• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鄰近標(biāo)記技術(shù)APEX2的發(fā)展與應(yīng)用

    2022-11-15 10:34:55羅思丁明
    科技與創(chuàng)新 2022年12期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞器生物素組學(xué)

    羅思,丁明

    (中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 211198)

    研究活細(xì)胞細(xì)胞器和亞細(xì)胞區(qū)域的蛋白質(zhì)組有助于理解細(xì)胞中組織和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),因此興起了許多方法?;卩徑鼧?biāo)記的方法結(jié)合質(zhì)譜(MS)的蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)分析為研究蛋白質(zhì)的相互作用提供了一種高通量的方法。近年來(lái),研究蛋白質(zhì)相互作用的鄰近依賴標(biāo)記技術(shù)也取得了很大發(fā)展。目前用于鄰近標(biāo)記技術(shù)的酶主要有3種:辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、鄰近依賴的生物素鑒定(BioID)和工程抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APEX)。雖然第一個(gè)基于生物素鄰近標(biāo)記的研究是利用HRP和芳基疊氮生物素做底物進(jìn)行的[1],但是HRP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中并不活躍。在細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境中,HRP的4個(gè)二硫鍵和2個(gè)Ca2+離子結(jié)合位點(diǎn)會(huì)被破壞,不能穩(wěn)定維持自身結(jié)構(gòu)[2]。這一缺陷限制了其在細(xì)胞內(nèi)相互作用方面的使用,因此HRP逐漸退出蛋白質(zhì)相互作用研究的舞臺(tái)?;贐ioID的鄰近標(biāo)記采用了來(lái)自大腸桿菌的生物素連接酶BirA的突變形式,利用質(zhì)譜檢測(cè)BirA修飾生物素化蛋白,可以鑒定出與感興趣蛋白相互作用的微弱或者短暫的蛋白質(zhì),目前這種技術(shù)已成功用于天然環(huán)境中相互作用伙伴的生化篩選[3-5]。然而在BirA標(biāo)記過(guò)程中,BirA的產(chǎn)物——生物素-腺苷酸酯的半衰期長(zhǎng)達(dá)數(shù)分鐘,以至于它導(dǎo)致的標(biāo)記半徑偏大,得到的結(jié)果假陽(yáng)性偏多。此外BirA標(biāo)記的速度很慢,通常需要18~24 h,因此很難研究高度動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)相互作用。因此BioID技術(shù)不能很好地運(yùn)用于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)相互作用,為了提高空間和時(shí)間的特異性,APEX2技術(shù)則被開發(fā)出來(lái)[6-7]。隨著APEX2技術(shù)的不斷拓展,越來(lái)越多的科學(xué)家開始利用APEX2技術(shù)來(lái)解決一些以前難以研究的問(wèn)題,例如亞細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的定位與分析、某些存在爭(zhēng)論的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)復(fù)合物的識(shí)別與鑒定等。本文主要對(duì)APXE2技術(shù)進(jìn)行總結(jié)與歸納,闡述其作用原理及APXE2技術(shù)在不同類型的相互作用的蛋白質(zhì)組的應(yīng)用。

    1 APEX2技術(shù)的策略

    1.1 工程抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APXE2)

    抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)是一種I類胞質(zhì)植物過(guò)氧化物酶,與HRP不同,由于缺乏二硫鍵和鈣離子,所以能夠在還原環(huán)境中保持天然的活性[8]。野生型的APX并未在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)試,并且其天然底物抗壞血酸鹽的結(jié)構(gòu)與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)基本不相同,加上APE是同型二聚體,嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的天然定位和功能[9-10],導(dǎo)致APE的適用性不大。隨后MARTELL等[11]在APE基礎(chǔ)上進(jìn)行改造,最終得到一種名為APEX的單體抗壞血酸過(guò)氧化物酶;相對(duì)于APE而言,APEX不僅缺乏二硫鍵和鈣結(jié)合位點(diǎn),可以在還原性的胞質(zhì)環(huán)境中表達(dá)而不失去活性,并且其活性得到很大改善。經(jīng)過(guò)改造過(guò)后的APEX,可以用于電子顯微鏡(EM)的細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白質(zhì)成像[11]和空間分辨蛋白質(zhì)組學(xué)定位成像[6-7]。然而APEX在使用過(guò)程中有一個(gè)很大缺陷——低靈敏度。當(dāng)APEX表達(dá)量低時(shí),其功能受到很大的局限性。因此LAM等[12]通過(guò)酵母展示和定向進(jìn)化技術(shù),在APXE的基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變,最終得到一種A134P的突變體,并命名為APEX2。它相對(duì)于APEX而言,具有相同的化學(xué)性質(zhì),但是其催化活性和表達(dá)量得到很大改善。由于APEX2標(biāo)記過(guò)程產(chǎn)生的生物素-苯氧基自由基是短壽命的(<1 ms),能夠產(chǎn)生一個(gè)較小的標(biāo)記半徑(<20nm),因此APEX2標(biāo)記能夠提供更高的空間和時(shí)間特異性。為了解決對(duì)依賴于相互作用的鄰近標(biāo)記工具的需求,HAN等[13]也在APEX2的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)一步定向進(jìn)化改造,得到了一種叫做分裂的APEX(sAPEX),sAPEX技術(shù)擴(kuò)展了鄰近標(biāo)記的方法,具有更高的時(shí)空分辨率,將基于APEX方法的效用擴(kuò)展到生物學(xué)的新領(lǐng)域。

    1.2 APEX2的技術(shù)原理

    APEX2技術(shù)原理可以分為兩大方向:①APEX2能夠在細(xì)胞內(nèi)形成電子密度高的鋨,然后通過(guò)EM進(jìn)行結(jié)構(gòu)的判斷。活細(xì)胞可以在二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和雙氧水(H2O2)的溶液中固定,APEX2可以催化DAB的聚合和局部沉積,隨后吸收電子密度較高的鋨,最后形成對(duì)比,最后用EM可視化APEX2的表達(dá)結(jié)構(gòu)[11]。②APEX2能夠在通過(guò)生物素化鄰近蛋白質(zhì),從而進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析。APEX2酶能夠在H2O2的存在下,將生物素-苯酚(BP)氧化成極短壽命(<1 ms)和高度活性的自由基,然后它們可以共價(jià)連接到在鄰近的內(nèi)源性蛋白質(zhì)中的富含電子的側(cè)鏈氨基酸殘基上,從而對(duì)底物進(jìn)行生物素標(biāo)記[6,11]。通過(guò)去除H2O2和加上淬滅緩沖液,可以中止標(biāo)記反應(yīng),然后可以利用鏈霉親和素的珠子分離得到生物素化蛋白,并通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)一步分析[6-7]。

    2 APEX2技術(shù)的應(yīng)用

    2.1 在不同細(xì)胞器和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域中蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

    細(xì)胞器蛋白質(zhì)組和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域的表征對(duì)于理解細(xì)胞組織、識(shí)別蛋白質(zhì)復(fù)合物以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是必不可少的。APEX2技術(shù)介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記最早是由RHEE及其同事發(fā)現(xiàn),其目的是規(guī)避傳統(tǒng)的線粒體純化的局限性和實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器蛋白質(zhì)組定位的時(shí)空特異性[6]。由于生物素-苯氧基自由基不具有膜透性,APEX2技術(shù)非常適合用于膜封閉的亞細(xì)胞室的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,例如線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、自噬體等結(jié)構(gòu)。線粒體由外膜(OMM)、內(nèi)膜(IMM)以及線粒體基質(zhì)組成。線粒體基質(zhì)是IMM所包圍的內(nèi)部的亞細(xì)胞器區(qū)域,位于OMM和IMM之間的區(qū)域稱為膜間空間(IMS)。為了檢測(cè)APEX在蛋白質(zhì)組學(xué)上的標(biāo)記能力,RHEE等將線粒體基質(zhì)靶向APEX用于人胚腎細(xì)胞(HEK),并結(jié)合雙態(tài)SILAC標(biāo)記和MS進(jìn)行相對(duì)定量,最終495個(gè)蛋白被鑒定為線粒體基質(zhì)蛋白,其中94%的蛋白質(zhì)有線粒體注釋,另外6%被認(rèn)為是新的線粒體蛋白。此外一些先前被認(rèn)為存在于IMS或OMM的蛋白質(zhì),包括原卟啉原氧化酶,被APEX技術(shù)得到的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)重新分配到線粒體基質(zhì)的歸屬,并且通過(guò)電子顯微鏡證實(shí)。RHEE等的研究充分展示了APXE技術(shù)在面對(duì)基質(zhì)的內(nèi)膜蛋白和膜間空間(IMS)之間具有特別的特異性和區(qū)別。APEX介導(dǎo)的蛋白質(zhì)組映射的特異性,結(jié)合其易用性,為生物學(xué)家了解活細(xì)胞的分子組成提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

    隨后HUNG等[7]通過(guò)對(duì)線粒體IMS的研究,進(jìn)一步證實(shí)APEX技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)空間和時(shí)間特異性蛋白質(zhì)組的映射。此外APEX2也已經(jīng)成功地應(yīng)用于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜[14]和自噬體內(nèi)腔[15]中蛋白質(zhì)組的研究。APEX2技術(shù)除了應(yīng)用于這幾個(gè)膜細(xì)胞器的研究外,有科學(xué)家將APEX2技術(shù)也成功應(yīng)用于細(xì)胞核中蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[16]。核層(NL)是位于內(nèi)部核膜下的細(xì)胞核的一個(gè)亞結(jié)構(gòu)。NL的主要結(jié)構(gòu)成分是中間絲蛋白,分為A型和B型。TRAN等[17]通過(guò)將APEX2融合到NL-B1蛋白中,成功地識(shí)別出NL近端蛋白、RNA、DNA。APEX的應(yīng)用并不局限于膜封閉的細(xì)胞器的分析,它已成功地用于分析非膜封閉的細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組,如原發(fā)性纖毛[18]。

    除了成功利用APEX技術(shù)來(lái)分析細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)分析外,APEX還為鑒定相互作用的蛋白質(zhì)提供了一個(gè)很好的工具。例如將APEX2與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+傳感器STIM1融合,在活細(xì)胞中能夠很好地映射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜連接的蛋白質(zhì)組,也鑒定出STIM激活的增強(qiáng)子TMEM110(STIMATE)[19]。BERSUKER等[20]也將APEX2應(yīng)用于脂滴相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,這種方法不僅鑒定到許多之前驗(yàn)證過(guò)的脂滴蛋白,也揭示了新的脂滴蛋白,并且還能通過(guò)APEX2技術(shù)對(duì)脂滴動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究,揭示其調(diào)控機(jī)制。KE等[21]也是在APEX2的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)修飾的酚羥基結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì),得到了高標(biāo)記特異性的生物素-苯酚類似物,也同樣展示出APEX2技術(shù)能夠很好地應(yīng)用于在活細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白質(zhì)的分析。

    2.2 在蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

    除鑒定相互作用蛋白外,APEX2技術(shù)同樣具備強(qiáng)大的定位功能。Sigma-1受體(S1R)主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER),作為一個(gè)多能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子,在細(xì)胞中有多種作用,包括離子通道調(diào)節(jié)、應(yīng)激信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),然而,這種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的基本拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)仍然存在爭(zhēng)議。由于關(guān)于ER膜中S1R蛋白確切拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的報(bào)道相互矛盾,MAⅤYLUTOⅤ等[22]應(yīng)用APEX2技術(shù),在全長(zhǎng)S1R蛋白的N端或者C端連上APXE2,再利用APEX2技術(shù)能夠在細(xì)胞內(nèi)形成電子密度高的鋨,然后通過(guò)EM進(jìn)行結(jié)構(gòu)判斷的原理,最終確定了全長(zhǎng)S1R的N端面對(duì)細(xì)胞質(zhì),而C端面對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔,成功地解決了Sigma-1受體N端和C端的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的問(wèn)題,展示出APXE2技術(shù)在爭(zhēng)論的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)上的強(qiáng)大定位功能。

    2.3 在RNAs蛋白相互作用分析中的應(yīng)用

    APEX2不僅可以研究蛋白質(zhì)的相互作用,還可以應(yīng)用于分析細(xì)胞內(nèi)RNAs的空間環(huán)境和RNA蛋白相互作用。不同的核糖核蛋白復(fù)合物控制mRNA的加工、翻譯和衰變。這些復(fù)合物中的轉(zhuǎn)錄本定位于細(xì)胞的特定區(qū)域,并可以凝結(jié)成非膜結(jié)合結(jié)構(gòu),如應(yīng)激顆粒。然而,事實(shí)證明,繪制這些大型動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的RNA組成具有挑戰(zhàn)性。2019年,PADRóN等[23]利用APEX2技術(shù),開發(fā)了一種名為APEX-seq的技術(shù),解決了RNAs的定位問(wèn)題,并且還鑒定出關(guān)鍵的RNAs結(jié)合蛋白。將空間轉(zhuǎn)錄組(如APEX-seq所揭示的)與空間蛋白質(zhì)組(如APEX-質(zhì)譜所確定的)進(jìn)行匹配,精確地平行獲得,為研究活性mRNA的翻譯起始復(fù)合物的組織結(jié)構(gòu)和應(yīng)激顆粒組成提供了新的見(jiàn)解。APEX2技術(shù)允許一個(gè)強(qiáng)大的和通用的方法來(lái)探索大分子的空間環(huán)境。2020年,HAN等[24]也利用MS2-MCP系統(tǒng)和設(shè)計(jì)的CRISPR-Cas13系統(tǒng)將APEX2以高特異性靶向人端粒酶RNA hTR,在1 min的鄰近生物素化過(guò)程中,捕獲了hTR的候選結(jié)合伙伴,發(fā)現(xiàn)了12未鑒定過(guò)的hTR結(jié)合蛋白。MS2-和Cas13靶向的APEX2技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞中新的RNA蛋白相互作用。

    2.4 在體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

    除了細(xì)胞水平外,APEX2技術(shù)也同樣適用于體內(nèi)研究。CHEN等[25]通過(guò)構(gòu)建mito-APEX,成功地將APEX2技術(shù)用于表征活果蠅肌肉細(xì)胞中的線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)組,實(shí)現(xiàn)了APEX2在體內(nèi)的研究。利用APEX2技術(shù)建立了活果蠅組織的蛋白質(zhì)組定位平臺(tái),一旦激活,APEX2酶催化鄰近內(nèi)源性蛋白質(zhì)的生物素化,然后可以被分離并被質(zhì)譜鑒定。APEX2技術(shù)在果蠅不同亞細(xì)胞室的多個(gè)組織中具有有效的標(biāo)記功能,并繪制了果蠅肌肉線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)組圖,進(jìn)一步證明APEX2技術(shù)在活細(xì)胞亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組表征方面的能力。

    此外APEX2也已被進(jìn)一步應(yīng)用于酵母細(xì)胞,利用優(yōu)化過(guò)的APEX2技術(shù),HWANG等[26]在酵母細(xì)胞中鑒定出一個(gè)新的高爾基定位的蛋白酶Rbd2的結(jié)合蛋白——Cdc48,并表明該蛋白在Rbd2識(shí)別SREBP中的發(fā)揮作用。SINGER-KRüGER等[27]也在酵母細(xì)胞中,通過(guò)APEX2技術(shù)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC),很好地展示膜封閉和半開放室、線粒體基質(zhì)和細(xì)胞核的蛋白質(zhì)組圖譜,并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的蛋白Yer156C。

    3 總結(jié)

    作為一種鄰近標(biāo)記技術(shù),APEX2技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的鑒定,也實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)組學(xué)定位以及瞬時(shí)、動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的識(shí)別,使得APEX2技術(shù)被越來(lái)越多的人所接受。APEX2技術(shù)能追蹤細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)的、動(dòng)態(tài)的分子間相互作用,更好地繪制分子間相互作用圖譜,獲得更為深入全面的生物學(xué)信息。相信在不久的將來(lái),APEX2技術(shù)能夠成為研究生命科學(xué)問(wèn)題主流手段。

    猜你喜歡
    細(xì)胞器生物素組學(xué)
    我國(guó)科學(xué)家繪制“生命暗物質(zhì)”圖譜
    生物素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用
    口腔代謝組學(xué)研究
    基于UHPLC-Q-TOF/MS的歸身和歸尾補(bǔ)血機(jī)制的代謝組學(xué)初步研究
    細(xì)胞器
    植物細(xì)胞器DNA的新功能
    ——可作為磷酸鹽庫(kù)再利用!
    蔬菜(2018年12期)2018-01-16 05:27:32
    防治脫發(fā)的生物素
    新型生物素標(biāo)記的苦杏仁苷活性探針的合成
    生物素的營(yíng)養(yǎng)功能及其在奶牛飼養(yǎng)中的應(yīng)用
    代謝組學(xué)在多囊卵巢綜合征中的應(yīng)用
    女人精品久久久久毛片| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲专区中文字幕在线| 777米奇影视久久| 国产不卡av网站在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜精品在线福利| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 深夜精品福利| 丝袜在线中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99久久国产精品久久久| 丰满的人妻完整版| 三上悠亚av全集在线观看| 电影成人av| 国产在线一区二区三区精| 欧美久久黑人一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美av亚洲av综合av国产av| av电影中文网址| 成人国语在线视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 91国产中文字幕| 中文字幕制服av| 一区二区三区国产精品乱码| 男女下面插进去视频免费观看| 下体分泌物呈黄色| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 激情视频va一区二区三区| 国产男女内射视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜两性在线视频| 在线播放国产精品三级| 日本a在线网址| 丁香欧美五月| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美激情 高清一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 中文字幕色久视频| 天堂中文最新版在线下载| 男人舔女人的私密视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品久久久精品久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av美国av| 搡老岳熟女国产| 国产成人av激情在线播放| 久久久久久久精品吃奶| 国产欧美日韩一区二区三| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成熟少妇高潮喷水视频| 丝袜美足系列| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产真人三级小视频在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 18禁美女被吸乳视频| 韩国精品一区二区三区| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 搡老熟女国产l中国老女人| 成人手机av| 18禁国产床啪视频网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 激情视频va一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 麻豆av在线久日| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| a级毛片黄视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 麻豆av在线久日| 欧美激情 高清一区二区三区| 99国产精品一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 91成年电影在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 看片在线看免费视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99精国产麻豆久久婷婷| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av日韩在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 免费在线观看日本一区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区在线观看完整版| 香蕉丝袜av| 精品亚洲成国产av| 无限看片的www在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 很黄的视频免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产一区有黄有色的免费视频| 超碰成人久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 黄片大片在线免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲第一青青草原| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲色图av天堂| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 老司机影院毛片| 啦啦啦免费观看视频1| 老司机深夜福利视频在线观看| 99热网站在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 男女午夜视频在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| av一本久久久久| 国产麻豆69| 操出白浆在线播放| 久久精品91无色码中文字幕| 香蕉丝袜av| 亚洲av电影在线进入| 他把我摸到了高潮在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 真人做人爱边吃奶动态| 久久青草综合色| 黑人猛操日本美女一级片| 男人操女人黄网站| cao死你这个sao货| a级片在线免费高清观看视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 99国产精品一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 成人三级做爰电影| 国产主播在线观看一区二区| 国产一区有黄有色的免费视频| 99精品久久久久人妻精品| 男女床上黄色一级片免费看| 国产野战对白在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 婷婷丁香在线五月| 久久九九热精品免费| 久久久久久久午夜电影 | 亚洲专区中文字幕在线| 一本综合久久免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产免费男女视频| 国产免费男女视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费在线观看日本一区| 夜夜夜夜夜久久久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久中文字幕人妻熟女| 国产男女超爽视频在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| av欧美777| 国产在线观看jvid| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜激情av网站| www日本在线高清视频| 男男h啪啪无遮挡| 免费不卡黄色视频| 桃红色精品国产亚洲av| 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 在线看a的网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲 国产 在线| 一级a爱视频在线免费观看| 午夜激情av网站| 手机成人av网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜精品在线福利| 69av精品久久久久久| 露出奶头的视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 一级毛片精品| 中文字幕最新亚洲高清| 精品熟女少妇八av免费久了| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美日韩av久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 叶爱在线成人免费视频播放| 热99久久久久精品小说推荐| 热99久久久久精品小说推荐| 91大片在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 99精品久久久久人妻精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲人成电影观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 女人精品久久久久毛片| 91麻豆av在线| 欧美最黄视频在线播放免费 | 亚洲成人国产一区在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 黑丝袜美女国产一区| 色94色欧美一区二区| 天堂中文最新版在线下载| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕人妻熟女乱码| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品久久蜜臀av无| 国产成人啪精品午夜网站| 成人影院久久| 成人影院久久| 午夜免费鲁丝| xxxhd国产人妻xxx| 美国免费a级毛片| 精品福利观看| 一区二区三区激情视频| 身体一侧抽搐| 午夜视频精品福利| 久久国产乱子伦精品免费另类| 精品久久久久久,| 国产亚洲精品第一综合不卡| 99re在线观看精品视频| 在线观看午夜福利视频| 久久草成人影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日本黄色视频三级网站网址 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲人成电影观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 黄色女人牲交| 久久国产亚洲av麻豆专区| 老鸭窝网址在线观看| av中文乱码字幕在线| 亚洲综合色网址| 久9热在线精品视频| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美日韩av久久| 欧美激情高清一区二区三区| 成人三级做爰电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产单亲对白刺激| 亚洲综合色网址| 精品久久久久久电影网| 久久性视频一级片| 亚洲色图av天堂| 久久香蕉精品热| 久久狼人影院| 久久久久视频综合| 精品人妻在线不人妻| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 天天影视国产精品| 国产淫语在线视频| www日本在线高清视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品福利观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 黄色a级毛片大全视频| 岛国毛片在线播放| av视频免费观看在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 身体一侧抽搐| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产一区在线观看成人免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 免费日韩欧美在线观看| av国产精品久久久久影院| 国产精品久久电影中文字幕 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 香蕉丝袜av| 日本a在线网址| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 9热在线视频观看99| 免费在线观看亚洲国产| 男人的好看免费观看在线视频 | 日日夜夜操网爽| xxxhd国产人妻xxx| 欧美中文综合在线视频| 国产精品欧美亚洲77777| 后天国语完整版免费观看| 黄频高清免费视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 很黄的视频免费| 日韩欧美免费精品| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品在线观看二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 91字幕亚洲| 天堂动漫精品| 免费观看a级毛片全部| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一区二区三区激情视频| 天堂动漫精品| 久久久久视频综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av中文乱码字幕在线| 黄片大片在线免费观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲美女黄片视频| cao死你这个sao货| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产野战对白在线观看| 69av精品久久久久久| 日日夜夜操网爽| 成人av一区二区三区在线看| 极品教师在线免费播放| 国产男女内射视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产三级黄色录像| 国产成人免费观看mmmm| 岛国在线观看网站| 久久久久久久午夜电影 | 老司机在亚洲福利影院| a级片在线免费高清观看视频| 香蕉国产在线看| 亚洲av成人一区二区三| 日本欧美视频一区| 日韩视频一区二区在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美午夜高清在线| 欧美乱妇无乱码| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜久久久在线观看| 亚洲三区欧美一区| 99国产综合亚洲精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线天堂中文资源库| 中文字幕色久视频| 黄色 视频免费看| 日韩欧美免费精品| 9色porny在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 国产又爽黄色视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 一级毛片精品| 亚洲片人在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 不卡av一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 在线永久观看黄色视频| 欧美中文综合在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 成人影院久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| 热99re8久久精品国产| av天堂久久9| 国产男女内射视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产看品久久| 欧美日韩乱码在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产视频一区二区在线看| 宅男免费午夜| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲熟女毛片儿| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 午夜福利影视在线免费观看| 国产一卡二卡三卡精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 99热只有精品国产| 免费观看精品视频网站| 国产午夜精品久久久久久| 91老司机精品| 天堂√8在线中文| 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美黄色片欧美黄色片| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产高清激情床上av| 欧美精品av麻豆av| 欧美黑人欧美精品刺激| 脱女人内裤的视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 午夜福利视频在线观看免费| 国产男女内射视频| 在线观看免费视频网站a站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩免费av在线播放| 人人妻人人澡人人看| 黄色 视频免费看| 欧美日韩视频精品一区| 美国免费a级毛片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美日韩av久久| 女人久久www免费人成看片| 国产免费现黄频在线看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲专区字幕在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久久久视频综合| 少妇 在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲一码二码三码区别大吗| 麻豆成人av在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 满18在线观看网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品二区激情视频| 两人在一起打扑克的视频| 免费黄频网站在线观看国产| 精品无人区乱码1区二区| 国产在线观看jvid| 国产精品一区二区在线不卡| 国产不卡av网站在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 大型黄色视频在线免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 久久久国产精品麻豆| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩福利视频一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 99热只有精品国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一夜夜www| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久热爱精品视频在线9| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人啪精品午夜网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美成人午夜精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜精品国产一区二区电影| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久人妻av系列| 亚洲中文av在线| 黄色丝袜av网址大全| 免费少妇av软件| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品永久免费网站| 大型黄色视频在线免费观看| 桃红色精品国产亚洲av| 国产成人免费无遮挡视频| 国产高清激情床上av| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品久久久av美女十八| 老司机午夜十八禁免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 精品国产一区二区久久| 久久精品国产a三级三级三级| 国产亚洲欧美98| 一级a爱片免费观看的视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 高清视频免费观看一区二区| 一级毛片女人18水好多| 亚洲九九香蕉| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产av精品麻豆| 又黄又爽又免费观看的视频| 波多野结衣一区麻豆| 精品人妻1区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 男人舔女人的私密视频| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲第一青青草原| 国产1区2区3区精品| 一夜夜www| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产av一区二区精品久久| 国产高清国产精品国产三级| 欧美日本中文国产一区发布| netflix在线观看网站| 精品福利永久在线观看| 老司机靠b影院| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 丝袜美足系列| 精品福利永久在线观看| 水蜜桃什么品种好| 老鸭窝网址在线观看| 高清欧美精品videossex| 国产精品.久久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产淫语在线视频| 黑人猛操日本美女一级片| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产1区2区3区精品| 欧美日韩黄片免| 俄罗斯特黄特色一大片| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本一区二区免费在线视频| 久久久久久久国产电影| 日本一区二区免费在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产av又大| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲色图综合在线观看| 天堂动漫精品| 久久 成人 亚洲| 国产精品九九99| 99国产精品99久久久久| 黑丝袜美女国产一区| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲熟妇熟女久久| 免费日韩欧美在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 香蕉丝袜av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 极品人妻少妇av视频| 成年动漫av网址| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久久久久久久久久大奶| 美女视频免费永久观看网站| 国产97色在线日韩免费| 亚洲,欧美精品.| 99国产精品一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女午夜性视频免费| 久久 成人 亚洲| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线免费观看的www视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产午夜精品久久久久久| av国产精品久久久久影院| 99re6热这里在线精品视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产一区二区激情短视频| 99国产精品99久久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黄色怎么调成土黄色| 十八禁网站免费在线| 精品高清国产在线一区| 男女之事视频高清在线观看| 黄色成人免费大全| 一区在线观看完整版| 久久人人97超碰香蕉20202| 正在播放国产对白刺激| 午夜亚洲福利在线播放| ponron亚洲| 国产高清国产精品国产三级| 成在线人永久免费视频| 国产精品久久久久久精品古装| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲avbb在线观看| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 无人区码免费观看不卡| 人妻一区二区av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 最近最新免费中文字幕在线| 黄色 视频免费看| 女人精品久久久久毛片| 99久久人妻综合| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日韩欧美免费精品| 国产精品免费视频内射| 后天国语完整版免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产单亲对白刺激| 国产不卡av网站在线观看|