間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體在肺動(dòng)脈高壓治療中的應(yīng)用

陳垚鑫， 鄧芝花， 錢進(jìn)先

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension， PAH)是由多種已知或未知原因致肺血管重塑而引起的肺動(dòng)脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮完整性的喪失和細(xì)胞外基質(zhì)的積累，包括膠原蛋白沉積、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和肥大，導(dǎo)致動(dòng)脈中層肥厚、向心或偏心性內(nèi)膜增生和血管肌肉化，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈進(jìn)行性閉塞、肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高，甚至發(fā)展為右心室功能障礙[1-2]。目前臨床治療藥物(包括前列環(huán)素、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶5抑制劑等)主要是通過(guò)選擇性舒張肺動(dòng)脈，降低肺動(dòng)脈壓力，從而改善其臨床癥狀，但是在改善肺血管重塑方面的作用有限，PAH患者一年病死率仍高達(dá)15%。一些研究[3]已經(jīng)證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一種不斷自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潛能的細(xì)胞，能夠有效地降低PAH中的肺動(dòng)脈壓力，改善右心功能。然而，MSCs不穩(wěn)定且定向分化能力較差，因此推測(cè)其主要通過(guò)旁分泌方式分泌生物因子發(fā)揮治療作用。外泌體則是MSCs與靶細(xì)胞間通訊交流的一種介質(zhì)。本文就MSCs源性外泌體的生物學(xué)特征，以及其在PAH中的作用及其潛在作用機(jī)制作一綜述。

1 MSCs與外泌體

1.1MSCs的作用 MSCs是一種能不斷自我更新、分裂增殖，且具有多向分化潛能的細(xì)胞。一方面，其干細(xì)胞的特性賦予其多種生物功能，如分化為各譜系細(xì)胞進(jìn)而修復(fù)組織損傷、促進(jìn)組織再生，調(diào)節(jié)炎癥及免疫系統(tǒng)等[1]；另一方面，MSCs是最容易獲取的干細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪組織及臍帶血等多種途徑提取，因此，MSCs在各種疾病研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[4-5]。然而，MSCs不穩(wěn)定，直接使用干細(xì)胞有潛在的免疫排斥或染色體變異及致瘤等可能[6]，且其定向至受損組織發(fā)揮作用的方式容易受多種環(huán)境的因素影響，作用效率不高，有很大的局限性。經(jīng)過(guò)大量研究[5]證實(shí)，MSCs培養(yǎng)上清或其成分可以介導(dǎo)MSCs的一些生物功能，它主要以旁分泌方式分泌生物因子去發(fā)揮作用的。

1.2外泌體的生物學(xué)特征

外泌體(Exosome， Exo)在20世紀(jì)80年代首次被發(fā)現(xiàn)，被定義為由脂質(zhì)雙分子層組成的具有“碟狀”形態(tài)的微小小泡，屬于細(xì)胞外囊泡的一種。細(xì)胞外囊泡是由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，根據(jù)囊泡的大小和形成方式，分為外泌體(30～150 nm)及微囊泡(50～1000 nm)、微?；虻蛲鲂◇w(50～5000 nm)[7]。它們功能相似，在形成過(guò)程中攜帶母體細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等分子，在細(xì)胞間的信息交流過(guò)程中起到了重要作用。不同的是微囊泡等是細(xì)胞質(zhì)膜受刺激后直接脫落而成，而外泌體的形成是細(xì)胞膜內(nèi)部出芽，逐漸形成多囊泡(MVB)和腔內(nèi)囊泡(ILV)后通過(guò)胞吐作用釋放的。外泌體幾乎可以由所有細(xì)胞類型釋放，并可存在于血液、尿液和母乳等體液中[5,7]。

外泌體最初被認(rèn)為是清除機(jī)體代謝廢物的“垃圾車”，通過(guò)不斷的探索，目前更多觀點(diǎn)[7]認(rèn)為，其是細(xì)胞間信息交流的關(guān)鍵，在此過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。主要有以下幾方面的原因：第一，外泌體形成方式使其具有低免疫原性及可運(yùn)輸性等，這些特性使得外泌體成為良好的細(xì)胞間信息交流的介質(zhì)；第二，外泌體作用方式廣泛，可以通過(guò)受體配體相結(jié)合，以及與受體細(xì)胞胞膜直接結(jié)合或相互融合的方式，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞，從而起到傳遞生物信息的作用[5, 7-8]；第三，不同來(lái)源的外泌體可以攜帶其來(lái)源的生物信息分子參與不同的生理或病理過(guò)程，還可以直接影響受體細(xì)胞的基因表達(dá)及細(xì)胞表型，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)功能，發(fā)揮相應(yīng)作用[7, 9]。

2 MSCs、外泌體對(duì)PAH的治療作用及機(jī)制

MSCs功能機(jī)制及外泌體的應(yīng)用均是當(dāng)前各種疾病的研究熱點(diǎn)。MSCs來(lái)源的外泌體(MSCs-Exo)具有MSCs相似的生物功能，它們?cè)诟鞣N疾病模型中被廣泛研究。Jason等[1]通過(guò)建立野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓小鼠模型證明，胞外囊泡發(fā)揮治療作用主要是通過(guò)外泌體實(shí)現(xiàn)的，靜脈注射MSCs-Exo可以抑制低氧誘導(dǎo)的PAH的血管重建，但是給予去除外泌體的MSCs培養(yǎng)上清和成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體并沒(méi)有此作用[10]。許多研究[11]表明，MSCs-Exo對(duì)改善PAH是有作用的，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：改善心肺血流動(dòng)力學(xué)、改善血管重塑、減緩右心室肥厚及右心衰竭的程度等。這幾個(gè)方面的作用并不是獨(dú)立體現(xiàn)的，這其中的關(guān)鍵點(diǎn)是改善肺血管的重塑，緩解肺動(dòng)脈壓力的升高，從而改善右心病理改變及相應(yīng)的臨床癥狀。

2.1MSCs-Exo抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的異常增殖

PASMC的異常過(guò)度增殖是PAH肺血管重建病理過(guò)程中的關(guān)鍵，已有研究表明，MSCs-Exo可通過(guò)抑制該過(guò)程發(fā)揮治療作用。

一方面，外泌體可作為細(xì)胞間物質(zhì)傳遞載體直接影響受體細(xì)胞基因表達(dá)，因此，MSCs-Exo調(diào)控PASMC增殖過(guò)程中的基因表達(dá)是常見的作用機(jī)制。Zhang等[11]研究表明，人臍帶血MSCs來(lái)源的外泌體可通過(guò)Wnt非典型信號(hào)通路下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表達(dá)，干擾細(xì)胞增殖周期，從而抑制PASMC的過(guò)度增殖。另一方面，有研究[12-13]表明，PASMC在受到環(huán)境等刺激時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，這可能是導(dǎo)致肺血管重塑的原因之一。相應(yīng)的研究[11]表明，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)信號(hào)通路可能誘發(fā)PASMC的增殖表型，給予MSCs-Exo可觀察到PASMC的增殖受到抑制，同樣也觀察到了GSK3β的表達(dá)下降。因此，MSCs-Exo可以通過(guò)調(diào)節(jié)PASMC表型轉(zhuǎn)換，從而在改善血管重建方面發(fā)揮部分作用。

2.2MSCs-Exo抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)凋亡、遷移

越來(lái)越多的證據(jù)表明，PAEC的功能失調(diào)是PAH發(fā)生、發(fā)展的又一重要事件，血管內(nèi)皮的完整性是血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的關(guān)鍵，在缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激等刺激下，PAEC損傷凋亡的影響是多方面的(包括肺血管張力、炎癥、凝血、代謝和重構(gòu))。同時(shí)，PAEC釋放的旁分泌因子也可能調(diào)節(jié)PASMC的存活、增殖及其功能表型，導(dǎo)致PASMC不受控制的增殖，并最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)[14]，還有研究[15]表明，PAEC釋放的外泌體可作為載體將翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein， TCTP)從內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到PASMC，從而促進(jìn)PASMC的增殖和凋亡抵抗。另外，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)是一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞逐漸將其內(nèi)皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞表型的生物學(xué)過(guò)程，在此過(guò)程中，細(xì)胞間黏附相關(guān)蛋白及表型丟失，并且獲得遷移能力，向組織內(nèi)部遷移導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚，血管閉塞[16]。

研究[11]表明，MSCs-exo對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PAEC損傷具有保護(hù)作用：一方面，MSCs-exo對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PAEC凋亡和EndoMT具有抑制作用，細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因上調(diào)，促凋亡基因受到抑制，抑制PAEC的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率；另一方面，MSCs-exo提高了PAEC血管生成能力、促進(jìn)細(xì)胞黏附和收縮，均有利于肺動(dòng)脈血管重塑的改善。

2.3MSCs-exo調(diào)控細(xì)胞的炎癥激活途徑

炎癥反應(yīng)的激活可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、PASWC的增殖及免疫炎性細(xì)胞的聚集，引起肺血管重構(gòu)和PAH的形成。多項(xiàng)研究表明，外泌體可以通過(guò)抑制炎癥激活途徑，減輕肺部炎癥反應(yīng)，緩解肺血管重塑。

在野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型中，MSCs源性外泌體使抗炎、抗增殖的miRNA表達(dá)明顯增加(如miR-34a、miR-122、miR-124和miR-127)，從而降低了右心肥厚指數(shù)[1]。研究[10]表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在低氧性PAH小鼠中，它與肺血管細(xì)胞的炎性水平及高增殖表型等相關(guān)。MSCs-exo可通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路，降低了白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(chemoattractant protein-1, MCP-1)等促炎性因子水平，抑制炎癥及缺氧相關(guān)信號(hào)通路的激活，從而改善PAH。James等[4]從免疫調(diào)節(jié)角度證明了血管重塑的改善與減少巨噬細(xì)胞招募到肺組織、減少巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、巨噬細(xì)胞的經(jīng)典炎癥激活途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱丝寡准せ钔緩接嘘P(guān)。這些研究[2]表明，MSCs源性外泌體對(duì)PAH炎癥激活途徑具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，可能是治療PAH的一種有效的新療法。

2.4MSCs-Exo調(diào)控細(xì)胞的代謝途徑

代謝紊亂是PAH的重要特征之一，PAH能使右心室及肺血管的病理改變過(guò)程中所涉及很多代謝相關(guān)生物分子水平改變[17-18]。Weiling等[19]總結(jié)了與PAH病理變化相關(guān)的7種主要代謝途徑(包括葡萄糖和脂肪酸氧化、谷氨酰胺分解、精氨酸代謝、一碳代謝、氧化還原反應(yīng)、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈。同時(shí)也表明，線粒體是生物合成途徑和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中介導(dǎo)代謝途徑的主要細(xì)胞器。缺氧可引起線粒體功能障礙，一方面線粒體功能障礙后繼發(fā)胰島素抵抗和葡萄糖不耐受，具體表現(xiàn)為糖酵解的增加、葡萄糖氧化磷酸化的減少，為PAH過(guò)程中異常增殖的細(xì)胞持續(xù)提供能量和生物分子原料，在PAH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的作用，這種代謝方式被稱作有氧糖酵解，亦稱作“華寶效應(yīng)”[20-21]。另一方面，線粒體參與的穩(wěn)態(tài)氧感應(yīng)系統(tǒng)(homeostatic oxygensensing system, HOSS)是體內(nèi)感知生理范圍內(nèi)氣道氧水平和動(dòng)脈氧分壓微小變化的特殊組織構(gòu)成的，當(dāng)環(huán)境氧水平或體內(nèi)氧分壓水平有變化時(shí)，線粒體內(nèi)的傳感器改變活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，ROS被線粒體超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)局部快速轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫從線粒體擴(kuò)散到細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)離子通道和酶，激活缺氧誘導(dǎo)因子1α，從而擾亂線粒體代謝和動(dòng)力學(xué)，加速細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[22]。研究表明，MSCs-Exo可以改善PAH缺氧暴露后的葡萄糖代謝轉(zhuǎn)變和線粒體功能。MSCs-Exo可以增加丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)和谷氨酸脫氫酶1(glutamate dehydrogenase 1, GLUD1)的表達(dá)，GLUD1將谷氨酸轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)代謝物α-酮戊二酸、PDH將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，均將糖酵解連接到TCA循環(huán)中，提高氧化磷酸化水平，改善線粒體功能，從而降低了細(xì)胞凋亡和壞死[23]。

PAH的病理變化主要有肺血管的重塑、炎性途徑的激活及血管的閉塞等，表現(xiàn)為肺血管細(xì)胞的過(guò)度增殖和凋亡、膠原蛋白的沉積等[2, 10]。目前對(duì)PAH的治療方法有限，大量研究已表明，MSCs來(lái)源的外泌體可以預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)PAH的進(jìn)展，從而為PAH治療提供了一種新的選擇。但是，MSCs源性外泌體在PAH治療中仍存在一些不足，一方面，MSCs來(lái)源的外泌體包含的物質(zhì)種類頗多(包括蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子)，參與調(diào)節(jié)PAH的關(guān)鍵性分子及通路機(jī)制尚不明確；另一方面，適用于臨床治療的靶點(diǎn)及療效評(píng)估的標(biāo)志物尚不清楚。因此，這也是未來(lái)需要進(jìn)一步探索的方向。