新型冠狀病毒肺炎無(wú)癥狀感染者的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

江晶晶，高 春，馮富娟，于曉輝，張久聰

（1. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730050；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）給世界許多國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)重大的傷害和挑戰(zhàn)。截至2021 年11 月30日，全球新冠肺炎確診人數(shù)已超過(guò)2.6 億例，累計(jì)死亡人數(shù)已達(dá)520 多萬(wàn)［1］。大多數(shù)COVID-19 患者都有典型的臨床表現(xiàn)，但隨著人們對(duì)COVID-19 的進(jìn)一步研究，以及SARS-CoV-2 的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步提高，發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀感染者的人數(shù)在不斷增加，許多COVID-19 無(wú)癥狀感染者因?yàn)闆](méi)有明顯的臨床表現(xiàn)容易被忽略，但由于體內(nèi)存在SARS-CoV-2，可將SARS-CoV-2 傳播給他人，從而加速了此次疫情在世界范圍內(nèi)的大流行，并給全球疫情防控帶來(lái)了極大的難度。因此，盡早發(fā)現(xiàn)并通過(guò)各種檢測(cè)手段確診無(wú)癥狀感染者是控制新冠疫情大流行的有效措施。本文將對(duì)現(xiàn)有的可用于檢測(cè)COVID-19 無(wú)癥狀感染者的方法及技術(shù)做一簡(jiǎn)要綜述。

1 COVID-19

COVID-19 是由SARS-CoV-2 引起的一種呼吸系統(tǒng)新發(fā)傳染病，其病原體SARS-CoV-2 是正單鏈RNA 病毒的β-冠狀病毒，呈球形或橢圓形，表面有突起狀的糖蛋白，電鏡下呈樹(shù)冠狀，具有高度傳染性和致病性。有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 是通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）介導(dǎo)入侵人體細(xì)胞，SARS-CoV-2 與ACE2 的結(jié)合力約為SARS 病毒的4 倍，這可能也是COVID-19 比SARS 傳染性更強(qiáng)的原因之一［2-4］。

人類(lèi)可通過(guò)呼吸道飛沫、接觸和糞便傳播等途徑感染SARS-CoV-2，從而引起COVID-19。COVID-19 的主要臨床表現(xiàn)有咳嗽、咳痰、咽痛、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)癥狀，惡心、嘔吐、腹瀉、腹部不適等消化道癥狀，以及發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛等全身癥狀。

2 COVID-19 無(wú)癥狀感染者

COVID-19 無(wú)癥狀感染者，即呼吸道等標(biāo)本SARS-CoV-2 病原學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性，但無(wú)發(fā)熱、干咳、咽痛等可自我感知的相關(guān)臨床表現(xiàn)者。COVID-19無(wú)癥狀感染者的臨床特點(diǎn)如下［5-7］：（1）24 h 內(nèi)兩次鼻拭子和（或）咽拭子標(biāo)本經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；（2）無(wú)任何可自我感知的臨床癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、乏力、咽痛、肌肉酸痛等；（3）呼吸道等標(biāo)本SARS-CoV-2 病原學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性，伴或不伴有胸部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）檢查可發(fā)現(xiàn)的肺部影像學(xué)改變。

COVID-19 無(wú)癥狀感染者雖然沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，但由于呼吸道等標(biāo)本SARS-CoV-2 病原學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性，說(shuō)明其體內(nèi)存在SARS-CoV-2，因此能夠?qū)⒉《緜鞑ソo他人，造成了疫情的擴(kuò)散與蔓延。

3 COVID-19 無(wú)癥狀感染者的檢測(cè)方法

3.1 核酸檢測(cè)

核酸檢測(cè)是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)（如逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、恒溫?cái)U(kuò)增、原位雜交、測(cè)序等）對(duì)各種體液標(biāo)本或組織標(biāo)本中病原體核酸（DNA 或RNA）的結(jié)構(gòu)、含量及亞細(xì)胞定位等進(jìn)行定性定量分析，來(lái)確定標(biāo)本是否發(fā)生病原體感染，從而幫助臨床上對(duì)疾病的診斷［8］。通過(guò)RT-PCR 進(jìn)行COVID-19 核酸檢測(cè)不僅是官方認(rèn)可的SARS-CoV-2 測(cè)定方法，也是目前篩查無(wú)癥狀感染者的主要檢測(cè)方式［9］。該檢測(cè)方法通常分兩步進(jìn)行，即核酸提取與PCR 擴(kuò) 增 ，總 歷 時(shí) 約 3～3.5 h［10］。 由 于SARS-CoV-2 在感染的早期就可以傳播，因此對(duì)該病毒的RT-PCR 檢測(cè)尤其適合于無(wú)癥狀感染者的早期篩查。

COVID-19 核酸檢測(cè)中常見(jiàn)的標(biāo)本采集方式有鼻拭子、咽拭子和肛拭子，而目前大規(guī)模篩查時(shí)COVID-19 主要采用鼻拭子和（或）咽拭子進(jìn)行標(biāo)本采集，這是因?yàn)椴《靖腥疽话銖纳虾粑篱_(kāi)始，由鼻咽部發(fā)展到咽部，最終發(fā)展至下呼吸道，可見(jiàn)，鼻咽部是病毒侵襲人體的第一道門(mén)戶(hù)，因此呼吸道標(biāo)本的病毒載量較高［11］。另外，該采樣方法簡(jiǎn)單快捷，易于操作。有研究表明，在進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)時(shí)，鼻拭子樣本比咽拭子樣本更敏感［12］。但鼻拭子采樣時(shí)，會(huì)造成患者組織黏膜損傷，尤其住院時(shí)間長(zhǎng)的患者，需進(jìn)行多次采樣，導(dǎo)致患者配合度下降，不愿留樣，不利于患者的診療評(píng)估［13］。Wu 等［14］發(fā)現(xiàn)，部分無(wú)癥狀感染者或輕癥感染者糞便或肛拭子核酸陽(yáng)性的持續(xù)時(shí)間比上呼吸道持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)癥狀感染者暴露第1～4 周咽拭子核酸陽(yáng)性率分別為40.72%、97.64%、58.72%、18.42%，糞便核酸陽(yáng)性率分別為8.97%、18.05%、51.38%、27.24%［15］。因此，在感染后第3～4 周增加肛拭子核酸檢測(cè)能夠提高無(wú)癥狀感染者的檢出率，減少漏診。但考慮到標(biāo)本采集的便捷性和私密性，目前僅針對(duì)隔離點(diǎn)等重點(diǎn)人群同時(shí)采集鼻咽拭子和肛拭子。

無(wú)癥狀感染者病毒載量不足、對(duì)標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸?shù)忍幚聿粯?biāo)準(zhǔn)、體外診斷試劑敏感性不佳、臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力不足等問(wèn)題，會(huì)影響核酸檢測(cè)的敏感性，可能導(dǎo)致漏診或延誤有效診斷。因此，對(duì)SARS-CoV-2 高度疑似患者應(yīng)聯(lián)合多種檢測(cè)手段、多次進(jìn)行SARS-CoV-2 檢測(cè)，提高核酸檢測(cè)的成功率，減少假陰性及陰性復(fù)陽(yáng)結(jié)果的出現(xiàn)。

3.2 抗原檢測(cè)

COVID-19 抗原檢測(cè)是指應(yīng)用SARS-CoV-2 的特異性抗體直接檢測(cè)樣本中的病原體，其適用的檢測(cè)樣本類(lèi)型一般來(lái)自于感染部位或血液，主要為鼻咽拭子、肺泡灌洗液、血清等［10］，所檢測(cè)的抗原類(lèi)型主要是SARS-CoV-2 的刺突糖蛋白（S）和核殼蛋白（N）［16］，其檢測(cè)結(jié)果可作為早期確診該病原體感染與否的直接證據(jù)。

免疫層析法是檢測(cè)SARS-CoV-2 抗原最常用的方法［17］。Diao 等［18］建立了一種特異性檢測(cè)SARS-CoV-2 N 蛋白抗原的熒光免疫層析試驗(yàn)，該檢測(cè)方法無(wú)需昂貴的設(shè)備，在10 min 內(nèi)即可檢測(cè)出SARS-CoV-2 感染。隨后他們運(yùn)用該方法對(duì)來(lái)自中國(guó)8 個(gè)中心醫(yī)院的疑似COVID-19 住院患者或門(mén)診患者的鼻咽拭子樣本中的SARS-CoV-2 N 蛋白抗原進(jìn)行定性檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)以SARS-CoV-2 Ct值為40 copies/mL 作為檢測(cè)的臨界值，N 蛋白抗原檢測(cè)的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性分別為75.6%（95%置信區(qū)間69.0%～81.3%）、100%（95% 置信區(qū)間91.1%～100.0%）和80.5%（95%置信區(qū)間75.1%～84.9%）。該結(jié)果表明N 蛋白抗原檢測(cè)具有較高的特異性，但其靈敏度相對(duì)較低。

有研究運(yùn)用Bioeasy 公司的新型SARS-CoV-2抗原檢測(cè)試劑盒，對(duì)127 位疑似病例的鼻咽部和口咽部拭子進(jìn)行熒光免疫層析SARS-CoV-2 抗原檢測(cè)，并對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，總體敏感性和特異性分別為93.9%（95% 置信區(qū)間86.5%～97.4%）和100%（95% 置信區(qū)間92.1%～100.0%），與RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果作為參考，該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率為96.1%，且在Ct 值為＞25.1 的亞組樣本中敏感性顯著降低，而在高病毒載量的樣本中敏感性明顯更高［17］。

由此可見(jiàn)，上述兩種COVID-19 抗原檢測(cè)的敏感性和特異性較為理想，但其結(jié)果受樣本質(zhì)量、采樣部位及病毒表達(dá)量等因素的影響較大，所以該檢測(cè)方法不應(yīng)取代RT-PCR 核酸檢測(cè)在SARSCoV-2感染診斷和篩查中的作用，如何降低COVID-19 抗原檢測(cè)在低病毒載量樣本中的假陰性率是該檢測(cè)方法可投入臨床使用的關(guān)鍵問(wèn)題。

3.3 血清抗體檢測(cè)

COVID-19 血清抗體檢測(cè)是指抽取受試者的血液標(biāo)本，檢測(cè)其血清當(dāng)中是否有抗SARS-CoV-2 S蛋白和N 蛋白的抗體存在以及存在的濃度水平，以確定機(jī)體是否發(fā)生免疫應(yīng)答。IgM 是當(dāng)人體發(fā)生感染時(shí)產(chǎn)生的第一種抗體，而IgG 是血清中最常見(jiàn)和最豐富的抗體，它們可通過(guò)結(jié)合和滅活SARS-CoV-2 的S 蛋白和N 蛋白來(lái)中和該病原體［19］。COVID-19 血清抗體檢測(cè)作為核酸檢測(cè)的有效補(bǔ)充正在迅速發(fā)展，我國(guó)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》［20］明確將抗體檢測(cè)結(jié)果納入確診COVID-19 感染病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及疑似病例的排除標(biāo)準(zhǔn)，另有許多證據(jù)表明其在診斷COVID-19 無(wú)癥狀感染方面也發(fā)揮著重要作用。

Lei 等［21］隨機(jī)采集了63 例無(wú)癥狀感染者的血清標(biāo)本，并采用化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)這些血清標(biāo)本中抗SARS-CoV-2 S 蛋白和N 蛋白的IgM 和IgG 抗體，發(fā)現(xiàn)核酸檢測(cè)聯(lián)合IgM 抗體血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率為55.5%，核酸檢測(cè)聯(lián)合IgG 抗體血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率為12.7%，而單純核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為6.3%。這就表明核酸檢測(cè)聯(lián)合血清學(xué)抗體檢測(cè)，尤其聯(lián)合IgM抗體檢測(cè)的靈敏度明顯高于單純核酸檢測(cè)。

另外，Liu 等［22］使用兩種基于SARS-CoV-2 S 蛋白和N 蛋白的ELISA 試劑盒檢測(cè)IgM 和IgG 抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于S 蛋白的IgM 和IgG 抗體對(duì)該試劑盒的敏感性分別為74.3%和77.1%，而基于N 蛋白的IgM 和IgG 抗體對(duì)該試劑盒的敏感性分別為70.1%和68.2%。由此可見(jiàn)，基于S 蛋白的ELISA 抗體檢測(cè)比基于N 蛋白的ELISA 抗體檢測(cè)具有更高的敏感性。

此外，血清學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本低，因此適合用于大規(guī)模篩查。但有研究顯示，抗體檢測(cè)在感染后的第1 周準(zhǔn)確率為30.1%，在第2 周準(zhǔn)確率為72.2%，3 周后的準(zhǔn)確率為91.4%［23］。顯然，血清抗體檢測(cè)在SARS-CoV-2 感染的早期不適用，在感染后的第2～3 周才能發(fā)揮重要的診斷作用。

3.4 胸部CT 掃描

胸部CT 掃描是利用CT 設(shè)備對(duì)胸部，其中主要是雙肺及縱膈進(jìn)行斷層成像檢查，是輔助診斷呼吸系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)影像學(xué)檢查方式。正常情況下雙肺內(nèi)空氣比較多，空氣在CT 圖像上密度很低，容易與其他組織結(jié)構(gòu)形成良好的天然對(duì)比。

COVID-19 患者最常見(jiàn)的CT 表現(xiàn)為胸膜下和肺外周帶多發(fā)磨玻璃影，伴或不伴有混合實(shí)變，部分可見(jiàn)病灶分布于支氣管血管束周?chē)?，病灶常?jiàn)為斑片狀、類(lèi)三角形或楔形、圓形、小葉中心結(jié)節(jié)，邊界模糊、伴有暈征或反暈征［24］。李剛等［25］回顧性研究了武漢某方艙醫(yī)院56 例新冠肺炎無(wú)癥狀感染者胸部CT 影像資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7 例（12.5%）患者胸部CT 影像未見(jiàn)明顯異常，其他49 例（87.5%）患者胸部影像均見(jiàn)明顯病灶，且病灶多見(jiàn)于雙肺（69.4%）。Chen 等［26］對(duì)20 例COVID-19 核酸檢測(cè)（經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)）或血清抗體檢測(cè)為陽(yáng)性的無(wú)癥狀感染者進(jìn)行胸部CT 掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有47.62%（95%CI：31.13%～72.87%）肺部異常，最常見(jiàn)的異常表現(xiàn)為肺部磨玻璃影41.11%（95%CI：19.7%～85.79%），其次為單側(cè)肺炎 30.95%（95%CI：22.22%～43.12%）和雙側(cè)肺炎27.13%（95%CI：1.7.28%～42.59%）表現(xiàn)。

由此可見(jiàn)，胸部CT 檢查對(duì)新冠肺炎無(wú)癥狀感染者具有很好的診斷價(jià)值，可以為新冠肺炎臨床治療決策和疫情防控提供重要依據(jù)。

3.5 生物傳感器的應(yīng)用

生物傳感器是利用微生物或生物組織中生命體的活動(dòng)現(xiàn)象作為變換結(jié)構(gòu)的傳感器，可以使生物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、抗原、抗體等）與物理化學(xué)換能器有機(jī)結(jié)合，從而檢測(cè)待測(cè)物濃度。許多研究者正在努力開(kāi)發(fā)可快速診斷COVID-19 的生物傳感器，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增已被廣泛應(yīng)用于多種病原體的檢測(cè)，包括嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒等［27，28］。電化學(xué)方法可以從電極表面的識(shí)別部位中區(qū)分出微小的變化，無(wú)需單抗體即可進(jìn)行無(wú)標(biāo)記檢測(cè)［29］。

Zhu 等［30］設(shè)計(jì)了一種多重逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（mRT-LAMP）和基于納米顆粒的橫向流動(dòng)生物傳感器（Nanoparticle-based Lateral Flow Biosensor）檢測(cè)方法（mRT-LAMP-LFB）來(lái)診斷COVID-19，為驗(yàn)證mRT-LAMP-LFB 法檢測(cè)SARS-CoV-2 的適用性，他們使用該方法檢測(cè)了海南省三亞市人民醫(yī)院的33 例COVID-19 確診患者口咽拭子樣本和96 例非COVID-19 患者口咽拭子樣本，結(jié)果顯示，檢測(cè)SARS-CoV-2 的靈敏度為100%（33/33 例COVID-19 患者口咽拭子樣本），特異性為100%（96/96例非COVID-19 患者口咽拭子樣本）。此外，該方法在1 h 內(nèi)即可完成從樣本采集到結(jié)果解釋的全部診斷過(guò)程。由此可見(jiàn)，mRT-LAMP-LFB 檢測(cè)方法診斷SARS-CoV-2 感染具有較高的敏感性和特異性，是一種快速、敏感、可靠的檢測(cè)技術(shù)，有望成為COVID-19 無(wú)癥狀感染者的常用診斷方法。然而，隨著SARS-CoV-2 病毒的廣泛傳播，mRT-LAMP-LFB技術(shù)的準(zhǔn)確性可能會(huì)受到靶基因引物序列區(qū)域發(fā)生突變的影響。

Abrego-Martinez 等［31］也提出了一種基于適配體來(lái)檢測(cè)SARS-CoV-2 S 蛋白的電化學(xué)生物傳感器。該傳感器可以直接用于與智能手機(jī)耦合的小型、低成本恒電位器，即可以使用手持恒電位器與智能手機(jī)相結(jié)合，直接在智能手機(jī)屏幕上實(shí)時(shí)快速檢測(cè)SARS-CoV-2 S 蛋白。但是該傳感器未經(jīng)臨床試驗(yàn)證明其對(duì)診斷COVID-19 的可靠性，若在臨床試驗(yàn)中能證實(shí)該傳感器對(duì)診斷COVID-19 以及無(wú)癥狀感染者的敏感性及特異性，這將有可能成為一種很有前景的COVID-19 檢測(cè)工具。

4 小結(jié)與展望

COVID-19 的全球肆虐嚴(yán)重威脅到世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)人民的身心健康，而COVID-19 無(wú)癥狀感染者人數(shù)的不斷增加在很大程度上加速了此次疫情的大流行。因此，通過(guò)各種檢測(cè)手段盡早發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀感染者對(duì)于控制SARS-CoV-2 的傳播至關(guān)重要。

核酸檢測(cè)是目前篩查新冠肺炎無(wú)癥狀感染者的主要檢測(cè)方式，然而，感染者病毒載量不足、對(duì)標(biāo)本的處理不當(dāng)?shù)葐?wèn)題，在很大程度上會(huì)影響核酸檢測(cè)的敏感性。SARS-CoV-2 抗原檢測(cè)具有較高的特異性和靈敏度，但檢測(cè)結(jié)果受樣本質(zhì)量、感染部位及病毒表達(dá)量等因素的影響也較大。血清學(xué)抗體檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本低，可與核酸檢測(cè)聯(lián)合使用以提高診斷的敏感性及準(zhǔn)確性。胸部CT 掃描對(duì)新冠肺炎無(wú)癥狀感染者具有很好的診斷價(jià)值，可以為新冠肺炎臨床治療決策和疫情防控提供重要依據(jù)。最后，生物傳感器等新技術(shù)的開(kāi)發(fā)對(duì)于COVID-19 無(wú)癥狀感染者的診斷也具有推進(jìn)作用，有望能在臨床試驗(yàn)中得到更好的證實(shí)。

盡管本文所提及的幾種可檢測(cè)新冠肺炎無(wú)癥狀感染者的方法和技術(shù)，大部分具有良好的敏感性和特異性，但同時(shí)還存在一些局限性。面對(duì)COVID-19 疫情的反復(fù)以及SARS-CoV-2 的快速傳播，仍迫切需要進(jìn)一步的探索和改進(jìn)COVID-19 無(wú)癥狀感染者的檢測(cè)方法與技術(shù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

江晶晶：選題和撰寫(xiě)；高春、馮富娟：文獻(xiàn)資料的收集和整理；于曉輝：指導(dǎo)修改初稿；張久聰：選題和設(shè)計(jì)。