• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    癌-睪丸抗原NY-SAR-35在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義

    2022-11-14 23:32:06王燕靖趙英倫陸紹龍葉小龍張煜萱謝小薰張慶梅
    關(guān)鍵詞:免疫治療抗原陰性

    王燕靖,沈 寧,羅 彬,趙英倫,陸紹龍,葉小龍,張 沅,張煜萱,謝小薰,張慶梅

    結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤,位居腫瘤死亡的第四位。CRC患者早期癥狀隱匿,大部分患者首診時(shí)已屬晚期。雖然近年手術(shù)切除輔以放化療等傳統(tǒng)治療方式取得了較大進(jìn)展,但晚期CRC患者的預(yù)后情況并未得到顯著改善。新的輔助治療策略仍是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn),免疫治療則是其中一種具有臨床應(yīng)用前景的新型治療方法,但開(kāi)展腫瘤免疫治療需要鑒定腫瘤特異性抗原。癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)在多種腫瘤中高表達(dá),而在除睪丸和胎盤(pán)之外的正常組織限制性表達(dá),被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的理想靶抗原。NY-SAR-35是CTA家族中的一員。有文獻(xiàn)報(bào)道NY-SAR-35 mRNA在CRC組織不表達(dá),但該研究?jī)H檢測(cè)了9例CRC組織,且缺少癌旁組織及臨床意義分析,其結(jié)果難以客觀地反映NY-SAR-35在CRC的表達(dá)情況。鑒此,本研究擴(kuò)大CRC樣本例數(shù),并收集匹配的癌旁組織及患者臨床資料,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)NY-SAR-35 mRNA的表達(dá),并分析其臨床意義,以初步評(píng)估其在預(yù)測(cè)CRC患者預(yù)后和作為免疫治療靶抗原的應(yīng)用前景。

    1 對(duì)象與方法

    1

    .

    1

    研究對(duì)象 選擇2009年10月至2012年5月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科接受手術(shù)治療的CRC患者59例。其中男42例,女17例;年齡30~86(55.55±14.36)歲;根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ~Ⅱ期38例,Ⅲ~Ⅳ期21例。均經(jīng)手術(shù)取癌組織及配對(duì)的癌旁組織。研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):審20210157號(hào)),標(biāo)本獲取前均經(jīng)患者及其家屬同意。

    1

    .

    2

    納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為CRC;(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院前已接受其他抗腫瘤方案治療;(2)合并其他嚴(yán)重自身免疫性疾?。?3)伴發(fā)其他惡性腫瘤。

    1

    .

    3

    資料收集 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者的臨床資料,包括性別、年齡等一般人口學(xué)信息,以及腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)類型、轉(zhuǎn)移情況等疾病情況信息。

    1

    .

    4

    標(biāo)本采集 腹腔鏡手術(shù)中切取CRC患者腫瘤組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣>1.5 cm)各59例,其中結(jié)腸部位25例,直腸部位34例。CRC組織標(biāo)本均經(jīng)2名以上有經(jīng)驗(yàn)的主任病理醫(yī)師檢查確診。組織離體后15 min內(nèi),置液氮速凍,后轉(zhuǎn)置-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。

    1

    .

    5

    NY-SAR-35 mRNA檢測(cè)方法

    1.5.1 總RNA提取 取約300 mg組織標(biāo)本,迅速加入裂解液后進(jìn)行勻漿,應(yīng)用RNA抽提試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司)提取組織總RNA,操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所得總RNA溶于無(wú)RNA酶的純水中,用微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度,并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)無(wú)降解。

    1.5.2 cDNA合成 取1 μg總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit,諾唯贊生物科技股份有限公司)說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)PCR擴(kuò)增管家基因P53檢測(cè)cDNA的質(zhì)量,將合格的cDNA用于目的基因擴(kuò)增。P53引物序列:5′-CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG-3′(上游),5′-CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG-3′(下游),由上海吉瑪公司合成。

    1.5.3 目的基因擴(kuò)增 應(yīng)用2×Rapid Taq Master Mix試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系:PCR Master Mix(2×Premix)12.5 μl,ddHO 9.5 μl,上、下游引物各1.0 μl,cDNA 1 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃充分延伸10 min。NY-SAR-35引物序列:5′-CTTGGTGCGATCAGCCTTAT-3′(上游),5′-TTGATGCATGAAAACAGAACTC-3′(下游)。以睪丸cDNA作為陽(yáng)性對(duì)照,以DEPC處理水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照。RT-PCR反應(yīng)完畢取產(chǎn)物10 μl行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以P53為內(nèi)參,保證各標(biāo)本內(nèi)參條帶亮度一致的前提下,目的基因擴(kuò)增條帶清晰可見(jiàn)即為陽(yáng)性表達(dá)。將已純化PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

    1

    .

    6

    隨訪 通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)記錄和電話隨訪方式收集患者隨訪資料。在術(shù)后2年內(nèi),每3個(gè)月隨訪1次;術(shù)后3~4年每6個(gè)月隨訪1次;手術(shù)5年后每年隨訪1次。本次研究隨訪時(shí)間截至2020年5月,以發(fā)生死亡為結(jié)局。

    1

    .

    7

    統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用成組

    t

    檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[

    n

    (%)]表示,CRC組與癌旁組織組間比較采用McNemar′s檢驗(yàn),NY-SAR-35陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組間比較采用

    χ

    檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,以log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。采用Cox回歸分析影響CRC患者生存預(yù)后的因素。

    P

    <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2

    .

    1

    NY-SAR-35 mRNA電泳和測(cè)序結(jié)果 經(jīng)電泳后,在300~400 bp之間出現(xiàn)一條清晰的條帶,與NY-SAR-35 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小(376 bp)一致。見(jiàn)圖1。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因庫(kù)檢索序列進(jìn)行BLAST比對(duì),證實(shí)所擴(kuò)增的產(chǎn)物為NY-SAR-35目的片段。見(jiàn)圖2。

    M:DNA marker;T1~T7:CRC組織;N1~N7:癌旁組織;P:陽(yáng)性對(duì)照;Ne:陰性對(duì)照

    圖1 NY-SAR-35 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

    圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物BLAST比對(duì)結(jié)果圖

    2

    .

    2

    CRC組織和癌旁組織NY-SAR-35 mRNA表達(dá)情況比較 CRC組織中NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)21例(35.59%),癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)8例(13.56%),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 CRC組織和癌旁組織NY-SAR-35 mRNA表達(dá)情況比較()

    CRC組織癌旁組織陽(yáng)性陰性總數(shù)陽(yáng)性12021陰性73138總數(shù)85159

    注:經(jīng)McNemar′s檢驗(yàn),=0.019

    2

    .

    3

    NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性組與陰性組臨床特征比較 NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm的人數(shù)比例大于陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05)。兩組在性別、年齡、腫瘤位置、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)水平、T分期、N分期、M分期、TNM分期、組織學(xué)類型和分化程度方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    >0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性組與陰性組臨床特征比較[(%)]

    組 別例數(shù)性別年齡(歲)腫瘤直徑(cm)腫瘤位置CEA(ng/ml)T分期男女<56≥56<5≥5結(jié)腸直腸≤5>5T1~2T3~4陽(yáng)性組2116(76.19)5(23.81)12(57.14)9(42.86)6(28.57)15(71.43)12(57.14)9(42.86)8(38.10)13(61.90)3(14.29)18(85.71)陰性組3826(68.42)12(31.58)20(52.63)18(47.37)24(63.16)14(36.84)13(34.21)25(65.79)22(57.89)16(42.11)11(28.95)27(71.05)χ2-0.3980.1116.4742.9132.1221.606P-0.5280.7390.0110.0880.1450.205組 別例數(shù)N分期M分期TNM分期組織學(xué)類型分化程度N0N1~3M0M1Ⅰ~ⅡⅢ~Ⅳ管狀及乳頭狀腺癌黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌高分化中分化低分化陽(yáng)性組2117(80.95)4(19.05)18(85.71)3(14.29)15(71.43)6(28.57)21(100.00)0(0.00) 7(33.33)10(47.62)4(19.05)陰性組3826(68.42)12(31.58)35(92.11)3(7.89) 23(60.53)15(39.47)32(84.21) 6(15.79)9(23.68)18(47.37)11(28.95)χ2-1.0750.6050.7013.6910.986P-0.3000.4370.4020.0550.611

    2

    .

    4

    NY-SAR-35 mRNA表達(dá)情況與CRC患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 研究對(duì)象獲得隨訪1~98個(gè)月,隨訪過(guò)程中無(wú)失訪患者,中位隨訪時(shí)間為54個(gè)月。截至隨訪終點(diǎn),死亡36例,生存23例。CRC患者中NY-SAR-35 mRNA陰性組的生存預(yù)后優(yōu)于陽(yáng)性組(生存期:57.24個(gè)月 vs 40.71個(gè)月;log-rank檢驗(yàn):

    χ

    =4.356,

    P

    =0.037)。見(jiàn)圖3?。進(jìn)一步分層分析結(jié)果顯示,無(wú)論對(duì)于TNM分期分為Ⅰ~Ⅱ期或Ⅲ~Ⅳ期的CRC患者,NY-SAR-35 mRNA陰性組的生存預(yù)后均優(yōu)于陽(yáng)性組(Ⅰ~Ⅱ期CRC患者生存期:77.32個(gè)月 vs 53.80個(gè)月;log-rank檢驗(yàn):

    χ

    =8.830,

    P

    =0.003。Ⅲ~Ⅳ期CRC患者生存期:28.60個(gè)月 vs 8.00個(gè)月;log-rank檢驗(yàn):

    χ

    =8.013,

    P

    =0.005)。見(jiàn)圖3??。

    ?NY-SAR-35 mRNA陰性組 vs 陽(yáng)性組;?Ⅰ~Ⅱ期分層下NY-SAR-35 mRNA陰性組 vs 陽(yáng)性組;?Ⅲ~Ⅳ期分層下NY-SAR-35 mRNA陰性組 vs 陽(yáng)性組

    圖3 CRC患者的生存曲線圖

    2

    .

    5

    影響CRC患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果以至隨訪結(jié)束之日發(fā)生死亡為結(jié)局進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示,T分期為T(mén)期、N分期為N期、M分期為M期以及NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)是影響CRC患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

    P

    <0.05)。見(jiàn)表3。

    表3 影響CRC患者生存預(yù)后的Cox回歸分析結(jié)果

    變 量HR(95%CI)PaHR(95%CI)aP性別(男)1.046(0.504~2.171)0.903--年齡(≥56歲)1.041(0.541~2.005)0.902--腫瘤位置(直腸)1.402(0.717~2.743)0.316--腫瘤大小(≥5 cm)1.442(0.743~2.801)0.272--CEA(>5 ng/ ml)1.863(0.964~3.603)0.058--T分期(T3~4)3.312(1.167~9.399)0.01615.664(3.579~68.550)0.000N分期(N1~3)4.059(2.016~8.170)0.00040.102(11.075~145.203)0.000M分期(M1)9.785(7.238~122.563)0.000187.338(31.321~1121.000)0.000TNM分期(Ⅲ~Ⅳ)7.009(3.501~14.032)0.0002.492(0.125~49.579)0.710組織學(xué)類型(黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌)1.252(0.443~3.543)0.668--分化程度(中分化)1.102(0.374~3.252)0.860分化程度(低分化)1.066(0.280~4.061)0.925--NY-SAR-35 mR-NA表達(dá)(陽(yáng)性)1.972(1.023~3.803)0.0302.813(1.300~6.086)0.009

    3 討論

    3

    .

    1

    近年來(lái),腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第4種腫瘤治療方式,其優(yōu)勢(shì)在于可特異性靶向腫瘤,對(duì)正常細(xì)胞傷害小。開(kāi)展腫瘤免疫治療的先決條件是鑒定腫瘤特異性抗原。CTA是一類在除睪丸和胎盤(pán)之外的正常組織中不表達(dá),而在多種腫瘤中廣泛表達(dá),且可引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的腫瘤抗原。因其獨(dú)特的表達(dá)模式,CTA被認(rèn)為是理想的腫瘤標(biāo)志物和免疫治療靶點(diǎn)。目前已有一些CTA(如MAGE-A3、NY-ES0-1等)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,在一些腫瘤的治療中初步顯示出不錯(cuò)的療效。然而,現(xiàn)有研究顯示,多數(shù)CTA在CRC中的表達(dá)率并不高,這極大地限制了CTA在CRC免疫治療中的應(yīng)用。

    3

    .

    2

    NY-SAR-35是2003年由Lee等通過(guò)血清學(xué)表達(dá)克隆分析(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)在纖維肉瘤及惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者中鑒定出的一種CTA基因,根據(jù)其在CTA數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)又稱為CT37。與CTA家族的許多成員一樣,NY-SAR-35基因定位于X染色體。有研究報(bào)道,NY-SAR-35 mRNA在除睪丸之外的多種正常組織幾乎不表達(dá),但在多種腫瘤中表達(dá)并具有不同的表達(dá)率:肺癌為33%,黑色素瘤為6.3%,卵巢癌為8.3%,乳腺癌為23.1%,膀胱癌為41.7%。研究發(fā)現(xiàn)NY-SAR-35 mRNA在腫瘤的表達(dá)可能與其基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化有關(guān)。另外,實(shí)驗(yàn)研究還顯示,NY-SAR-35還可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。提示NY-SAR-35可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,具有成為腫瘤標(biāo)志物和免疫治療靶點(diǎn)的潛力。

    3

    .

    3

    本研究結(jié)果顯示,CRC組織NY-SAR-35 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為35.59%,顯著高于癌旁組織(13.56%),這與Lee等的研究結(jié)果差異較大,考慮與研究納入樣本的例數(shù)差異及腫瘤的異質(zhì)性表達(dá)有關(guān)。本研究中有2例NY-SAR-35 mRNA 陽(yáng)性表達(dá)的CRC組織,其癌旁組織也陽(yáng)性表達(dá)NY-SAR-35 mRNA,這可能與癌旁組織的癌前病變或腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)癌旁組織有關(guān)。癌旁組織并非真正意義上的正常組織,曾有研究者檢測(cè)距離CRC組織20 mm、21~50 mm和50 mm以上的范圍內(nèi)收集的癌旁組織,發(fā)現(xiàn)離CRC組織距離越遠(yuǎn)的癌旁組織,其癌相關(guān)基因MAGE mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率越低。由此可見(jiàn),在收集癌旁組織時(shí)需特別注意距離癌組織的位置和范圍。此外,本研究有7例NY-SAR-35 mRNA陰性表達(dá)的CRC組織,其癌旁組織卻為NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá),這可能與CTA的異質(zhì)性表達(dá)或腫瘤抗原調(diào)變有關(guān)。

    3

    .

    4

    本研究結(jié)果顯示,NY-SAR-35 mRNA表達(dá)與腫瘤直徑具有顯著關(guān)聯(lián)性,與體積小的腫瘤組織相比,體積大的腫瘤組織NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率更高。腫瘤大小在一定程度上可反映腫瘤細(xì)胞的增殖程度,這提示NY-SAR-35可能與腫瘤的惡性生長(zhǎng)有關(guān)。另外,生存分析結(jié)果顯示,CRC患者中NY-SAR-35 mRNA陰性組的生存預(yù)后優(yōu)于陽(yáng)性組,且Cox回歸分析結(jié)果顯示,NY-SAR-35 mRNA陽(yáng)性表達(dá)是影響CRC患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些結(jié)果再次證明NY-SAR-35在CRC的致病機(jī)制中可能發(fā)揮的重要作用,且具有作為預(yù)測(cè)CRC患者預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

    綜上所述,NY-SAR-35 mRNA在CRC組織中高表達(dá),其與腫瘤大小及患者的生存預(yù)后具有關(guān)聯(lián)性,具有作為免疫治療潛在靶點(diǎn)的價(jià)值,但其在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

    猜你喜歡
    免疫治療抗原陰性
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點(diǎn)
    鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征
    三陰性乳腺癌的臨床研究進(jìn)展
    腎癌生物免疫治療進(jìn)展
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達(dá)及純化
    結(jié)核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細(xì)胞抗原表位的多態(tài)性研究
    hrHPV陽(yáng)性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    黃癸素對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用
    鹽酸克倫特羅人工抗原的制備與鑒定
    在线永久观看黄色视频| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 麻豆国产av国片精品| 1024视频免费在线观看| 大陆偷拍与自拍| 日韩欧美一区视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色播在线永久视频| 黄色a级毛片大全视频| 精品日产1卡2卡| 国产精品秋霞免费鲁丝片| www日本在线高清视频| 午夜日韩欧美国产| 欧美一级a爱片免费观看看 | 最好的美女福利视频网| 免费在线观看影片大全网站| av免费在线观看网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美久久黑人一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产单亲对白刺激| 三级毛片av免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线视频色国产色| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 曰老女人黄片| 欧美性长视频在线观看| 99国产精品99久久久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 婷婷丁香在线五月| 操美女的视频在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲成av人片免费观看| 久久精品成人免费网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产欧美日韩一区二区三| 久久亚洲精品不卡| 国产xxxxx性猛交| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩免费av在线播放| 久久久久久人人人人人| 在线观看免费视频日本深夜| 国语自产精品视频在线第100页| www日本在线高清视频| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲一区中文字幕在线| 99国产精品一区二区三区| 搞女人的毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 波多野结衣巨乳人妻| 窝窝影院91人妻| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久 成人 亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一级毛片精品| 丁香六月欧美| 亚洲av成人一区二区三| 一级毛片高清免费大全| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产成人免费无遮挡视频| 制服人妻中文乱码| 正在播放国产对白刺激| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产在线精品亚洲第一网站| xxx96com| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久热在线av| 制服人妻中文乱码| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日日夜夜操网爽| 热re99久久国产66热| 成人精品一区二区免费| 99国产精品99久久久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久热在线av| 一级毛片精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲国产欧美网| 韩国av一区二区三区四区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 超碰成人久久| 欧美精品亚洲一区二区| 一级a爱视频在线免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 麻豆成人av在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲av第一区精品v没综合| 淫秽高清视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 大型av网站在线播放| 免费看十八禁软件| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 精品无人区乱码1区二区| 中出人妻视频一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 一级毛片女人18水好多| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩免费av在线播放| 精品人妻1区二区| 成人三级黄色视频| av在线播放免费不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久久国产a免费观看| av在线天堂中文字幕| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 美女大奶头视频| 国产高清激情床上av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 不卡一级毛片| 色老头精品视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 九色亚洲精品在线播放| av免费在线观看网站| 在线观看www视频免费| 一区二区三区高清视频在线| 此物有八面人人有两片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线永久观看黄色视频| 国产午夜精品久久久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一级,二级,三级黄色视频| 久久九九热精品免费| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美中文综合在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 精品福利观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 悠悠久久av| 久久久久久人人人人人| 无遮挡黄片免费观看| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 露出奶头的视频| av视频在线观看入口| 美女免费视频网站| 亚洲av成人av| 久久中文字幕人妻熟女| 免费搜索国产男女视频| 制服诱惑二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一级毛片精品| 日韩精品中文字幕看吧| 妹子高潮喷水视频| 亚洲美女黄片视频| 18禁国产床啪视频网站| 日韩视频一区二区在线观看| 一级片免费观看大全| 操出白浆在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩大码丰满熟妇| 成人国语在线视频| 久久久久久久久免费视频了| 黑人操中国人逼视频| 国产视频一区二区在线看| 成人国产一区最新在线观看| 久久狼人影院| 国产成年人精品一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日韩高清综合在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产成人av激情在线播放| 不卡av一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产又爽黄色视频| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜精品久久久久久毛片777| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产乱人伦免费视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产免费男女视频| 激情视频va一区二区三区| 免费看a级黄色片| 在线永久观看黄色视频| 久久中文字幕一级| 欧美乱妇无乱码| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看 | 一夜夜www| 国产色视频综合| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜日韩欧美国产| 日本黄色视频三级网站网址| 在线观看一区二区三区| 久久久久久大精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 一级作爱视频免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品国产国语对白av| 国产午夜福利久久久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 成人欧美大片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品一品国产午夜福利视频| 成人免费观看视频高清| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲av电影不卡..在线观看| 看黄色毛片网站| 久热爱精品视频在线9| 国产xxxxx性猛交| 黄色视频不卡| 亚洲成av人片免费观看| 精品久久久久久成人av| 在线国产一区二区在线| 在线观看免费视频日本深夜| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久久久大精品| 婷婷丁香在线五月| 成人精品一区二区免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| av视频免费观看在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 香蕉国产在线看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产亚洲精品一区二区www| 精品电影一区二区在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 午夜福利,免费看| 日韩高清综合在线| 精品久久久久久成人av| 欧美乱色亚洲激情| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 88av欧美| 一级,二级,三级黄色视频| 精品久久蜜臀av无| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人av一区二区三区在线看| 99在线人妻在线中文字幕| 久久九九热精品免费| 成人18禁在线播放| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久香蕉国产精品| 久9热在线精品视频| 午夜免费鲁丝| 国产视频一区二区在线看| 精品国产一区二区三区四区第35| 91av网站免费观看| 国产麻豆69| 国内精品久久久久精免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲第一av免费看| 亚洲av第一区精品v没综合| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产成人免费无遮挡视频| 999精品在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产色视频综合| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日韩精品网址| 一区福利在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲成国产人片在线观看| 在线观看舔阴道视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲人成电影观看| www.精华液| 成人国产综合亚洲| 一a级毛片在线观看| 日韩av在线大香蕉| 精品日产1卡2卡| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产在线观看jvid| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美一级毛片孕妇| 国产免费男女视频| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 性少妇av在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 一本大道久久a久久精品| 亚洲伊人色综图| 久久久久久久午夜电影| www.www免费av| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲五月色婷婷综合| 国产精品电影一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 麻豆国产av国片精品| 丁香六月欧美| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久国产精品人妻蜜桃| 一二三四在线观看免费中文在| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产高清有码在线观看视频 | 一本综合久久免费| 欧美av亚洲av综合av国产av| av视频在线观看入口| 校园春色视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 中出人妻视频一区二区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 51午夜福利影视在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 色老头精品视频在线观看| 久热这里只有精品99| 亚洲精品久久国产高清桃花| 9色porny在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 免费在线观看日本一区| 亚洲精品国产区一区二| www.999成人在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲午夜理论影院| 波多野结衣av一区二区av| 两个人视频免费观看高清| 久久草成人影院| 亚洲最大成人中文| 亚洲激情在线av| 男人操女人黄网站| 中文字幕高清在线视频| 日本五十路高清| 男女之事视频高清在线观看| www.精华液| 亚洲欧美激情在线| 国产一区二区激情短视频| aaaaa片日本免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久国产成人免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 性欧美人与动物交配| 欧美性长视频在线观看| 国产av一区二区精品久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美一级a爱片免费观看看 | 午夜精品久久久久久毛片777| 热re99久久国产66热| 精品久久久久久,| 久久久久久久久久久久大奶| 久久热在线av| 亚洲 国产 在线| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美中文综合在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲成国产人片在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 级片在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 露出奶头的视频| 精品日产1卡2卡| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av成人av| aaaaa片日本免费| 女性被躁到高潮视频| 亚洲视频免费观看视频| 女警被强在线播放| 国产精品亚洲美女久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲精品国产区一区二| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品国产亚洲在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久九九热精品免费| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产看品久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 一a级毛片在线观看| 国产色视频综合| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产av一区二区精品久久| 免费在线观看黄色视频的| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品国产清高在天天线| 三级毛片av免费| 手机成人av网站| 十八禁网站免费在线| 女人被狂操c到高潮| 亚洲电影在线观看av| av有码第一页| 天堂影院成人在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| a级毛片在线看网站| 波多野结衣高清无吗| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 久久精品91蜜桃| 久久久精品欧美日韩精品| 高清在线国产一区| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| av天堂久久9| 精品电影一区二区在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产成人影院久久av| 女性生殖器流出的白浆| 中文字幕色久视频| 黄色 视频免费看| 黄频高清免费视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 女性生殖器流出的白浆| 色尼玛亚洲综合影院| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 电影成人av| 欧美日本视频| 宅男免费午夜| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 91麻豆av在线| 亚洲精品在线美女| 嫩草影院精品99| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 大型黄色视频在线免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 一区福利在线观看| 精品国产一区二区久久| 在线观看66精品国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 黄片播放在线免费| 99re在线观看精品视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久久久久午夜电影| 国产人伦9x9x在线观看| 国产又爽黄色视频| 女警被强在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 午夜a级毛片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久香蕉精品热| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品一区二区三区av网在线观看| 美女午夜性视频免费| 国产成人av教育| 无限看片的www在线观看| 精品久久久久久,| 免费在线观看黄色视频的| 一级黄色大片毛片| 久久中文字幕人妻熟女| 看免费av毛片| 99热只有精品国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品影院久久| 麻豆国产av国片精品| 国产精品1区2区在线观看.| 大陆偷拍与自拍| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丝袜在线中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产成人精品无人区| 看免费av毛片| 亚洲第一青青草原| www.精华液| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 岛国在线观看网站| 国产成人精品在线电影| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 色av中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 青草久久国产| 免费无遮挡裸体视频| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产国语对白av| 久久精品影院6| 伦理电影免费视频| 在线观看免费视频网站a站| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品综合久久久久久久免费 | 女人被狂操c到高潮| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜免费激情av| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人精品无人区| 精品国产国语对白av| 午夜福利免费观看在线| 我的亚洲天堂| 日韩欧美三级三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲精品一区av在线观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久久久久精品吃奶| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 黄色a级毛片大全视频| 国产主播在线观看一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 91成人精品电影| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品国产区一区二| 成人手机av| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品 国内视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久中文字幕人妻熟女| 中文字幕高清在线视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲在线自拍视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最新美女视频免费是黄的| 一a级毛片在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产麻豆69| 乱人伦中国视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲成人久久性| 国产熟女午夜一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成年人黄色毛片网站| 久久精品91蜜桃| 又大又爽又粗| 在线观看66精品国产| 国产精品久久视频播放| 精品福利观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 妹子高潮喷水视频| 很黄的视频免费| av在线播放免费不卡| 高清在线国产一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 长腿黑丝高跟| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品免费视频内射| 91国产中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| videosex国产| 亚洲第一电影网av| 国产一卡二卡三卡精品| 国产单亲对白刺激| 曰老女人黄片| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 色综合婷婷激情| 嫩草影院精品99| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成+人综合+亚洲专区| 香蕉丝袜av| 亚洲专区字幕在线| 久久中文字幕一级| 韩国av一区二区三区四区| 久久中文字幕人妻熟女| 精品久久久精品久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一本大道久久a久久精品| 两个人视频免费观看高清| 亚洲一区中文字幕在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜激情av网站| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲一区高清亚洲精品|