重組人腦利鈉肽對慢性心衰大鼠免疫和FAK、Bax、Bcl-2、p53的影響及相關(guān)性分析

劉培君 康秀峰雷曉亭洪志斌（天水市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，天水 741000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由多種原因引起的心肌損傷，導(dǎo)致患者充盈功能低下，發(fā)病早期癥狀不明顯，臨床多表現(xiàn)為乏力、呼吸困難及體液潴留等。近年來，CHF的發(fā)生率呈上升趨勢，且五年存活率與惡性腫瘤相近，影響患者健康生活［1-2］。既往研究表明，CHF的發(fā)生、發(fā)展常伴有心肌細(xì)胞凋亡，呋塞米屬于臨床常用藥物，雖然能延緩病情發(fā)展，但遠(yuǎn)期預(yù)后較差，不良反應(yīng)發(fā)生率較高，導(dǎo)致臨床使用受限［3］。重組人腦利鈉肽屬于人體分泌的一種內(nèi)源性多肽，重組DNA技術(shù)利用大腸桿菌凍干制劑能與心室肌產(chǎn)生的內(nèi)源性腦利鈉肽具有相同的氨基酸序列［4-5］。同時，藥物能拮抗心肌細(xì)胞、心纖維原細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素，有助于提高腎小球?yàn)V過率，促進(jìn)鈉的排泄［6］。因此，本研究以SD大鼠為研究對象，探討重組人腦利鈉肽在慢性心衰大鼠中的作用機(jī)制及對黏著斑激酶（FAK）、Bcl-2相關(guān)C蛋白（Bax）、心肌組織凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）及抑癌基因p53（p53）的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康清潔級SD大鼠40只，雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量220～280 g，平均（250.00±20.00）g，隨機(jī)取10只設(shè)為空白對照組；剩余30只復(fù)制大鼠CHF動物模型，建模成功后隨機(jī)分為模型對照組、呋塞米組和重組人腦利鈉肽組，10只/組。動物合格證號：SCXX-2005-0001，所選動物均購于實(shí)驗(yàn)動物房，完成大鼠的常規(guī)喂養(yǎng)、光照。

1.1.2 主要試劑與儀器注射用苯巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司）；鹽酸多柔比星，規(guī)格：10 mg/支（山西普德藥業(yè)股份有限公司）；ELISA試劑盒（美國R&D Systems公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；凍干重組人腦利鈉肽，規(guī)格：0.5 mg×1瓶/盒（成都諾迪康生物制藥有限公司）；內(nèi)參抗體β-actin（美國Sigma公司）；大鼠飼養(yǎng)籠（西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；小動物超聲儀，型號Vevo770型（Visuslsonics公司）；臺式高速低溫離心機(jī)（德國Herolab公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模與分組

1.2.1.1 建模剩余30只大鼠采用鹽酸多柔比星隔日腹腔注射法復(fù)制大鼠CHF動物模型，具體方法如下：給藥劑量依次為第1、3天劑量為1 mg/kg、第5、7天劑量為2 mg/kg、第9、11天劑量為3 mg/kg、第13、15天劑量為4 mg/kg，連續(xù)完成8次給藥，累計(jì)劑量為20 mg/kg。上述操作完畢后對大鼠連續(xù)完成3周喂養(yǎng)，并完成其生命體征監(jiān)測。左心室質(zhì)量/體質(zhì)量為左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），右心室質(zhì)量/體質(zhì)量為右心室質(zhì)量指數(shù)（RVMI），左心室肌HE染色，并配合大鼠的行為、體征判斷造模標(biāo)準(zhǔn)［7-8］。

1.2.1.2 分組建模成功后隨機(jī)分為模型對照組、呋塞米組和重組人腦利鈉肽組，10只/組。處理方法：空白對照組與模型對照組給予等劑量生理鹽水；呋塞米組采用呋塞米溶液［10 mg/（kg·d）］灌胃干預(yù)，重組人腦利鈉肽組采用重組人腦利鈉肽溶液［15μg/（kg·d）］皮下注射4周。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 心功能水平采用超聲心動圖檢測大鼠心功能水平，包括左室舒張期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮期內(nèi)徑（LVIDs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）及短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS）水平的測定［9］。

1.2.2.2 免疫水平4組大鼠干預(yù)后4周以斷頸方式處死，取頸動脈血3 ml，流式細(xì)胞儀完成CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的水平測定［10-11］。

1.2.2.3 FAK、Bax、Bcl-2及p53水平4組大鼠處理4周后以斷頸方式處死，取心肌組織100 mg，向組織中加入1 ml裂解液完成組織裂解，12 000 r/min離心15 min。取上清，根據(jù)BCA法完成相關(guān)蛋白濃度測定；沸水浴變性，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶封閉，分別加入FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白一抗，孵育過夜后加入二抗，并以化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片曝光后顯影［12-13］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件處理，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能比較重組人腦利鈉肽組和呋塞米組心功能LVIDd、LVIDs水平低于模型對照組（P＜0.05）；EF及FS水平高于模型對照組（P＜0.05）；重組人腦利鈉肽組干預(yù)4周后LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米組（P＜0.05）；EF及FS水平高于呋塞米組（P＜0.05），見表1。

表1 4組心功能比較（±s）Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups（±s）

表1 4組心功能比較（±s）Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups（±s）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with model control group，2）P＜0.05；compared with furosemide group，3）P＜0.05.

Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 LVIDd/mm 9.59±1.781）2）3）10.73±2.111）2）11.21±2.151）8.48±0.62 LVIDs/mm 6.84±1.591）2）3）8.43±2.061）2）10.26±2.611）5.31±0.84 EF（%）54.39±4.741）2）3）43.34±3.791）2）22.49±2.131）64.59±5.62 FS（%）30.32±3.891）2）3）21.59±3.381）2）10.49±2.421）35.63±4.30

2.2 各組免疫水平比較重組人腦利鈉肽組和呋塞米組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于模型對照組（P＜0.05）；CD8+水平低于模型對照組（P＜0.05）；重組人腦利鈉肽組干預(yù)4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米組（P＜0.05）；CD8+水平低于呋塞米組（P＜0.05），見表2。

表2 4組免疫水平比較（±s，%）Tab.2 Comparison of immune levels among four groups（±s，%）

表2 4組免疫水平比較（±s，%）Tab.2 Comparison of immune levels among four groups（±s，%）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with model control group，2）P＜0.05；compared with furosemide group，3）P＜0.05.

Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 CD3+58.43±4.311）2）3）49.68±3.691）2）45.71±2.491）63.29±4.59 CD4+42.14±3.111）2）3）37.39±3.171）2）34.21±2.491）46.49±3.23 CD8+29.53±4.521）2）3）32.23±4.391）2）35.45±5.791）27.29±3.23 CD4+/CD8+1.43±0.231）2）3）1.16±0.161）2）0.97±0.111）1.70±0.27

圖2 各組FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白表達(dá)量Fig.2 Expressions of FAK，Bax，Bcl-2 and p53 protein in each groups

2.3 各組FAK、Bax、Bcl-2及p53水平比較BCA法測定結(jié)果表明，重組人腦利鈉肽組和呋塞米組FAK、Bax、p53水平低于模型組（P＜0.05）；Bcl-2水平高于模型組（P＜0.05）；重組人腦利鈉肽組FAK、Bax、p53水平低于呋塞米組（P＜0.05）；Bcl-2水平高于呋塞米組（P＜0.05），見圖1、2。

圖1 4組FAK、Bax、Bcl-2及p53相對表達(dá)量比較Fig.1 Comparison of relative expressions of FAK，Bax，Bcl-2 and p53 in four groups

3 討論

目前，臨床上對于CHF的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，而心肌細(xì)胞凋亡在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［14］。既往研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是引起心功能不全的重要原因，在整個疾病中發(fā)揮重要作用，且心力衰竭越嚴(yán)重，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)越多［15］。利鈉肽屬于心力衰竭患者體內(nèi)最為重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，而重組人腦利鈉肽的使用可作為人體應(yīng)激大量產(chǎn)生的補(bǔ)充代償機(jī)制［16］。本研究中，重組人腦利鈉肽組干預(yù)后4周LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米組；EF及FS水平高于呋塞米組，提示重組人腦利鈉肽的干預(yù)可改善大鼠心功能水平，利于大鼠恢復(fù)。重組人腦利鈉肽可通過降低動脈與靜脈壓力，增加心輸出量，抑制神經(jīng)激素激活水平，從而影響機(jī)體血流動力學(xué)。由于重組人腦利鈉肽對于機(jī)體的作用決定了其激動劑在臨床上的應(yīng)用及發(fā)作，其廣泛應(yīng)用于心力衰竭的治療［13］?，F(xiàn)代藥理結(jié)果表明，重組人腦利鈉肽是利用DNA技術(shù)合成的生物制劑，并以大腸桿菌為生成菌種，具有較高的純度，且與內(nèi)源性BNP具有相同的生物活性［17］。同時，重組人腦利鈉肽亦可發(fā)揮中度利尿作用，能增加腎小球系膜細(xì)胞含量，擴(kuò)張腎臟入球的小動脈，有助于提高腎臟腎小球?yàn)V過率，改善機(jī)體免疫水平。本研究中，重組人腦利鈉肽組干預(yù)4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米組；CD8+水平低于呋塞米組，提示重組人腦利鈉肽可改善CHF大鼠免疫水平，提高機(jī)體的抗病能力，減輕腎臟組織損傷，利于大鼠恢復(fù)。

現(xiàn)代藥理結(jié)果表明，F(xiàn)AK是胞內(nèi)外信號出入的中樞，可介導(dǎo)多條信號通路，整合源于整合素、生長因子及機(jī)械刺激的信號，參與細(xì)胞的生長、調(diào)節(jié)，在CHF的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用；Bcl-2是癌基因的一種，具有抑制細(xì)胞凋亡作用，能抑制由多種細(xì)胞毒因素引起的細(xì)胞凋亡。既往研究表明，Bcl-2能增強(qiáng)細(xì)胞對多數(shù)DNA損傷因子發(fā)揮良好的抵抗性，但難以促進(jìn)DNA修復(fù)［18］。而p53蛋白屬于DNA損傷的分子傳感器，Bcl-2能抑制p53介導(dǎo)的凋亡，參與CHF的發(fā)生。Bax屬于兔抗人單克隆抗體，過度表達(dá)的Bax會對Bcl-2產(chǎn)生影響，加速細(xì)胞凋亡［19］。本研究中，重組人腦利鈉肽組FAK、Bax、p53水平低于呋塞米組；Bcl-2水平高于呋塞米組，提示重組人腦利鈉肽可改善FAK、Bax、p53、Bcl-2水平，為CHF的治療提供新的思路和方法。既往研究表明，CHF的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素過程，常伴有免疫水平異常，能引起T淋巴細(xì)胞水平異常。通過比較CHF與非CHF患者FAK、Bax、p53、Bcl-2水平發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞與FAK、Bax、p53、Bcl-2表達(dá)水平存在緊密聯(lián)系，加強(qiáng)FAK、Bax、p53、Bcl-2水平測定可反映、評估機(jī)體免疫狀態(tài)，指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述，重組人腦利鈉肽用于CHF大鼠中有助于提高其心功能水平，改善機(jī)體免疫水平，降低FAK、Bax、p53水平，提高Bcl-2水平，可為慢性心衰治療提供參考依據(jù)。