健脾益氣方對(duì)腹膜透析大鼠腹膜間皮細(xì)胞自噬及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響※

劉前程,劉 鑫,楊端云,史 偉,,鄧湘雨,孟立鋒,

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530023;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)具有良好的早期生存率和保護(hù)殘余腎功能的作用,是維持終末期腎臟病患者生存的重要治療方法之一,應(yīng)用前景較好[1]。腹膜纖維化(PF)是導(dǎo)致PD患者超濾衰竭、退出PD治療的首要原因[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),腹膜間皮細(xì)胞(PMC)受損是導(dǎo)致PF的主要原因之一,PMC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在PF中發(fā)揮著重要作用[4-5]。因此,開(kāi)發(fā)相關(guān)技術(shù)或藥物干預(yù)EMT進(jìn)程,保護(hù)PMC正常形態(tài)與功能,維持PD有效超濾,對(duì)延長(zhǎng)PD時(shí)間、改善PD患者預(yù)后具有重要意義。

自噬即“自我吞噬”,是維持真核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),實(shí)現(xiàn)生命更新的一種重要進(jìn)化和保守機(jī)制,可使細(xì)胞在遭遇各種具有應(yīng)激性的死亡威脅時(shí),仍然能夠保持存活,但過(guò)度的自噬也可導(dǎo)致細(xì)胞受損。相關(guān)研究表明,PD參與EMT的發(fā)生,可誘導(dǎo)PMC自噬[6]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),健脾益氣方能夠有效干預(yù)PMC的EMT進(jìn)程,有效防治PD微炎癥狀態(tài)誘導(dǎo)的PMC損傷[7]。本研究通過(guò)建立PD大鼠模型,檢測(cè)自噬及EMT標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1表達(dá)水平,觀察健脾益氣方對(duì)PD大鼠腹膜形態(tài)、PMC自噬及EMT的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體動(dòng)物(SPF)級(jí)雄性SD大鼠[湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(桂)2019-0001]70只,體質(zhì)量150～180 g,動(dòng)物使用符合廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)管理?xiàng)l例(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào):DW20210426-080),飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 4.25%乳酸鹽腹膜透析液(廣州百特醫(yī)療用品有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20133257,1.5 L/袋);E-cadherin、α-SMA、LC3-Ⅱ、Beclin-1測(cè)定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 健脾益氣方顆粒(藥物組成:黃芪30 g,黨參15 g,白術(shù)10 g,茯苓15 g,丹參15 g,大腹皮6 g,川芎7 g,葛根15 g,炙甘草8 g)由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn),廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408,20 mg/片)研磨成粉,以蒸餾水配成1 mg/m L的溶液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組方法 將70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、西藥組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組,每組14只。

2.2 模型制備 假手術(shù)組不切除腎臟,只剝離腎臟包膜,其余各組行5/6腎切除,檢測(cè)腎功能達(dá)標(biāo)后,采取腹腔注射4.25%腹膜透析液透析建立PD大鼠模型,100 m L/kg,每日1次,連續(xù)造模4周。

2.3 給藥方式 依據(jù)人與動(dòng)物體表面積折算,健脾益氣方低、高劑量組給藥量分別為9 g/(kg·d)、36 g/(kg·d);西藥組給藥量為1.8 mg/(kg·d)。假手術(shù)組、模型組采用0.9%氯化鈉注射液灌胃,每次2 m L,每日1次。連續(xù)干預(yù)4周。

2.4 實(shí)驗(yàn)取材及標(biāo)本采集 第28日灌胃后斷頭處死大鼠,取壁腹膜組織。修剪成約5 mm×5 mm大小。一半浸入PLP固定液中,4℃冰箱固定8 h,常規(guī)石蠟包埋,另一半置-70℃冰箱保存待測(cè)。

2.5 檢測(cè)指標(biāo) ①一般情況。包括大鼠精神狀況、飲食、活動(dòng)及體質(zhì)量等。②腹膜組織蘇木精-伊紅(HE)染色及電鏡觀察PMC超微結(jié)構(gòu)。取大鼠腹膜組織,常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片后,行 HE、鈾-鉛雙染色,光鏡下觀察大鼠腹膜形態(tài)學(xué)變化,測(cè)量壁腹膜厚度,電鏡下觀察PMC自噬體形成情況。③免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腹膜 LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)。石蠟切片脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù),分別滴加LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin(1∶200),37℃孵育1 h,采用 DAB顯色。蘇木素染核后脫水透明、封片,應(yīng)用Leica Qwin550圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析,400倍視野下測(cè)定陽(yáng)性面積比。④蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)腹膜LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)。采用400μL裂解液提取腹膜組織總蛋白,采用BCA法測(cè)量蛋白濃度后,進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳,轉(zhuǎn)膜。用脫脂奶粉封閉后,分別加入抗體LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin,孵育過(guò)夜。TBST洗滌后,室溫下孵育二抗30 min,采用ECL發(fā)光液顯色。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較 實(shí)驗(yàn)期間,先后有16只實(shí)驗(yàn)大鼠死亡,死亡原因包括術(shù)后感染、灌胃不當(dāng)?shù)取Ｗ罱K大鼠數(shù)量為:假手術(shù)組12只,模型組10只,西藥組12只,中藥低劑量組11只,中藥高劑量組9只。實(shí)驗(yàn)期間,各組大鼠表現(xiàn)明顯不同,造模前,各組大鼠飲食、運(yùn)動(dòng)可,動(dòng)作迅速;造模后,除假手術(shù)組外,其余各組均出現(xiàn)喜好蜷臥、反應(yīng)遲鈍等癥狀,且體質(zhì)量逐漸下降。

3.2 光鏡下各組大鼠腹膜病理表現(xiàn)比較 假手術(shù)組大鼠腹膜組織連續(xù)和完整,PMC覆蓋完好,厚度均勻。模型組腹膜變厚明顯,部分呈柱形,PMC可見(jiàn)明顯脫落及膠原纖維沉積等病理變化。中藥干預(yù)后,腹膜組織厚度、膠原纖維沉積及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠光鏡下腹膜組織病理圖(×400倍)

3.3 腹膜致密層厚度及 LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白陽(yáng)性面積比比較 與假手術(shù)組相比較,模型組腹膜致密層厚度及Beclin-1、α-SMA、LC3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性面積比均升高(P＜0.05),E-cadherin蛋白陽(yáng)性面積比均降低(P＜0.05)。與模型組相比,西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組腹膜致密層厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白陽(yáng)性面積比均降低(P＜0.05),E-cadherin蛋白陽(yáng)性面積比均升高(P＜0.05)。與模型組、西藥組、中藥低劑量組比較,中藥高劑量組腹膜致密層厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA 蛋白陽(yáng)性面積比均降低(P＜0.05),E-cadherin蛋白陽(yáng)性面積比均升高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腹膜厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin陽(yáng)性面積比比較(±s)

表1 各組大鼠腹膜厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin陽(yáng)性面積比比較(±s)

注:1.LC3-Ⅱ,微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ;α-SMA,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;E-cadherin,上皮鈣黏素。2.與假手術(shù)組比較,▲P＜0.05,與模型組比較,*P＜0.05;與中藥高劑量組比較,＃P＜0.05。

組別 只數(shù)腹膜致密層厚度(μm) LC3-Ⅱ(%) Beclin-1(%)假手術(shù)組 12 5.83±2.65* 3.61±0.72* 3.87±0.65*模型組 10 58.71±6.53＃▲ 23.32±2.72?！?19.84±3.31?！魉幗M 12 31.34±3.28*?！?13.46±2.61*＃▲ 14.85±2.93*?！兴幍蛣┝拷M 11 40.88±5.72*＃▲ 14.84±3.56*?！?15.73±2.49*?！兴幐邉┝拷M 9 19.58±4.45*▲ 8.63±2.32*▲ 7.92±1.92*▲組別 只數(shù) α-SMA(%) E-cadherin(%)假手術(shù)組 12 4.62±0.87* 8.73±0.92*模型組 10 22.30±2.15?！?1.23±0.52?！魉幗M 12 14.92±1.22*＃▲ 2.26±0.46*?！兴幍蛣┝拷M 11 16.10±2.12*?！?2.83±0.87*＃▲中藥高劑量組 9 9.23±1.76*▲ 4.72±0.45*▲

3.4 腹膜LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平均升高,E-cadherin蛋白表達(dá)水平均降低。與模型組、西藥組、中藥低劑量組比較,中藥高劑量組LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白表達(dá)水平均降低,E-cadherin水平均升高。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腹膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白電泳圖

3.5 電鏡下各組大鼠PMC自噬體比較 與假手術(shù)組比較,模型組PMC中自噬體數(shù)量顯著增加,自噬水平明顯上調(diào)。與西藥組、模型組、中藥低劑量組比較,中藥高劑量組PMC中自噬體數(shù)量顯著減少,自噬水平明顯下調(diào)。見(jiàn)圖3。

圖3 電鏡下各組大鼠腹膜間皮細(xì)胞自噬體形成情況

4 討論

EMT是PD相關(guān)性纖維化初始階段的主要病理變化,主要特征是正常PMC結(jié)構(gòu)改變,轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞[8]。PMC是構(gòu)成腹膜的主要細(xì)胞,相關(guān)研究表明,PMC損傷在EMT過(guò)程中起重要作用[9]。當(dāng)腹腔穩(wěn)態(tài)失衡發(fā)生PMC損傷時(shí),PMC可以發(fā)生EMT,變成肌纖維母細(xì)胞,成為腹膜組織中成纖維細(xì)胞的來(lái)源。自噬是一種真核細(xì)胞程序性死亡形式,廣泛參與真核生物的生命過(guò)程。相關(guān)研究表明,自噬與EMT存在密切關(guān)系,但結(jié)論存在爭(zhēng)議[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),健脾益氣方能干預(yù)PD大鼠微炎癥狀態(tài),保護(hù)大鼠PMC結(jié)構(gòu)和功能,延緩PF進(jìn)程[11],但健脾益氣方是否能通過(guò)調(diào)控PMC自噬,進(jìn)而干預(yù)PMC的EMT進(jìn)程,目前尚不明確。

《素問(wèn)·熱論》中提出“脾主大腹”理論,指出腹膜的結(jié)構(gòu)和功能與脾密切相關(guān)。殷玲等[12]及朱淑瑜等[13]研究結(jié)果均顯示,PD初期以脾腎氣虛證為主?；诖?筆者認(rèn)為“脾氣虧虛”是PD相關(guān)性腹膜早期病變的主要病機(jī)[14],故防治PD早期誘導(dǎo)的腹膜損傷應(yīng)從脾胃入手。健脾益氣方具有健脾益氣、理氣和絡(luò)的功效,方中黃芪、黨參益氣健脾為君,白術(shù)、茯苓健脾燥濕為臣,葛根、川芎、丹參升陽(yáng)理氣活血為佐,炙甘草調(diào)和諸藥,大腹皮引諸藥入腹絡(luò)為使[15]。有報(bào)道指出,LC3、Beclin-1等作為細(xì)胞自噬體形成的標(biāo)志,可以通過(guò)調(diào)節(jié)自噬強(qiáng)弱參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程[16-17]。本研究采用5/6腎切除聯(lián)合4.25%腹膜透析液建立尿毒癥PD大鼠模型,觀察健脾益氣方對(duì)大鼠PMC自噬及EMT的影響。結(jié)果顯示,模型組大鼠LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組,E-cadherin表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組,提示PD可誘導(dǎo)PMC的EMT,且PMC自噬可能參與PMC的EMT發(fā)生發(fā)展過(guò)程。健脾益氣方干預(yù)后,LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表達(dá)水平降低,E-cadherin表達(dá)水平升高,表明健脾益氣方可能通過(guò)影響PMC自噬干預(yù)EMT進(jìn)程,進(jìn)而保護(hù)腹膜功能。

綜上所述,自噬激活參與PD相關(guān)性PMC的EMT發(fā)生發(fā)展過(guò)程,健脾益氣方可以明顯下調(diào)PMC自噬水平,起到抑制PMC的EMT,保護(hù)PD大鼠腹膜的作用。本研究初步驗(yàn)證健脾益氣方可干預(yù)PD大鼠PMC病變進(jìn)程,但存在一定不足,如在PD模型制備方面,大鼠需要進(jìn)行二次手術(shù)及反復(fù)穿刺注射腹膜透析液,手術(shù)、穿刺損傷出血及實(shí)驗(yàn)人員操作等因素均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在中醫(yī)證型方面,本研究將PD大鼠辨為脾氣虧虛證,但模型構(gòu)建后其內(nèi)在病理和外在癥狀是否存在對(duì)應(yīng)關(guān)系尚未明確,今后的研究應(yīng)注重中醫(yī)證型與動(dòng)物模型的匹配問(wèn)題。此外,健脾益氣方調(diào)控PMC自噬及EMT的具體機(jī)制仍不明確,今后將針對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行深入探索。