臨床變異鏈球菌及其412c基因缺陷菌株的功能初步分析

王 鵬, 樊紫萱, 喬 里, 代蕓潔, 葉朝陽(yáng), 梁 燕

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙體牙髓科, 貴州 貴陽(yáng), 550004;2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng), 550004;3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 貴州 貴陽(yáng), 550004)

變異鏈球菌作為人類齲齒的主要致病菌，大量繁殖并附著于牙齒表面的菌斑生物膜中[1]。變異鏈球菌的致齲關(guān)鍵在于其具有的3項(xiàng)生理特性，即生物膜形成、產(chǎn)酸能力和耐酸能力，且受相關(guān)毒力因子調(diào)控[2-3]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶可分解蔗糖、合成胞外多糖(EPS)并參與菌斑生物膜的構(gòu)建。在變異鏈球菌基因組序列中,412c(hit)基因編碼HIT家族蛋白SMU.412c, 美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)注釋該蛋白為“可能涉及細(xì)胞周期調(diào)控的Hit樣蛋白”[6-7]。本課題組前期利用基因同源重組方法敲除變異鏈球菌模式菌株(ATCC 25175)hit基因片段構(gòu)建hit基因缺陷菌株，并初步發(fā)現(xiàn)該缺陷菌株生長(zhǎng)速率異常快速，提示hit基因具有調(diào)控細(xì)菌周期的潛在功能[8]。為了進(jìn)一步證實(shí)412c(hit)基因的功能及其對(duì)菌株致齲性的影響，且考慮到齲患(如猛性齲)人群長(zhǎng)期接受抗生素及放療等治療可能會(huì)干擾變異鏈球菌菌群的生物特性[9], 本研究隨機(jī)收集無齲健康成人口腔牙菌斑樣本在唾液/變異鏈球菌桿菌肽瓊脂(MSA)培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、微量生化反應(yīng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法對(duì)臨床分離所得變異鏈球菌野生菌株進(jìn)行鑒定，并將線性化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該臨床野生型變異鏈球菌中進(jìn)行同源重組，獲得412c基因缺陷菌株，然后在不同pH值腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基中比較兩者的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸、耐酸等致齲特性，以期為下一步研究齲患人群變異鏈球菌的致齲性提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

BHI培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司)，盧里亞-貝爾塔尼(LB)培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)，壯觀霉素(上海生工生物工程股份有限公司)，瓊脂糖(美國(guó)Sigma公司)，溶菌酶[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司], 2×EasyTaq?PCR SuperMix(ThermusAquaticus菌聚合酶基預(yù)制高效PCR混合液，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)，改良液體Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、1%亞碲酸鉀溶液和細(xì)菌微量生化鑒定管(青島海博生物公司), DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，革蘭氏染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，重組質(zhì)粒hit-UP-pFW5-Down(由本課題組前期構(gòu)建，用于變異鏈球菌臨床分離株412c基因缺陷株的構(gòu)建)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

變異鏈球菌ATCC 25175(NCTC10449)標(biāo)準(zhǔn)株(購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)，作為變異鏈球菌臨床分離株篩選鑒定的陽(yáng)性對(duì)照菌株; 標(biāo)準(zhǔn)株hit基因缺陷菌株(由本課題組前期構(gòu)建)，作為本次臨床分離的變異鏈球菌412c基因缺陷株的生長(zhǎng)曲線對(duì)照菌株; 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(源于美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司)，可用于細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)。

1.3 臨床變異鏈球菌分離

1.3.1 臨床菌斑采集: 隨機(jī)選擇3名無齲健康成人(對(duì)本研究知情同意，無全身系統(tǒng)性疾病史; 無放化療史; 近3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素; 無不良飲食習(xí)慣如睡前喜食甜食等; 取樣牙未發(fā)生牙髓根尖周組織病變和/或牙周組織病變)作為受試者，所取樣本的牙菌斑位點(diǎn)為后牙鄰面健康牙釉質(zhì)表面。囑受試者于采集菌斑前以清水漱口，用無菌尖銳刮匙刮取所取位點(diǎn)處的牙菌斑，立即置于已提前滅菌、盛有1.0 mL改良液體Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的1.5 mL Eppendorf(EP)管中密封。將樣本置于冰盒中, 2 h內(nèi)轉(zhuǎn)送至實(shí)驗(yàn)室。所采集的菌斑樣本經(jīng)振蕩器重懸1 min至EP管內(nèi)呈渾濁狀態(tài)，待用。

1.3.2 細(xì)菌分離: 將上述原液按10倍梯度無菌生理鹽水連續(xù)稀釋，取10、100、1 000倍稀釋液各100 μL, 接種于MSA培養(yǎng)平板(添加1%亞碲酸鉀溶液)，置于厭氧環(huán)境(體積分?jǐn)?shù)80%N2、10%H2、10%C02)37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h, 觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.4 變異鏈球菌臨床分離株鑒定

1.4.1 菌落、菌體形態(tài)學(xué)鑒定: 37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察MSA培養(yǎng)板上菌落生長(zhǎng)的形態(tài)。挑取具有典型形態(tài)的單克隆菌落進(jìn)行革蘭氏染色后于正置熒光顯微鏡(AXIO imager A2, 德國(guó)蔡司公司)的明場(chǎng)像模式下油鏡觀察菌體染色、形態(tài)及排列情況。

1.4.2 細(xì)菌生化鑒定: 采用細(xì)菌生化鑒定試劑檢測(cè)菌株發(fā)酵甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖和水解七葉苷、精氨酸的能力。挑取MSA培養(yǎng)板表面典型單克隆菌落浸沒于生化試劑中并輕輕振蕩，確保所取菌落分散于試劑內(nèi), 37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。此外，挑取MSA培養(yǎng)板上單克隆菌斑于干凈清潔的載玻片上，滴加3%(體積比)過氧化氫，觀察有無氣泡產(chǎn)生。以變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25175為陽(yáng)性對(duì)照，以無菌生理鹽水為陰性對(duì)照。甘露醇、山梨醇、棉子糖和蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)中，陽(yáng)性(+)為黃色，陰性(-)為藍(lán)色、藍(lán)綠色或不變色; 七葉苷水解試驗(yàn)中，陽(yáng)性(+)為棕黑色或黑色，陰性(-)為顏色不變; 精氨酸雙水解酶試驗(yàn)中，陽(yáng)性(+)為紫色、紫紅色或不變色，陰性(-)為黃色; 觸酶試驗(yàn)加3%過氧化氫后產(chǎn)生大量氣泡者為陽(yáng)性(+)，無氣泡者為陰性(-)。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定: 通過PCR方法擴(kuò)增變異鏈球菌特異性基因片段葡糖基轉(zhuǎn)移酶B(gtfB)基因[10]和412c基因片段，目的片段大小分別為525 bp和550 bp, 以變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25175為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)GeneBank所提供的變異鏈球菌基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0軟件分別進(jìn)行g(shù)tfB和412c基因片段PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)(由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)，見表1。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取純化試劑盒說明書，提取經(jīng)菌體形態(tài)、生化鑒定符合變異鏈球菌株特征的細(xì)菌基因組DNA, 并將其作為模板，通過合成的基因片段特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增gtfB和412c基因，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定[1%(質(zhì)量體積比)西班牙瓊脂糖粉溶解于三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液(pH值=8.0)中形成瓊脂糖凝膠]。取本次目的基因412c基因PCR產(chǎn)物送樣進(jìn)行Sanger測(cè)序鑒定。

1.5 變異鏈球菌412c基因缺陷菌株構(gòu)建

采用文獻(xiàn)[8]類似方法，利用細(xì)菌天然遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)制，用已成功鑒定的臨床變異鏈球菌作為親本菌株，將重組質(zhì)粒hit-UP-pFW5-Down轉(zhuǎn)入親本菌株內(nèi)進(jìn)行同源重組: 重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)入由感受刺激肽(CSP)刺激產(chǎn)生的感受態(tài)臨床變異鏈球菌菌液中，培養(yǎng)3 h后將菌液涂布于含1.0 mg/mL壯觀霉素(Spectinomycin)抗性(Spe+)的BHI培養(yǎng)板，厭氧37 ℃培養(yǎng)48 h。隨機(jī)選取若干陽(yáng)性單克隆菌落于Spe+(1.0 mg/mL)的BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取基因組DNA, 進(jìn)行PCR鑒定，多次重復(fù)，以獲得具有穩(wěn)定Spe+(1.0 mg/mL)的臨床變異鏈球菌缺陷菌株。挑取單克隆菌落接種于Spe+(1.0 mg/mL)的BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取約850 μL菌液加入約150 μL無菌甘油混合，凍于-80 ℃冰箱保存為菌種(簡(jiǎn)稱甘油菌種)，余下菌液離心所得菌體使用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并將其作為模板，將所插入的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，取PCR產(chǎn)物行Sanger測(cè)序鑒定，引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

1.6 變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以變異鏈球菌臨床分離株及其412c基因缺陷株為實(shí)驗(yàn)菌株，以課題組前期使用的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25175及其hit基因缺陷株[8]作為對(duì)照，將上述甘油菌種分別經(jīng)未添加壯觀霉素(下稱無抗)和添加1.0 mg/mL壯觀霉素的BHI固體培養(yǎng)基劃線復(fù)蘇活化后，挑取單克隆菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，厭氧37 ℃、220轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)20 h左右。取部分菌液用新配制BHI培養(yǎng)基[pH值(7.0±0.3)]調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫萚(1.0～2.0)×108CFU/mL], 然后再稀釋10倍作為工作菌液[(1.0～2.0)×107CFU/mL]。

取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 96個(gè)小孔按8行(A～H行)12列(1～12列)排列，每孔加入180 μL無抗BHI培養(yǎng)基[pH值(7.0±0.3)]和20 μL工作菌液[(1.0～2.0)×107CFU/mL]，厭氧37 ℃、100轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)，每隔1 h或2 h取出，于SYNERGY-H4 microplate reader酶標(biāo)儀上檢測(cè)菌液在600 nm波長(zhǎng)處光密度(OD600)值，持續(xù)測(cè)試48～96 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將變異鏈球菌臨床分離株及其412c基因缺陷株配對(duì)分別加樣于1個(gè)96孔板的前3行(ABC)和末3行(FGH), 各計(jì)36個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。1個(gè)實(shí)驗(yàn)板中，1個(gè)樣本菌株在t時(shí)點(diǎn)由上述機(jī)器掃描測(cè)定36孔的OD600值，將每1列所在3行(如ABC、FGH)的3小孔取均值設(shè)為1個(gè)測(cè)定值，其余11列為平行測(cè)定值，12個(gè)測(cè)定值的平均值即為菌液t時(shí)點(diǎn)生長(zhǎng)值[(OD600)t], 生長(zhǎng)速率=[(OD600)t-(OD600)0]/t。同時(shí)，平行實(shí)驗(yàn)3個(gè)實(shí)驗(yàn)板。變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25175及其hit基因缺陷株配對(duì)為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.7 耐酸試驗(yàn)

以臨床變異鏈球菌412c基因缺陷株為實(shí)驗(yàn)菌株，其親本菌株為對(duì)照菌株，菌液均過夜培養(yǎng)，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各組菌液每孔按1∶9(體積比)加入制備好的工作懸液[(1.0～2.0)×107CFU/mL]和無抗BHI液體培養(yǎng)基(pH值4.8, Na+濃度322 mmol/L)。其余步驟與1.6類似，測(cè)定菌液(OD600)t。

1.8 產(chǎn)酸試驗(yàn)

選取臨床變異鏈球菌412c基因缺陷株為實(shí)驗(yàn)菌株，其親本菌株為對(duì)照菌株，菌液均過夜培養(yǎng)，用新配制BHI培養(yǎng)基[pH值(7.0±0.3)]調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫萚(1.0～2.0)×108CFU/mL], 按1∶100(體積比)加入到含3%(質(zhì)量體積比)蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，每種菌株設(shè)置6個(gè)平行管, 37 ℃、220轉(zhuǎn)/min厭氧培養(yǎng), 12、24 h后各取3管進(jìn)行離心，測(cè)量上清液pH值，每管重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。計(jì)算不同菌液在12、24 h時(shí)的pH值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料符合正態(tài)分布者采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床變異鏈球菌鑒定結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)及革蘭氏染色表現(xiàn): 臨床分離株在MSA培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)48 h后，菌落表現(xiàn)為深藍(lán)色半球狀突起(圖1A, 紅色箭頭)，表面粗糙，邊緣不齊。隨機(jī)挑選單克隆菌落接種于無抗BHI培養(yǎng)液厭氧過夜培養(yǎng)，菌液經(jīng)革蘭氏染色，油鏡(放大倍數(shù)10×100)下可見革蘭陽(yáng)性藍(lán)紫色球狀菌體，呈長(zhǎng)鏈狀(圖1B, 粗紅箭頭)和短鏈狀(圖1B, 細(xì)紅箭頭)分布，成對(duì)或分散排列，表現(xiàn)為鏈球菌屬經(jīng)典形態(tài)特征。

2.1.2 菌株生化鑒定結(jié)果: 檢測(cè)臨床分離菌株發(fā)酵甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖和水解七葉苷、精氨酸的能力，并進(jìn)行3%過氧化氫觸酶試驗(yàn)，以模式菌株ATCC 25175為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，除蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)顯陰性外，臨床分離菌株其余各生化反應(yīng)結(jié)果均與模式菌株ATCC 25175一致，見表2。

表2 臨床變異鏈球菌株生化反應(yīng)結(jié)果

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定: 隨機(jī)挑選形態(tài)、生化鑒定結(jié)果符合變異鏈球菌株特征的菌落(編號(hào)27#～32#, 以ATCC 25175為對(duì)照)接種于BHI培養(yǎng)基，處理后對(duì)412c基因片段(550 bp)和gtfB基因片段(525 bp)進(jìn)行PCR產(chǎn)物核酸電泳和412c-PCR Sanger測(cè)序鑒定。電泳圖顯示, 5株臨床無齲變異鏈球菌株各自擴(kuò)增的412c(hit)基因和gtfB基因片段條帶大小均彼此相同，均約為500 bp, 與模式菌株ATCC 25175結(jié)果一致，見圖1C、圖1D。將純化回收的412cPCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序拼接為481 bp片段，選取32#臨床變異鏈球菌412c片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行BLAST比對(duì)后，與變異鏈球菌UA159(AE014133.2∶386352～386832)、變異鏈球菌ATCC 25175(NCTC10449)(LS483349.1C∶1665417～1664937)和變異鏈球菌FDAARGOS_685(CP050962.1∶726908～727388)的基因片段進(jìn)行多重比對(duì)。結(jié)果顯示, 32#臨床變異鏈球菌412c(hit)基因片段的序列與UA159、FDAARGOS_685的序列和ATCC 25175的互補(bǔ)序列完全一致，該片段為“等效變異鏈球菌UA159”的412c基因，見圖1E(全長(zhǎng)420 bp的412c基因“讀碼框”內(nèi)，起始密碼子和終止密碼子的位置分別位于黑色“雙下劃線”和“單下劃線”處)。

2.2 臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的鑒定

將前期成功構(gòu)建的hit-UP-pFW5-DOWN重組質(zhì)粒(20#)[8]線性化后轉(zhuǎn)入臨床變異鏈球菌中進(jìn)行同源重組，以獲得具有穩(wěn)定Spe+(1.0 mg/mL)的臨床變異鏈球菌缺陷菌株，基因組中412c基因片段(圖1E中，兩紅色箭頭間)被壯觀霉素抗性基因aad9片段所替換，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小由550 bp變?yōu)? 413 bp(表1)。核酸電泳和PCR Sanger測(cè)序鑒定結(jié)果(圖2)顯示: ① 平行的2株臨床變異鏈球菌缺陷菌株的412c片段PCR產(chǎn)物核酸電泳條帶位置基本相同，均接近1 000～2 000 bp的中間位置處(約1 500 bp處)(圖2A、圖2C), 與其片段大小(1 413 bp)相近; ②片段上部分PCR Sanger測(cè)序圖顯示,412c基因缺陷株的412c基因仍有部分殘余堿基序列(圖2B, L側(cè)，上板與下板序列相同)，隨后R側(cè)(圖1E, 向下的粗紅箭頭后; 圖2B, 黑雙箭頭右側(cè))被插入的Linker序列(5′-CATATGCATGCTG-3′)所替代; ③ 片段下部分PCR Sanger測(cè)序圖顯示,412c基因的堿基序列(圖1E, 向上的粗紅箭頭前; 圖2B, 黑雙箭頭左側(cè))被插入的Linker序列(5′-AACGAAAATCAAGCTT-3′)所替代，隨后缺陷株仍有部分hit(412c)基因殘余序列(圖2D, R側(cè)，上板與下板序列相同)。由此證實(shí)，變異鏈球菌臨床分離株的412c(hit)基因缺陷菌株構(gòu)建成功。

2.3 臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的生長(zhǎng)特性

在普通營(yíng)養(yǎng)BHI培養(yǎng)基中進(jìn)行近4 d生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)菌液生長(zhǎng)起始濃度為(1.0～2.0)×106CFU/mL。與親本菌株比較，臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株持續(xù)快速生長(zhǎng)，見圖3A; 兩者經(jīng)歷約7 h的遲緩期后，同時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再4 h后親本菌株到達(dá)峰值，轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)速率急速下降(圖3B, 黑色曲線)，呈現(xiàn)比較典型的細(xì)菌生長(zhǎng)周期特征; 此時(shí),412c基因缺陷菌株仍繼續(xù)保持對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，持續(xù)快速生長(zhǎng)約10 h后速率達(dá)峰值，生長(zhǎng)速率為親本菌株的1.5倍左右(圖3B, 紅色曲線)，即使轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期，其生長(zhǎng)速率仍高于親本菌株，菌液OD600值始終為親本菌液的3倍左右(圖3A)。

觀察普通營(yíng)養(yǎng)BHI培養(yǎng)基中臨床變異鏈球菌、模式菌株ATCC 25175及其對(duì)應(yīng)412c(hit)基因缺陷菌株的生長(zhǎng)特性，各菌液初始生長(zhǎng)濃度均為(1.0～2.0)×106CFU/mL, 前48 h實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。① 0～24 h, 各種菌株呈現(xiàn)不同生長(zhǎng)趨勢(shì): 模式菌株ATCC 25175的遲緩期長(zhǎng)達(dá)15 h, 對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)也顯著緩慢，而臨床變異鏈球菌遲緩期較短(約7 h), 對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)維持4 h后即轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期，菌體總OD600值較低，不同背景和來源的變異鏈球菌株，其生長(zhǎng)也各具特點(diǎn)。模式菌株ATCC 25175hit基因缺陷菌株的遲緩期較短(約3 h), 較早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，期前速率快，期中平緩，然后急速增加; 臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的遲緩期相對(duì)較長(zhǎng)(約7 h), 進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)則持續(xù)快速生長(zhǎng)。值得注意的是, 20 h后，模式菌株ATCC 25175hit基因缺陷菌株和臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株的菌液OD600值幾乎一樣，進(jìn)一步表明412c(hit)基因調(diào)控變異鏈球菌生長(zhǎng)周期, 412c(hit)基因缺陷菌株相較親本菌株持續(xù)快速增殖生長(zhǎng)。② 24～48 h, 臨床變異鏈球菌、模式菌株ATCC 25175的生長(zhǎng)速率基本一致，而兩者對(duì)應(yīng)的412c(hit)基因缺陷菌株的生長(zhǎng)速率亦基本一致(圖4B)。

2.4 臨床變異鏈球菌412c(基因缺陷菌株的致齲產(chǎn)酸耐酸)特性

將臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株和親本菌株接種于含3%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行產(chǎn)酸試驗(yàn)，起始濃度為(1.0～2.0)×106CFU/mL, 結(jié)果顯示，厭氧培養(yǎng)12、24 h后,412c基因缺陷菌株代謝蔗糖產(chǎn)酸后菌液離心上清液pH值均高于其親本菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見圖5A。在pH值為4.8的BHI培養(yǎng)基中進(jìn)行耐酸試驗(yàn)，結(jié)果顯示，臨床變異鏈球菌412c基因缺陷菌株在長(zhǎng)達(dá)48 h的觀察期內(nèi)仍可持續(xù)生長(zhǎng)，而其親本菌株幾乎被完全抑制，見圖5B。由此表明，臨床變異鏈球菌出現(xiàn)412c基因缺陷后，產(chǎn)酸、耐酸能力均會(huì)受到明顯影響。

3 討 論

變異鏈球菌可在復(fù)雜的口腔環(huán)境中生長(zhǎng)增殖，其致齲過程受不同基因編碼蛋白介導(dǎo)的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)[11]。Smu.412c基因編碼蛋白屬于HIT家族蛋白，而HIT家族蛋白在自然界中廣泛存在且高度保守，提示HIT蛋白可能具有非常重要的生理功能。本課題組前期采用模式菌株ATCC 25175構(gòu)建hit基因缺陷菌株，在普通BHI培養(yǎng)基中，變異鏈球菌hit基因缺陷菌株的生長(zhǎng)速率相較親本菌株ATCC 25175顯著提升[8]，初步驗(yàn)證了NCBI所注釋的“Hit樣蛋白涉及細(xì)胞周期調(diào)控功能”[12]。

為了進(jìn)一步證實(shí)hit基因的功能，且考慮到齲病患者口腔環(huán)境中變異鏈球菌可能受某些不確定因素影響(例如長(zhǎng)期抗生素治療等帶來的不穩(wěn)定隨機(jī)變異影響)，本研究初步選擇直接從無齲健康人群口腔牙菌斑樣本在MSA培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，并采用一系列方法鑒定出分離的臨床菌株為變異鏈球菌株，說明應(yīng)用MSA培養(yǎng)基對(duì)臨床口腔來源變異鏈球菌屬進(jìn)行篩選分離是可行的。細(xì)菌生化結(jié)果顯示，本研究分離的臨床變異鏈球菌的蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，與作為陽(yáng)性對(duì)照的模式菌株ATCC 25175試驗(yàn)結(jié)果不同。這可能與變異鏈球菌的不同血清型有關(guān), D型、G型菌株中往往會(huì)有相當(dāng)數(shù)量的菌株無法發(fā)酵蜜二糖和山梨醇[13]，因此后續(xù)還需對(duì)本研究分離菌株的血清型進(jìn)一步鑒定。此外,412cPCR Sanger測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，本研究分離的臨床變異鏈球菌為“等效變異鏈球菌UA159”菌株，以其為親本菌株構(gòu)建412c基因缺陷菌株后發(fā)現(xiàn)，該412c基因缺陷菌株展現(xiàn)出相較親本菌株更加快速的生長(zhǎng)能力，與模式菌株ATCC 25175hit基因突變后的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似。

變異鏈球菌可通過代謝外源性碳水化合物產(chǎn)生大量有機(jī)酸，其中蔗糖是變異鏈球菌產(chǎn)酸的主要來源，也是合成胞外多糖的重要底物[14-15]。高濃度蔗糖的攝入可引起牙齒表面局部環(huán)境變化，并促進(jìn)變異鏈球菌在生物膜中酸性物質(zhì)的積累，從而增強(qiáng)其致齲能力[16]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證412c基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)的調(diào)控功能，并探討412c基因?qū)ψ儺愭溓蚓嚓P(guān)致齲(產(chǎn)酸、耐酸)特性的影響，本研究使用含3%蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，并利用變異鏈球菌分解蔗糖產(chǎn)酸及降低培養(yǎng)基pH值的特點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)酸性能比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)12 h后，臨床親本株培養(yǎng)基pH值降至4.5以下，說明親本株本身具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，但24 h后親本株的pH值變化較小(約0.1), 這可能是因?yàn)槠渖L(zhǎng)代謝能力受到了高酸環(huán)境的抑制。此外,412c基因缺陷株培養(yǎng)24 h后離心上清液的pH值也可降至5.0以下，但其12、24 h時(shí)的pH值均高于親本菌株，說明412c基因缺陷可能會(huì)影響變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力，而其是否影響細(xì)菌形成胞外多糖能力仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

隨著菌斑生物膜內(nèi)酸性物質(zhì)持續(xù)積累、pH值逐漸降低，口腔大多數(shù)菌群的生長(zhǎng)和代謝均受到抑制[17]。而變異鏈球菌在產(chǎn)酸的同時(shí)具有應(yīng)對(duì)“酸性沖擊”的能力，外源性糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行糖酵解反應(yīng)并產(chǎn)生有機(jī)酸導(dǎo)致胞內(nèi)pH值降低，為了抵御酸性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害，變異鏈球菌通過激活胞膜上的H+-ATP酶(質(zhì)子移位膜ATP酶)排出H+維持跨膜梯度，以保持細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)態(tài)平衡[18-19]。同時(shí)，變異鏈球菌通過功能基因組編碼蛋白改變其耐酸性能，以獲得相對(duì)于低酸性物種的選擇性優(yōu)勢(shì)[11, 20]。本研究中，變異鏈球菌在缺失412c基因后又經(jīng)歷酸性(pH值=4.8)沖擊，但仍在約第7小時(shí)(與普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間相近)開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即使總菌體濃度有所降低也仍能持續(xù)快速繁殖，而其臨床親本株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，說明變異鏈球菌缺失412c基因后具有較強(qiáng)的耐酸性。

綜上所述，當(dāng)412c基因缺失后，臨床變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力有所變化，但具有快速的生長(zhǎng)繁殖能力和更強(qiáng)的耐酸性，這可能會(huì)使變異鏈球菌在復(fù)雜的口腔環(huán)境中獲得更多的資源，從而更容易在致病過程中發(fā)揮致齲潛力。