基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用機(jī)制

王振龍 ，韓育英 ，張秀麗 ，李佳鳳 ，沈阿靈 *，彭 軍 *

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)老年病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.閩江師范高等專科學(xué)校，福建 福州 350122；4.福建省婦幼保健院，福建福州350001）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球新發(fā)病例數(shù)高達(dá)226 萬，病死率占所有惡性腫瘤的6.9%，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。研究表明乳腺癌致死的最主要原因就是發(fā)生耐藥及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］，可見，防治轉(zhuǎn)移性乳腺癌對(duì)提高患者預(yù)后和延長生存期有著重要意義，進(jìn)一步尋找能夠有效抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物迫在眉睫。

中醫(yī)藥因其具有多成分、多靶點(diǎn)和整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，可通過多靶點(diǎn)、多通路產(chǎn)生治療效果，在臨床腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要的作用，特別是從天然植物中尋找低毒性、高抗癌活性的化合物單體備受青睞［3］。黃芩苷是一種從傳統(tǒng)中藥黃芩中分離得到的活性黃酮類化合物，在抗腫瘤等方面有著諸多積極作用，對(duì)乳腺癌亦有抑制作用［4-7］，而對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的調(diào)控機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)層面的研究。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究黃芩苷、作用靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌之間的關(guān)系，探討黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 方 法

1.1 黃芩苷的成藥性檢驗(yàn) 以“Baicalin”作為檢索詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］獲得黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué)（AD?ME）等數(shù)據(jù)，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為黃芩苷的成藥性檢驗(yàn)依據(jù)［9］，獲取黃芩苷化合物的MOL2 文件，用于后續(xù)黃芩苷的作用靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 黃芩苷的作用靶點(diǎn)預(yù)測 將“1.1”獲取的黃芩苷的 MOL2 文件導(dǎo)入到Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）［10］，選擇最大生成的構(gòu)象（maximum generated conformations）為“1 000”，選擇目標(biāo)（select targets set）設(shè)定為人類蛋白質(zhì)，獲取黃芩苷的潛在作用靶點(diǎn)。然后，將獲得的潛在作用靶 點(diǎn)導(dǎo) 入 Uniplot 數(shù)據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org/）［11］轉(zhuǎn)化成統(tǒng)一的基因名，設(shè)置基因來源為人源性，從而獲得黃芩苷的作用靶點(diǎn)。

1.3 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)的獲取 以“Metastatic breast cancer”為檢索詞在Gene?Cards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）［12］檢索相關(guān)疾病靶點(diǎn)，以相關(guān)性得分（relevance score）≥中位數(shù)作為篩選條件獲得轉(zhuǎn)移性乳腺癌的的疾病靶點(diǎn)。利用 Venny 2.1.0 的在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）與黃芩苷的作用靶點(diǎn)相映射，得到黃芩苷與轉(zhuǎn)移性乳腺癌共同靶點(diǎn)，即是黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)。

1.4 共同靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）構(gòu)建與分析 將黃芩苷與轉(zhuǎn)移性乳腺癌共同靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）［13］“multi?ple proteins”檢索欄中，物種設(shè)置為“homo sapiens”，選擇置信度＞0.7，其余的參數(shù)保持為默認(rèn)設(shè)置，以獲取相互作用關(guān)系信息表。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為“tsv”格式文件，然后將文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，以“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Cen?trality”3 個(gè)指標(biāo)均大于中位數(shù)作為篩選條件，獲取具有拓?fù)渲匾缘陌悬c(diǎn)，定義為黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的核心靶點(diǎn)［14］。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DA?VID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）［15］進(jìn)行 GO 和KEGG 富集分析。以P＜0.01、錯(cuò)誤發(fā)生率（FDR）＜0.01 作為篩選依據(jù)，獲取黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的信號(hào)通路及生物學(xué)過程。并且依據(jù)富集基因數(shù)從多到少進(jìn)行排序，篩選出KEGG 富集分析結(jié)果中排名前10 的信號(hào)通路及GO 富集分析結(jié)果中排名前10 的生物學(xué)過程。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷的成藥性檢驗(yàn) 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得了黃芩苷（PubChem CID：64982）的藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）數(shù)據(jù)，如：黃芩苷的分子量（MW）＝446.39 da、口服生物利用度（OB）＝40.12%、類藥性（DL）＝0.75 等，由黃芩苷 MW＜500 da、DL＞0.18、OB＞30%表明黃芩苷與已知藥物相似，具有成藥性。

2.2 黃芩苷的作用靶點(diǎn) 利用Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入黃芩苷（Molecule ID：MOL002776）的MOL2文件獲取412 個(gè)黃芩苷的潛在作用靶點(diǎn)，使用Uniplot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化成統(tǒng)一的基因名，去除重復(fù)項(xiàng)，獲得399 個(gè)黃芩苷的作用靶點(diǎn)。

2.3 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn) 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫共收集獲得了轉(zhuǎn)移性乳腺癌的6 377 個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)，經(jīng)篩選獲得3 188 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將黃芩苷的作用靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的疾病靶點(diǎn)分別輸入Venny 2.1.0 在線工具分析，得到共同靶點(diǎn)（即是黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)）206 個(gè)，并用 Cytoscape 軟件作圖，見圖 1。

圖1 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將黃芩苷與轉(zhuǎn)移性乳腺癌共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中，獲得一個(gè)206 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 063 條邊的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖 2。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到：“Degree”中位數(shù)為 9、“Closeness Centrality”中位數(shù)為 0.373 966 942 148 76 和“Betweenness Cen?trality”中位數(shù)為 0.002 112 449 542 506 35，經(jīng)篩選獲得具有拓?fù)渲匾园悬c(diǎn)（即黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的核心靶點(diǎn)）62 個(gè)，包含絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3R1）、靶向調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0α 編碼基因（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、GTP 酶（HRAS）、表皮生長因子受體（EGFR）、促生長因子（IGF1）、雌激素受體α（ESR1）、酪氨酸蛋白激酶（JAK2）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）等，見圖3。

圖2 共同作用靶點(diǎn)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 富集分析 運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌相關(guān)的206 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析（P＜0.01），獲取209 個(gè)基因本體條目，其中生物過程（BP）相關(guān)條目134 個(gè)，主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、蛋白磷酸化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、MAPK 級(jí)聯(lián)、血管生成等方面；分子功能（MF）的相關(guān)條目51 個(gè)，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇激素受體活性、ATP 結(jié)合等方面；細(xì)胞成分（CC）的相關(guān)條目24 個(gè)，主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、胞外外泌體等方面。并根據(jù)富集基因數(shù)由多到少進(jìn)行排序，篩選出排名前10 名，使用GraphPad prism 制圖軟件制作可視化柱狀圖，見圖4。

圖4 共同靶點(diǎn)的GO 富集分析圖

2.6 KEGG 通路分析 運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌相關(guān)的206 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析（P＜0.01），獲得具有顯著性的信號(hào)通路88 條，并且依據(jù)富集基因數(shù)從多到少進(jìn)行排序，排名前10 名的信號(hào)通路，見表1。由表1 可知：這些共同靶點(diǎn)主要富集在癌癥的途徑、PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、Rap1 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等信號(hào)通路。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：黃芩苷可能通過調(diào)控癌癥的途徑、PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、Rap1 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等發(fā)揮對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療作用，其中多條均被證實(shí)參與乳腺癌的疾病進(jìn)展［16-17］。拓?fù)渲匾园悬c(diǎn)及信號(hào)通路主要通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、蛋白水解、基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡、增殖、遷移等過程實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的調(diào)控。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是惡性腫瘤最常見的異常調(diào)控通路之一，其功能失調(diào)性活化與乳腺癌臨床預(yù)后不良密切相關(guān)［16-17］。PI3K 是生長因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要組成部分，激活后的PI3K 可引起下游蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［18］。有研究表明：PI3K/Akt 信號(hào)通路磷酸化可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［19］，并主要與 Src、PI3K、Akt 蛋白的磷酸化水平密切相關(guān)［20］。Akt 亦屬 PI3K 的下游直接靶蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞增殖及代謝，促進(jìn)纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成［21］，可調(diào)節(jié)下游包括凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等多種生物過程［22］。AKT1 與 HSP90AA1作用密切相關(guān)，而HSP90AA1 可影響乳腺癌的生存期長短［23］。血漿的HSP90AA1 可抑制腫瘤細(xì)胞增值和轉(zhuǎn)移［24］，在乳腺癌組織中比正常組織的表達(dá)明顯增高，可用于預(yù)測乳腺癌的發(fā)生和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［25］。另外，Akt 還可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白來促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［26］，下調(diào)E-鈣黏蛋白及上調(diào)N-鈣黏蛋白，使其獲得了不同的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞骨架重構(gòu)，可能觸發(fā)多種細(xì)胞因子、生長因子，使細(xì)胞的游走能力大大提高，并增強(qiáng)了與周邊間質(zhì)組織的親和能力，腫瘤細(xì)胞進(jìn)而得以擴(kuò)散以及轉(zhuǎn)移。因此，本研究預(yù)測黃芩苷可作用于這些相互作用密切的靶點(diǎn)PI3K、AKT1、HSP90AA1、SRC，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等生物過程，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等細(xì)胞生理活動(dòng)，該通路的關(guān)鍵因子有 Ras、Raf、MEK 和 ERK 蛋白，與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前公認(rèn)的機(jī)制是一旦Ras-MAPK/ERK 信號(hào)通路活化異常，可導(dǎo)致自身突變激活，被上游信號(hào)持續(xù)激活，進(jìn)而激活下游的蛋白，造成血管形成、細(xì)胞增殖、凋亡抑制等，最終造成腫瘤的產(chǎn)生與進(jìn)展。MAPK 信號(hào)通路的上游是 Ras/Raf 蛋白，下游包括 p38、c-Jun N 端激酶（JNK）與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等，而在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)可檢測到ERK 的活性異常增高［27］。ERK屬于MAPK 亞家族成員，ERK 信號(hào)通路可下調(diào)抗凋亡蛋白B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），上調(diào)促凋亡因子、Bax 及p38，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到抑制癌癥的作用［7］。另外，MAPK-mTOR 信號(hào)通路中通過調(diào)節(jié)mTOR、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2 及p38等的表達(dá)，促進(jìn)微管相關(guān)蛋白LC3（LC3-Ⅱ）和自噬基因-1（Beclin-1）的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［28］。因此，本研究結(jié)果預(yù)示黃芩苷可能通過調(diào)控MAPK、Bcl-2 等核心作用靶點(diǎn)的表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，發(fā)揮治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用。

目前，轉(zhuǎn)移性乳腺癌病死率高且易復(fù)發(fā)，特別棘手的一種是三陰性乳腺癌，具體為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長因子受體2（HER2）陰性。其中，HER2 是 EGFR 成員之一，研究表明EGFR 具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，可調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路影響乳腺癌細(xì)胞的黏附與遷移［29］。EMT 是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的關(guān)鍵步驟［30］，TGF-β1 能夠誘導(dǎo) EMT，增強(qiáng)體外乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力［31］，TGF-β 誘導(dǎo)的 EMT 又可被抑制活化的p38 促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）所阻斷。有趣的是，本研究結(jié)果顯示黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌可能涉及的癌癥的途徑、MAPK 通路、癌癥中的蛋白多糖、FoxO 信號(hào)通路均有EGFR、TGF-β 的參與。由此可見，EGFR 與 Akt、MAPK、TGF-β 等靶點(diǎn)之間復(fù)雜交互作用，共同調(diào)控EMT，進(jìn)而影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：黃芩苷可能基于PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等核心信號(hào)通路，以及調(diào)控HSP90AA1、PIK3R1、Akt、SRC、MAPK、EGFR 和 TGF-β 等重要靶點(diǎn)之間復(fù)雜交互作用，從而發(fā)揮治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用，具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討或通過實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。