不同支架間充質(zhì)干細(xì)胞治療膝骨性關(guān)節(jié)炎現(xiàn)狀△

鞏樹偉，馬劍雄，馬信龍*

（1天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2天津大學(xué)天津醫(yī)院，天津 300050）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA）是一類以膝關(guān)節(jié)疼痛，腫脹功能受限為特征的退行性疾病，也是造成中老年行動(dòng)能力下降的主要原因之一[1]。目前 KOA 在世界各國(guó)發(fā)病率均較高[2，3]，我國(guó)表現(xiàn)出癥狀的KOA患者占總?cè)丝诘?.1% ，而其中80歲以上的老年人中患病率接近50%[4]。

軟骨改變，骨質(zhì)增生，滑膜炎癥是KOA的主要病理表現(xiàn)，其中以軟骨和軟骨下骨的退變最為突出。研究認(rèn)為KOA發(fā)病早期的軟骨損傷仍屬于可逆轉(zhuǎn)狀態(tài)，但若沒有得到足夠的重視與良好的治療，KOA中晚期軟骨往往無法修復(fù)，導(dǎo)致病情逐漸加重。因此，疾病的早期發(fā)現(xiàn)與治療意義重大[5]，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）作為一種有效的中早期軟骨修復(fù)治療近年來被大量研究。

1 MSCs作為一種多能干細(xì)胞可使關(guān)節(jié)軟骨再生

MSCs是一種多能成體干細(xì)胞，可在一個(gè)較高的頻率里增值，且可以分化不同種類的其他細(xì)胞，種類涉及骨與軟骨、體內(nèi)各類器官、神經(jīng)細(xì)胞等[6]。除具有高增值率和分化潛能外，MSCs還具有分泌一些活性因子的能力，其中以外泌體功能最強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)MSCs來源的外泌體可以明顯減輕KOA的炎性水平，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)免疫反應(yīng)[7]。

2 目前MSCs治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的弊端

近年來，隨著MSCs研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)其也具有一定缺點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，將KOA患者的關(guān)節(jié)液與細(xì)胞培養(yǎng)液混合后進(jìn)行MSCs體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可明顯降低MSCs的活性，降低MSCs分泌活性物質(zhì)的能力。同時(shí)發(fā)現(xiàn)KOA患者來源的滑膜組織也會(huì)抑制MSCs的軟骨分化能力[8]。另有研究表明，由于KOA關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在比健康人更多的關(guān)節(jié)液，這些關(guān)節(jié)液對(duì)周圍組織的壓迫會(huì)導(dǎo)致組織缺血缺氧加重，減少細(xì)胞有氧代謝，促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)酸性環(huán)境惡化[9]。Luo等[10]認(rèn)為膝關(guān)節(jié)內(nèi)的酸性環(huán)境對(duì)MSCs的功能有明顯的抑制作用。這些研究說明KOA關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境并不適合MSCs增殖與分化，因此尋找一種合適的培養(yǎng)支架十分重要。

3 目前MSC培養(yǎng)支架的意義以及類型

為確保MSCs種植于關(guān)節(jié)腔后的存活率，最大程度發(fā)揮出MSCs的軟骨修復(fù)能力，目前支架已經(jīng)十分普遍地用于MSCs治療KOA的各項(xiàng)研究中。支架的主要作用是為MSCs提供穩(wěn)定環(huán)境，使細(xì)胞在支架上更好地存活，維持其表型并合成所有必要的分子和蛋白質(zhì)。因此，首先所有干細(xì)胞支架材料都具有一定的基本特征，其中包括高孔隙率、較大的表面積、表面剛性、特定的三維形狀和生物降解性；其次由于支架的主要功能之一是引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，因此材料必須提供足夠的細(xì)胞粘附，且有利于細(xì)胞遷移[11]。

3.1 膠原支架

由于膠原是構(gòu)成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，因此該支架是目前最常見的一類MSCs培養(yǎng)支架。膠原支架具有多層開放性結(jié)構(gòu)，并且膠原酶可將其降解，降解產(chǎn)物無毒性，這些優(yōu)勢(shì)均為膠原材料作為一種優(yōu)秀的MSCs支架奠定了基礎(chǔ)。

3.1.1 Ⅰ型膠原支架

由于Ⅰ型膠原大量存在于骨骼組織中，常用于搭載MSCs進(jìn)行骨缺損研究，因此使用Ⅰ型膠原進(jìn)行軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)研究較少，但 Zscharnack[12]和 Tang?ni[13]的研究均發(fā)現(xiàn)I型膠原支架有一定的促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞分化作用，并且兩位研究者認(rèn)為不同氧的濃度可以刺激MSCs的軟骨分化，Zscharnack[12]認(rèn)為在較為缺氧的5% 氧濃度下可更好地促進(jìn)MSCs的軟骨誘導(dǎo)，但Tangni[13]認(rèn)為在I型膠原支架培養(yǎng)下使用前期常規(guī)氧（21% ），后期缺氧（<5% ）培養(yǎng)可更好地促進(jìn)MSCs的軟骨誘導(dǎo)。上述研究說明雖然Ⅰ型膠原支架在骨缺損領(lǐng)域使用較多，但也有一定促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖分化的作用。

3.1.2 Ⅱ型膠原支架

作為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，Ⅱ型膠原細(xì)胞支架培養(yǎng)MSCs在近年來被大量研究，Wei等[14～16]的研究均認(rèn)為無論將骨髓或臍血來源的MSCs種植于Ⅱ型膠原細(xì)胞支架后，該支架都具有促進(jìn)MSCs附著生長(zhǎng)的作用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有II型膠原和糖胺聚糖等軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，缺損處新的軟骨形成。Nakamuta等[17，18]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)中添加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）以及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）在Ⅱ型膠原支架促M(fèi)SCs軟骨化的過程中起了重要作用。

王瑾等對(duì)Ⅰ型膠原以及Ⅱ型膠原對(duì)MSCs分化的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在兩種支架培養(yǎng)下，SOX9、Ⅰ型、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的基因、蛋白表達(dá)均明顯上升，但所有指標(biāo)都以Ⅱ型膠原表達(dá)上升更為明顯。Tamaddon、陳輝等[20]的研究印證了上述結(jié)論，證明Ⅱ型膠原支架相比于Ⅰ型膠原支架更能促進(jìn)軟骨形成。因此Ⅱ型膠原對(duì)于MSCs向軟骨分化是一種十分適宜的細(xì)胞支架。

3.2 透明質(zhì)酸支架

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA）是一類優(yōu)秀的天然聚合物支架材料，在臨床中常作為的關(guān)節(jié)內(nèi)液體潤(rùn)滑劑，目前美國(guó)骨科醫(yī)師協(xié)會(huì)發(fā)布的指南仍建議使用HA 對(duì) KOA 進(jìn)行治療[5]。

在過去的十幾年中，對(duì)這一類天然支架運(yùn)載MSCs治療KOA進(jìn)行了大量的研究。Lang等[21]研究發(fā)現(xiàn)MSCs聯(lián)合HA注射相比于單純MSCs以及HA可更好的修復(fù)比格犬KOA的軟骨損傷。Amann[22]發(fā)現(xiàn)上調(diào)復(fù)合支架中HA的含量極大地影響了MSCs的增殖能力、細(xì)胞活力和機(jī)械性能。并且隨著HA含量的增加，MSCs分泌的糖胺聚糖顯著增加，這說明HA對(duì)MSCs的軟骨分化能力有明顯作用。

由于對(duì)HA支架研究較早，因此在臨床中已經(jīng)使用HA作為支架聯(lián)合MSCs治療KOA，Yong-Beom Park進(jìn)行了一項(xiàng)為期7年的臨床隨機(jī)對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)MSCs和HA支架治療的KOA患者，在治療后12周的關(guān)節(jié)鏡檢查中觀察到已存在較為成熟的新生軟骨組織，VAS和IKDC評(píng)分在24周時(shí)開始改善，1年時(shí)的新生軟骨組織學(xué)表現(xiàn)為透明樣軟骨，3年時(shí)MRI顯示再生軟骨持續(xù)存在，并且經(jīng)過改善的臨床結(jié)果在7年的隨訪中保持穩(wěn)定。該實(shí)驗(yàn)說明HA聯(lián)合MSCs再生的軟骨臨床療效較為持久[23]。

3.3 纖維蛋白

同樣作為天然的生物材料，纖維蛋白與透明質(zhì)酸性質(zhì)類似，無毒性，具有三維結(jié)構(gòu)和一定的吸附能力。童培建[24]將MSCs與纖維蛋白凝膠制成凝膠復(fù)合物，并將其接種于兔KOA軟骨缺損處，發(fā)現(xiàn)MSCs與纖維蛋白凝膠復(fù)合物能誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，并能修復(fù)損傷的關(guān)節(jié)軟骨。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)使用TGF-β1可增強(qiáng)基于纖維蛋白支架的MSCs體外分化軟骨。

3.4 β-磷酸三鈣支架

β-磷酸三鈣支架材料是新近發(fā)展的一種干細(xì)胞培養(yǎng)支架，其成分與正常人體中骨骼礦物質(zhì)組成類似，在體內(nèi)降解產(chǎn)物被組織吸收，不產(chǎn)生毒性。因此可作為一種MSCs支架材料置入關(guān)節(jié)腔內(nèi)。Sun、陳竹生等[25，26]大量研究均證實(shí)β-磷酸三鈣支架可促進(jìn)MSCs的增殖分化。

依據(jù)上述研究基礎(chǔ)，Chu[27]利用MSCs的粘附能力開發(fā)了一種新型的基于β-磷酸三鈣支架的骨髓MSCs快速富集系統(tǒng)。這套系統(tǒng)可以將干細(xì)胞的篩選，富集和重組與替代材料結(jié)合到一個(gè)操作過程中。這種新穎的系統(tǒng)不僅簡(jiǎn)化了基于MSCs的生物材料的制備過程，而且降低了治療成本。其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該系統(tǒng)下MSCs散布且均勻，不會(huì)影響細(xì)胞活力，展現(xiàn)了較為滿意的生物相容性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MSCs生物活性較強(qiáng)。

3.5 氧化石墨烯支架

石墨烯和氧化石墨烯（graphene oxide,GO）也是一類優(yōu)良的，無毒的干細(xì)胞培養(yǎng)材料，GO表面的氧官能團(tuán)不僅賦予GO親水性，而且還賦予了分散性和與聚合物的相容性。因此，GO可以分散在各種常用的有機(jī)溶劑中，形成穩(wěn)定的GO懸浮液，目前研究認(rèn)為GO懸浮液可以有效促進(jìn)MSCs的軟骨分化。由于大部分MSCs細(xì)胞支架粘附力較低且以水為介質(zhì)，當(dāng)注射于關(guān)節(jié)內(nèi)常流于關(guān)節(jié)最低點(diǎn)，而不是軟骨損傷部位。但GO作為有很強(qiáng)吸附性的碳家族成員很好的解決了這個(gè)問題。因此Choe[28]認(rèn)為氧化石墨烯膜是調(diào)節(jié)多種MSCs結(jié)構(gòu)和功能的有效培養(yǎng)平臺(tái)。

GO作為一種固體潤(rùn)滑劑還可改善關(guān)節(jié)內(nèi)潤(rùn)滑環(huán)境。臨床常見的液體潤(rùn)滑劑注射于關(guān)節(jié)內(nèi)具有較短的代謝周期。因此，在載荷條件下和長(zhǎng)期的代謝過程中，液體潤(rùn)滑劑不能有效地降低摩擦損傷。GO固體關(guān)節(jié)潤(rùn)滑劑在緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛方面可能具有顯著的優(yōu)勢(shì)，可降低關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)的內(nèi)阻尼[29]。這些特性使得GO在細(xì)胞支架的基礎(chǔ)上還可以作為關(guān)節(jié)固體潤(rùn)滑劑，既可促進(jìn)MSCs增殖分化的同時(shí)還可以改善關(guān)節(jié)內(nèi)潤(rùn)滑環(huán)境，這也是其他支架不具有的優(yōu)勢(shì)。

3.6 復(fù)合支架

3.6.1 聚乳酸-羥基乙酸（Poly-laectic-co-glycolicy acids,PLGA）支架

PLGA作為復(fù)合型支架的代表，由聚乙醇酸和聚乳酸共同組成。PLGA具有生物降解性，可以在活體中降解，免疫原性低，并且可以高效運(yùn)載細(xì)胞作用于靶組織，通過細(xì)胞駐留和細(xì)胞分化，最終在軟骨缺損區(qū)域形成軟骨，與周圍組織同化。

Toyokawa[30]將PLGA單獨(dú)置入兔骨軟骨缺損模型的受累關(guān)節(jié)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其可使軟骨缺損修復(fù)，該研究發(fā)現(xiàn)宿主關(guān)節(jié)內(nèi)自身的內(nèi)源性MSCs可以粘附在PLGA上，進(jìn)而可發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。該項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)尤為重要，目前臨床中使用MSCs治療KOA的重要的一步是制作自體或外源性MSCs，但該文獻(xiàn)的結(jié)果表示，使用PLGA作為MSCs的支架治療MSCs時(shí)即可省略上述步驟，PLGA可對(duì)自源性MSCs進(jìn)行調(diào)動(dòng)，粘附即可對(duì)軟骨進(jìn)行修復(fù)。

3.6.2 以明膠為基礎(chǔ)的復(fù)合支架

明膠是一種從膠原蛋白水解而得的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，雖然明膠不具有毒性，有較好的3D結(jié)構(gòu)和吸附性，但由于明膠易形變，不能承載過大外力，因此目前研究常使用明膠復(fù)合支架來運(yùn)載MSCs。Shi[31]使用絲素蛋白和明膠相組合設(shè)計(jì)了一種結(jié)構(gòu)和功能優(yōu)化的支架，極大平衡了機(jī)械性能和降解速率，以促進(jìn)MSCs形成軟骨，在研究中發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合支架不僅促進(jìn)了骨髓MSCs的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)，而且還為新軟骨形成提供了機(jī)械保護(hù)，起了一定的屏障作用。這對(duì)較為脆弱的新生透明軟骨意義重大。

Chen[32]采用3D打印技術(shù)制作了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與甲基丙烯酸明膠復(fù)合支架，這種支架針對(duì)于外泌體進(jìn)行運(yùn)輸，且有更好的靶向性。研究發(fā)現(xiàn)這種基于明膠的復(fù)合支架有效地恢復(fù)了軟骨細(xì)胞線粒體功能障礙，增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞遷移，并使滑膜巨噬細(xì)胞對(duì)M2表型的反應(yīng)極化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中3D打印支架可明顯促進(jìn)受損關(guān)節(jié)軟骨再生。

3.6.3 其他復(fù)合支架

由于單一支架相比于復(fù)合支架往往存在劣勢(shì)，因此目前干細(xì)胞修復(fù)軟骨的組織工程研究往往基于碳水化合物支架（瓊脂糖，藻酸鹽，殼聚糖/甲殼素和透明質(zhì)酸鹽）、蛋白質(zhì)的支架（膠原蛋白，纖維蛋白和明膠）以及人造聚合物（聚乙醇酸，聚乳酸，聚乙二醇和聚己內(nèi)酯）的組合。這種復(fù)合支架可以在結(jié)構(gòu)和功能上取長(zhǎng)補(bǔ)短，更好地促進(jìn)MSCs的增殖和軟骨分化。

4 小結(jié)

目前隨著對(duì)MSCs的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、臨床前及臨床實(shí)驗(yàn)的不斷深入，基于干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)在治療KOA疾病方面逐漸呈現(xiàn)出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。由于MSCs在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的修復(fù)作用仍然受到一些因素的限制，因此尋求一種適宜的干細(xì)胞培養(yǎng)支架意義十分重大，先前的研究利用組織工程技術(shù)將不同支架與MSCs進(jìn)行搭載實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)膠原、透明質(zhì)酸等單體支架，以及碳水化合物支架、蛋白質(zhì)的支架以及人造聚合物組成的復(fù)合支架可以顯著地促進(jìn)MSCs的增殖以及分化能力。雖然這些初步研究顯示了良好的搭載效果，但未來仍需進(jìn)一步優(yōu)化MSCs與載體的安全性和有效性。