BBOX1-AS1被TFAP4激活從而促進胃癌細胞的增殖和遷移

張 琴 馬雨凡 嚴永峰 張 璐 張亞軍（涼山州第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西昌 615000）

胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，2017年全球累計新增122.1萬胃癌患者，86.5萬人因胃癌死亡，是癌癥相關死亡的第二大原因［1-2］。目前，胃癌的主要治療手段以手術切除和化療為主［3］。但胃癌患者的預后依舊很差，并存在復發(fā)和轉移現(xiàn)象。因此，深入闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的治療策略以改善胃癌患者的治療和預后具有深刻意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并可作為多種癌癥的潛在治療靶點［4-6］。BBOX1-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)其能夠海綿吸附miR-361-3p促進宮頸癌和結腸癌的發(fā)生發(fā)展［7-8］；卵巢癌中BBOX1-AS1吸附miR-361-3p可上調(diào)PODXL表達，促進卵巢癌的發(fā)生發(fā)展［9］。但關于BBOX1-AS1在胃癌中的功能和分子機制尚不明確，因此，本研究深入探討其在胃癌中的分子功能和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1及胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，并在本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司；RIPA細胞裂解液、Trizol裂解液、Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TFAP4過表達載體（oe-TFAP4）、TFAP4干擾序列（si-TFAP4）、BBOX1-AS1干擾序列（si-BBOX1-AS1）及其陰性對照載體（oe-NC、si-NC）、BBOX1-AS1野生型和突變型熒光素酶載體均由上海吉瑪生物有限公司構建合成；CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；TFAP4、MMP-2、MMP-9及辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和兔抗GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；ECL試劑盒購自中國Solarbio公司。干擾序列如下：si-TFAP4-5'-CAGGAAAACAGAGAAAGAAGTGA-3'；si-BBOX1-AS1#1-5'-TGGTTCTAAAATCTAAAAGAAGA-3'；si-BBOX1-AS1#2-5'-GAGCTATTCCATGTATTCCATGG-3'。

1.2 方法

1.2.1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫在線分析通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫Expression DIY模塊（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#analysis）以ANOVA為 分 析 方 法，|log2FC|＞1，q-value＜0.01為閾值，在線分析BBOX1-AS1在胃癌患者中的表達水平。

1.2.2 細胞培養(yǎng)將人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1及胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45培養(yǎng)于含10%（V/V）胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，進行后續(xù)研究。

1.2.3 細胞轉染取對數(shù)生長期的MKN45細胞，以0.8×106個/孔接種于6孔板，待細胞密度達到60%時，根據(jù)參考說明書使用Lipofectamine 3000轉染siRNA、重組載體和各自對照至MKN45細胞中。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）按照試劑盒說明書方案使用Trizol裂解液從細胞中提取總RNA，試劑盒反轉錄合成cDNA。SYBR熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR實驗。以GAPDH為內(nèi)參進行歸一化處理，結果用2-ΔΔCt值比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量差異。BBOX1-AS1正向引 物：5'-TGTGTGTTTCCTGAGGCCTC-3'；反 向 引物：5'-CGCCTCTCTTGGAACACCTT-3'；GAPDH正向引物：5'-CCACAGTCCATGCCATCAC-3'；反 向 引物：5'-CGTTCAGCTCAGGGATGAC-3'。

1.2.5 Western blot收集各處理組細胞，用預冷的RIPA裂解液冰上裂解10 min后提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量后，將等量蛋白于100 V下進行SDS-PAGE分離蛋白。之后以60 V、120 min將蛋白遷移至NC膜，一抗4℃孵育過夜，加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育120 min，然后用ECL試劑盒進行發(fā)光反應，拍照觀察蛋白印記。

1.2.6 JASPAR預測BBOX1-AS1和轉錄因子TFAP4的結合位點利用JASPAR數(shù)據(jù)庫（http：//jaspar.genereg.net/search？advanced=true）查詢轉錄因子TFAP4的信息，并導入BBOX1-AS1啟動子區(qū)序列信息，網(wǎng)站在線預測TFAP4和BBOX1-AS1啟動子的結合位點。

1.2.7 熒光素酶實驗利用Lipofectamine 3000分別將si-TRAP4、si-NC、oe-TRAP4、oe-NC和BBOX1-AS1野生型和突變型熒光素酶載體共轉染至MKN45細胞，轉染48 h后采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.8 CCK-8實驗將MKN45細胞以1×104個/孔接種于96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加入CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h。酶標儀檢測450 nm處的吸光度，測定細胞活力。

1.2.9 劃痕實驗將MKN45細胞以5×105個/孔接種于6孔板，當細胞密度達到80%后，用移液器槍頭在6孔板上輕輕劃過，PBS洗滌細胞3次，去除游離細胞。加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察并拍照，記錄0 h和24 h的細胞遷移情況。

1.3 統(tǒng)計學分析所有實驗均進行3次平行實驗，并采用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BBOX1-AS1在胃癌組織及細胞系中高表達 GEPIA2數(shù)據(jù)庫在線分析顯示BBOX1-AS1在胃癌組織中高表達（圖1A，P＜0.05），但其表達水平和胃癌患者預后關系不明顯（圖1B，P＞0.05）；qRT-PCR結果顯示，與正常胃黏膜上皮細胞系GES-1相比，BBOX1-AS1在胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45中均顯著高表達（P＜0.001，圖1C）。BBOX1-AS1在MKN45細胞系中表達水平最高，因此選擇MKN45細胞系進行下一步研究。

圖1 BBOX1-AS1在胃癌組織及細胞系中的表達情況Fig.1 Expression of BBOX1-AS1 in gastric cancer tissues and cell lines

2.2 TFAP4調(diào)控BBOX1-AS1表達Western blot結果顯示，相較于GES-1細胞，TFAP4在胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45中表達均顯著上調(diào)（P＜0.001，圖2A）。分別轉染TFAP4過表達載體（TFAP4過表達組）、TFAP4干擾序列（TFAP4抑制組）及其陰性對照至MKN45細胞。Western blot檢測TFAP4表達水平，結果表明，與si-NC組相比，TFAP4抑制組TFAP4表達水平顯著降低（P＜0.001，圖2B）；與oe-NC組相比，TFAP4過表達組TFAP4表達水平顯著增加（P＜0.01，圖2B）。此外，qRT-PCR結果顯示，與si-NC組相比，TFAP4抑制組BBOX1-AS1表達水平顯著降低（P＜0.01，圖2C）；與oe-NC組相比，TFAP4過表達組BBOX1-AS1表達水平顯著升高（P＜0.001，圖2C）。以上研究表明TFAP4可能調(diào)控BBOX1-AS1的表達。

圖2 TFAP4參與調(diào)控BBOX1-AS1表達Fig.2 TFAP4 is involved in regulating expression of BBOX1-AS1

2.3 TFAP4激 活BBOX1-AS1轉 錄JASPAR數(shù) 據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)TFAP4能夠與BBOX1-AS1啟動子區(qū)724～733位點結合（圖3A）。GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析顯示，TFAP4在胃癌組中高表達（P＜0.05，圖3B），但其與患者預后關系不明顯（P＞0.05，圖3C）；熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)在BBOX1-AS1啟動子野生型中，過表達TFAP4能夠增強熒光素酶活性，而抑制TFAP4則減弱熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖3D）；在BBOX1-AS1啟動子突變組（5'-ATCCGCTGTTCC-3'→5'-GGATAACGAA-3'）中則無上述現(xiàn)象。提示TFAP4和BBOX1-AS1啟動子區(qū)724～733位點結合并激活BBOX1-AS1轉錄。

圖3 TFAP4激活BBOX1-AS1轉錄Fig.3 TFAP4 activates transcription of BBOX1-AS1

2.4 抑制BBOX1-AS1表達可抑制胃癌細胞增殖qRT-PCR檢測BBOX1-AS1的干擾效率，結果表明，與si-NC組 相 比，si-BBOX1-AS1#1、2組 中BBOX1-AS1表 達 水 平 均 顯 著 降 低（P＜0.001，圖4A），其中si-BBOX1-AS1#1的表達水平更低，因此選擇si-BBOX1-AS1#1進行下一步研究。CCK-8和EDU實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-BBOX1-AS1#1組MKN45細胞增殖能力顯著降低（P＜0.001，圖4B、C）。提示抑制BBOX1-AS1表達能夠抑制胃癌細胞增殖。

圖4 抑制BBOX1-AS1表達對胃癌細胞增殖的影響Fig.4 Effect of inhibiting BBOX1-AS1 expression on proliferation of gastric cancer cells

2.5 干擾BBOX1-AS1表達可抑制胃癌細胞遷移劃痕實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-BBOX1-AS1#1組細胞遷移能力顯著降低（P＜0.001，圖5A）。Western blot結果顯示，與si-NC組相比，si-BBOX1-AS1#1組MNK45細胞MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低（P＜0.001，P＜0.01，圖5B）。提示干擾BBOX1-AS1表達能夠抑制胃癌細胞的遷移。

圖5 抑制BBOX1-AS1表達對胃癌細胞遷移的影響Fig.5 Effect of inhibiting BBOX1-AS1 expression on migration of gastric cancer cells

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)嚴重的衛(wèi)生健康問題，嚴重威脅人類的生命安全。胃癌患者常在晚期才被診斷出來，導致胃癌患者的治療效果不甚理想［10］。最近多項研究表明lncRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用［11］。lncRNA MAGI2-AS3受BRD4調(diào)控，通過海綿吸附miR-141/200a促進ZEB1過表達，進而促進胃癌進展［12］；lncRNA AC093818.1通過表觀遺傳學促進PDK1表達，加速胃癌轉移［13］；BBOX1-AS1在宮頸癌、結腸癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并可作為結直腸癌的預后標志物［14］，但關于其在胃癌中的研究還尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)BBOX1-AS1在胃癌組織和細胞系中高表達。此外，在胃癌中TFAP4也是重要因子［15］。研究發(fā)現(xiàn)TFAP4在胃癌中也高表達。

TFAP4是一個轉錄因子，在多數(shù)惡性腫瘤中異常表達，和腫瘤浸潤程度顯著相關，并與腫瘤患者的不良預后顯著相關［16-17］。有研究發(fā)現(xiàn)TFAP4在肝癌中激活Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路促進腫瘤惡性進展［18-19］。并且有研究發(fā)現(xiàn)TFAP4能轉錄激活lncRNA表達，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如：TFAP4與LASP1和LINC00520的啟動子區(qū)結合，轉錄激活LASP1和LINC00520表達，促進膠質(zhì)瘤惡性進展［20］；TFAP4能夠與lncRNA TRERNA1啟動子中的E-box基序結合并激活其轉錄，進而促進胃癌細胞的遷移和侵襲［21］。此外miR-608通過抑制TFAP4促進阿霉素誘導的非小細胞肺癌細胞凋亡［22］；miR-302C靶向TFAP4抑制結直腸癌上皮-間充質(zhì)轉化和轉移［23］。以上研究表明，TFAP4能夠調(diào)控lncRNA促進腫瘤惡性進展，且TFAP4能夠作為腫瘤治療的潛在靶標。本研究發(fā)現(xiàn)，TFAP4過表達能夠上調(diào)BBOX1-AS1表達，而抑制TFAP4表達可降低BBOX1-AS1表達。此外，JASPAR數(shù)據(jù)庫和熒光素酶實驗證實TFAP4能夠激活BBOX1-AS1轉錄，這與其既往研究結果一致［21］。最后課題組進一步探究BBOX1-AS1在MKN45細胞系中的分子功能，CCK-8和EDU實驗證實抑制BBOX1-AS1表達可抑制MKN45細胞增殖能力；劃痕實驗證實抑制BBOX1-AS1表達可抑制MKN45細胞遷移能力。

綜上所述，BBOX1-AS1和TFAP4在胃癌中高表達，TFAP4可與BBOX1-AS1的啟動子區(qū)結合轉錄激活BBOX1-AS1表達，進而促進胃癌細胞的增殖和遷移。