP）、聚合物的分子量（MnNMR）以及Sar單元的摩爾分數(shù)（Sar molar fraction，%）通過下式計算：

式中：I（Ha）代表引發(fā)劑甲基峰的面積，I（Hd）和I（Hg）分別代表Sar單元的甲基峰面積和NAG單元的雙鍵峰面積.根據(jù)公式計算，2種三嵌段聚合物的組成分別為PA27S53A27和PA18S59A18，對應的Sar摩爾分數(shù)分別為49%和64%.為了更直觀地反映聚合物的組成，本文將這兩種聚合物分別命名為PASA-Sar49%和PASA-Sar64%.GPC曲線表明，兩種嵌段聚合物都具有中等的分子量分布（1.29～1.37），并且分子量的變化趨勢與核磁計算所得的分子量一致（圖2）.上述結果表明，成功制備了不同Sar摩爾分數(shù)的三嵌段聚合物PASA.

Fig.1 1H NMR spectrum of PASA-Sar64% in DMSO-d6

Fig.2 GPC traces of PASA-Sar49%(a)and PASA-Sar64%(b)

2.2 含硫正離子聚類肽水凝膠的制備

Fig.3 Images of the solution of PASA,3,6-dioxa-1,8-octanedithiol and photoinitiator I2959 before and after UV irradiation(A)and S+HG with different molar fraction of Sar(B)

PASA聚合物上的烯丙基和雙硫醇化合物通過巰-烯“點擊”反應使PASA分子鏈交聯(lián)形成網(wǎng)絡結構，然后再將所得聚類肽水凝膠（HG）浸泡于聚乙二醇二環(huán)氧乙烷甲基醚的乙酸溶液，得到一種含硫正離子聚類肽水凝膠（S+HG）（Scheme 1）.將PASA三嵌段聚合物和3，6-二氧雜-1，8-辛烷二硫醇按照雙鍵和巰基等摩爾比混合均勻，以I2959為光引發(fā)劑，用365 nm紫外燈的照射15 min［圖3（A）］，通過倒置法可以證明凝膠的形成.PASA-Sar46%和PASA-Sar64%形成的聚類肽水凝膠分別標記為HG-Sar49%和HG-Sar64%.巰-烯點擊反應后生成大量的硫醚基團，可以進一步與聚乙二醇二環(huán)氧乙烷甲基醚在乙酸中反應生成硫正離子，然后經(jīng)過透析除去未反應的物質制備得到如圖3（B）所示的S+HG，PASA-Sar46%和PASA-Sar64%形成的含硫正離子聚類肽水凝膠分別標記為S+HG-Sar49%和S+HG-Sar64%.圖4給出與聚乙二醇二環(huán)氧乙烷甲基醚反應前后水凝膠的FTIR譜圖.由圖4可見，與HG-Sar49%相比，與聚乙二醇二環(huán)氧乙烷甲基醚反應后的S+HG-Sar49%在1303 cm-1處的—OH面內(nèi)彎曲振動峰及1110 cm-1處醇的C—O伸縮振動峰有所增強，1245 cm-1處脂肪族C—O—C的非對稱伸縮振動和835 cm-1處環(huán)氧結構的C—O—C的非對稱伸縮振動也有所增強，表明硫醚基團與環(huán)氧化合物發(fā)生了反應，環(huán)氧開環(huán)后與硫原子相連形成硫正離子，同時出現(xiàn)了相應的羥基（Scheme 1）.上述結果表明，本文成功制備了骨架含有硫正離子的水凝膠.

Fig.4 FTIR spectra of HG-Sar49%(a)and S+HG-Sar49%(b)hydrogels

2.3 含硫正離子聚類肽水凝膠的溶脹能力

將S+HG-Sar49%和S+HG-Sar64%冷凍干燥后，采用稱重法測試不同時間段水凝膠在37℃PBS（pH＝7.4）溶液中的溶脹率.由圖5可以看出，不同Sar摩爾分數(shù)的S+HG干凝膠均在1 min內(nèi)就可以達到溶脹平衡，表明S+HG擁有較好的快速溶脹性能.

Fig.5 Swelling kinetics of S+HG-Sar49%(a)and S+HG-Sar64%(b)

Fig.6 Saturated swelling ratio of S+HG-Sar49% and S+HG-Sar64%(immersed in PBS solution for 24 h)

溶脹率也可以用來模擬S+HG吸收傷口滲出液的能力.由圖6可見，得益于水凝膠化學結構上的親水性，這兩種S+HG均具有優(yōu)異的吸水性，當Sar摩爾分數(shù)從49%增加到64%時，S+HG的飽和溶脹率從1596%增加到2024%.由于PSar鏈段的親水性比PNAG強，通過增加PASA的Sar摩爾分數(shù)，可以制備出溶脹率更高的S+HG水凝膠.

2.4 含硫正離子聚類肽水凝膠的力學性能

S+HG需要具有一定的力學強度和穩(wěn)定性才能滿足實際應用.本文采用流變儀研究了S+HG的力學性能，測試了Sar摩爾分數(shù)對水凝膠力學強度的影響（圖7）.含硫正離子聚類肽水凝膠S+HG-Sar49%和S+HG-Sar64%在剪切力作用下表現(xiàn)出不同的彈性模量（G′）和損耗模量（G″）.由圖7（A）可見，在動態(tài)應變掃描模式下，2種水凝膠的G′和G″在一定范圍內(nèi)保持不變，且G′均大于其G″，表明其以彈性體形式存在.由圖7(B)可見，在動態(tài)頻率掃描模式下，水凝膠的G′基本保持不變，并且G′比G″大一個數(shù)量級左右，說明水凝膠具有穩(wěn)定的共價交聯(lián)網(wǎng)絡，結構上具有良好的穩(wěn)定性，在受到外界一定的剪切、擠壓以及摩擦作用時，水凝膠能夠避免發(fā)生不可逆的破壞.S+HG-Sar49%和S+HG-Sar64%的G′分別為1056 Pa和756 Pa.G′隨著Sar摩爾分數(shù)的減小而增大，這主要是因為參與巰-烯“點擊”的雙鍵摩爾分數(shù)變大，交聯(lián)點密度變大，使網(wǎng)絡結構更加穩(wěn)定，所以力學強度更高.這表明可以通過調(diào)節(jié)聚合投料比改變水凝膠的組成，進而調(diào)節(jié)水凝膠的力學性能，以滿足實際應用需求.

Fig.7 Mechanical properties of S+HG in dynamic amplitude sweep mode(A)and dynamic frequency sweep mode(B)a.G′，S+HG-Sar49%；a′.G″，S+HG-S49%；b.G′，S+HG-S64%；b′.G″，S+HG-S64%.

2.5 含硫正離子聚類肽水凝膠的形貌分析

將S+HG充分溶脹后，用液氮脆斷然后冷凍干燥，用SEM觀察其內(nèi)部形貌.由圖8可見，2種不同Sar摩爾分數(shù)的S+HG內(nèi)部均為規(guī)則的連續(xù)海綿孔狀網(wǎng)絡結構，這表明水凝膠的形成是一個均相反應過程.S+HG-Sar49%水凝膠的孔徑小于S+HG-Sar64%凝膠，說明Sar摩爾分數(shù)小的S+HG的網(wǎng)絡更緊密，這與流變測試的結果相符合.S+HG的SEM結果表明可通過改變PASA聚合物的Sar摩爾分數(shù)調(diào)節(jié)水凝膠內(nèi)部孔洞的尺寸，從而調(diào)節(jié)其吸水速度、溶脹率及力學性能等.合適大小的孔洞可以為細胞提供進行氧氣和營養(yǎng)物質交換的空間，促進細胞的增殖及生長，有利于水凝膠在醫(yī)用材料領域的應用［43，44］.

Fig.8 SEM images of S+HG-Sar49%(A,B)and S+HG-Sar64%(C,D)

2.6 含硫正離子聚類肽水凝膠的抗菌性能

選用E.coli和S.aureus分別作為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原體模型，采用振蕩法評估了含硫正離子型聚類肽水凝膠的廣譜抗菌性能，結果見圖9（A）～（F）.可見，PASA水凝膠沒有抗菌能力，而S+HG對S.aureus和E.coli均有抗菌作用，當菌液濃度為1×105cfu/mL時，S+HG水凝膠對E.coli和S.aureus的抗菌率都在99.99%以上［圖9（G）］，表現(xiàn)出優(yōu)異的廣譜抗菌效果.硫正離子的抗菌機理為破壞細菌的細胞膜，S+HG通過靜電相互作用黏附在帶負電的細菌細胞膜表面，同時水凝膠中的疏水基團插入細菌細胞膜使其破裂，使得細胞內(nèi)容物泄露，最終導致細菌死亡［23，24］.因為其不像抗生素一樣需要通過和細菌膜上的特定靶點結合才能起到抗菌作用，所以不會引起細菌的耐藥性.而且烷基化的硫正離子與銨或鏻類物質相比具有更好的生物相容性，更適合用于制備具有固有抗菌能力的水凝膠［21，22］.

Fig.9 Photographs of bacterial colonies after exposing to HG-Sar49%(A,D),S+HG-Sar49%(B,E)and S+HGSar64%(C,F)against S.aureus(A—C)and E.coli(D—F)and antimicrobial rates of S+HG(G)

3 結論

以伯胺為引發(fā)劑，依次引發(fā)Sar-NTA和NAG-TA開環(huán)聚合，制備了不同Sar摩爾分數(shù)的三嵌段聚類肽PASA，再利用側鏈雙鍵和雙巰基化合物的巰-烯“點擊”反應以及硫醚-環(huán)氧反應，制備了一種具有抗菌性能的S+HG.S+HG有著優(yōu)異的吸水能力，能夠在1 min內(nèi)達到吸水平衡，飽和溶脹率高達2024%.S+HG內(nèi)部由大量規(guī)則的連續(xù)海綿孔狀結構組成，流變測試顯示水凝膠的G′比G″大1個數(shù)量級左右，G′在一定外力下的能保持不變，水凝膠能夠承受一定的剪切、摩擦及擠壓等外界應力.Sar摩爾分數(shù)高的水凝膠溶脹速度更快、溶脹率更高，但力學強度有所降低，微觀孔結構也更大.S+HG上的硫正離子賦予了其固有的優(yōu)異廣譜抗菌能力，對E.coli和S.aureus的抗菌率都在99.99%以上.通過控制單體的投料比即可方便地調(diào)節(jié)水凝膠的宏觀性能，結合S+HG優(yōu)異的固有抗菌性能，使其在生物醫(yī)用領域有著廣闊的應用前景.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220381.