PDGFRA啟動子SNPs與廣西壯族人群鼻咽癌易感性的關(guān)系研究

唐玉蓮，李鈺穎，侯沅林，胡婷，王太重

(右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，廣西 百色 533000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是廣西地區(qū)的高發(fā)腫瘤，發(fā)病率遠高于全國平均水平[1]。近年來，盡管鼻咽癌診治已取得了長足的進步，但是人們對其發(fā)病分子機制還不夠清楚，其發(fā)病原因、易感因素和癌變機制等仍需進一步探索。先前的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)報道了鼻咽癌相關(guān)的易感基因[2-4]，包括HLA1類基因、細胞周期調(diào)節(jié)基因(如MDM2和TP53)、DNA修復(fù)基因(如RAD51L1)以及細胞黏附和遷移基因(如MMP2)等。

血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)是一種重要的細胞生長和細胞分化的促進因子，其在腫瘤細胞黏附、遷移、血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[5]。血小板源性生長因子受體α多肽(platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)是PDGF(包括PDGFA、PDGFB和PDGFC)的細胞表面受體，被證實具有酪氨酸激酶活性[6]。多項研究表明[7-10]，PDGFRA在血管生成、胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，該基因突變與特發(fā)性嗜酸性粒細胞增多癥、胃腸道間質(zhì)瘤以及其它多種癌癥有關(guān)。然而目前，國內(nèi)外有關(guān)PDGFRA基因多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)性的研究少見報道。故本研究擬運用病例對照法探究該基因啟動子區(qū)rs6554162(-1467G/A)和rs1800812(-635G/T)位點的SNPs與廣西壯族人群NPC易感性的關(guān)系，以期為進一步闡釋鼻咽癌的發(fā)病機制和新的治療靶點提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2018年5月1日—2020年5月1日經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理組織確診的120例廣西壯族人群NPC患者的靜脈全血樣本，其中男性和女性分別為85例和35例，年齡為(47.76±10.22)歲。同期健康體檢對照者全血樣本126例，其中男性和女性分別為62例和64例，年齡為(42.94±12.89)歲。研究方案通過右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，受試者均知情后簽署同意書。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：三代及以上世居的廣西壯族人群，通過臨床與病理組織雙重檢查初診為NPC的患者，未實施放療和化療，也無其他腫瘤史和心、肝、腦、腎等其它疾病，個體間亦無親緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者，或伴有血液、骨骼、心肺腦以及其他系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病，或嚴(yán)重感染與免疫缺陷等。

1.3方法

1.3.1基因組DNA分離提取 采集研究對象靜脈全血2 mL，使用血液基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工公司)對血液樣品進行DNA抽提，使用Qubit 2.0核酸定量儀對獲得的DNA進行濃度以及純度測定，A260/280比值為1.7～1.9，A260/A230比值>2.0為合格DNA樣本。完成后，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2多重PCR擴增及高通量測序 設(shè)計并合成一個包含45個SNP位點的引物池，通過兩步法PCR完成目標(biāo)SNP位點序列的擴增和兼容Illumina測序文庫的制備。第一輪PCR體系：DNA 模板(10 ng/μL)2 μL；上游引物池(10 μM)1 μL；下游引物池(10 μM)1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL，無核酸酶水補足25 μL。配制好反應(yīng)體系后，在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)上執(zhí)行PCR反應(yīng)程序。PCR反應(yīng)完成后，使用AMPure XP磁珠純化回收PCR產(chǎn)物。以回收的PCR產(chǎn)物為模板，執(zhí)行第二輪PCR反應(yīng)，獲得測序帶分子標(biāo)簽的文庫。最終PCR產(chǎn)物再使用AMPure XP磁珠純化回收。各個PCR產(chǎn)物等量混合后，使用HiSeq XTen測序儀進行測序。

1.3.3測序數(shù)據(jù)處理及基因分型分析 下機數(shù)據(jù)首先使用cutadapt(v 1.2.1)軟件切除測序接頭部分序列；然后使用PRINSEQ-lite(v 0.20.3)軟件從3′端往5′端方向?qū)κＳ嘈蛄羞M行質(zhì)量控制，刪除閾值低于20的堿基以便獲得合格序列。接著使用BWA軟件將質(zhì)控合格的序列比對到人參考基因組上。根據(jù)比對結(jié)果，計算目標(biāo)位點的基因型結(jié)果。最后使用Annovar軟件對突變位點進行基因注釋。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析。病例組和對照組基因型、等位基因和不同遺傳模型的分布采用χ2檢驗；擬合χ2檢驗用于檢測基因型頻率是否符合哈溫伯格(Hardy-Weinberg)遺傳平衡定律，從而判斷群體的代表性；二元Logistic回歸用于分析基因型和等位基因型分布頻率與NPC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系[以O(shè)R值和95%置信區(qū)間(95%CI)表示相對風(fēng)險]。使用SHE sis在線分析軟件(http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)進行單倍型分析。以P=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1基因型分析PDGFRA基因rs6554162位點的基因型有GG、GA和AA型，其中GG為野生基因型，GA為雜合突變基因型，AA為純合突變基因型。rs1800812位點的基因型有GG、GT和TT型，其中GG為野生基因型，GT為雜合突變基因型，TT為純合突變基因型。經(jīng)檢驗，NPC組和對照組rs6554162和rs1800812位點基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，群體具有代表性。見表1。

表1 rs6554162和rs1800812基因型分布hardy-weinberg平衡檢驗

2.2基因型與鼻咽癌易感性的相關(guān)性PDGFRA基因該兩位點的基因型頻率在NPC組和對照組中的比較，見表2。其中，rs6554162的GA基因型(OR=1.405，95%CI為0.822～2.400，P=0.214)和AA基因型(OR=0.851，95%CI為0.293～2.468，P=0.766)在NPC組和對照組中的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；rs1800812位點的GT基因型(OR=1.488，95%CI為0.857～2.854，P=0.158)和TT基因型(OR=0.940，95%CI為0.318～2.780，P=0.910)在NPC組和對照組中的分布差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，該兩位點的不同遺傳模型在NPC組和對照組中的分布差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可見，PDGFRA基因rs6554162和rs1800812位點的基因型與鼻咽癌的患病無關(guān)。

表2 rs6554162和rs1800812基因型頻率在NPC組和對照組中的比較

2.3等位基因與鼻咽癌易感性的相關(guān)性PDGFRA基因該兩位點的等位基因頻率在NPC組和對照組中的比較見表3。rs6554162位點中，A等位基因(OR=1.131，95%CI為0.752～1.701，P=0.555)在NPC組和對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs1800812位點中，T等位基因(OR=1.206，95%CI為0.785～1.853，P=0.393)在NPC組和對照組中差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可見，PDGFRA基因rs6554162和rs1800812位點的等位基因與鼻咽癌的患病無關(guān)。

表3 rs6554162和rs1800812等位基因頻率在NPC組和對照組中的比較

2.4單倍型與鼻咽癌易感性的相關(guān)性 經(jīng)SHE sis在線分析軟件對PDGFRA基因該兩位點的單倍型進行構(gòu)建分析，結(jié)果顯示該基因的這個兩位點存在AG、AT和GG 3種單倍型(見表4)，各單倍型在NPC組和對照組中的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？梢姡琍DGFRA基因該兩位點的單倍型亦與鼻咽癌的患病無關(guān)。

表4 rs6554162和rs1800812單倍型在NPC組和對照組中的比較

3 討論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與新生血管的生成密切相關(guān)。血小板內(nèi)有大量血管生成調(diào)節(jié)因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、血小板反應(yīng)素-1和血小板衍生生長因子等[11]。PDGFRA作為酪氨酸激酶受體家族的一個亞型，與配體PDGF結(jié)合，廣泛調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，活化后的PDGFRA可通過激活PDGFR信號通路，在血管生成和維持功能性血管系統(tǒng)中起重要作用[12-13]。PDGFRA與PDGFs結(jié)合后，PDGFs驅(qū)動PDGFRA組裝成二聚體，誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致特定細胞內(nèi)酪氨酸殘基自磷酸化，異常磷酸化的酪氨酸招募一系列連接分子，激活磷脂酰肌醇、cAMP等一系列下游信號通路，調(diào)控細胞增殖和遷移等，促進腫瘤發(fā)生與血管生成[13-14]。已有研究表明[15]，PDGFRA調(diào)控失調(diào)已在多種癌癥中得到證實，如PDGFRA的過表達與肝癌微血管密度及腫瘤的血管浸潤密切相關(guān)(P<0.05)。而PDGFRA的突變更是多種類型腫瘤進展的促進因素，如膠質(zhì)母細胞瘤、黑色素瘤、急性髓系白血病、周圍神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌癌等[16-17]。

啟動子是一段位于轉(zhuǎn)錄起始點上游的DNA序列，可結(jié)合和活化RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄。啟動子區(qū)位點等位基因突變已報道與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，如Piwil1基因啟動子區(qū)rs28416520位點SNPs與胃癌發(fā)病風(fēng)險升高相關(guān)[18]；TNF-α啟動子rs361525、rs1800629、rs17999645位點SNPs與宮頸癌的遺傳易感性有關(guān)[19]；TNFSF15 啟動子區(qū)rs6478109及rs7848647遺傳變異影響結(jié)直腸癌的遺傳易感性等[20]。PDGFRA基因啟動子區(qū)SNPs是否與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)？rs6554162和rs1800812是PDGFRA基因啟動子區(qū)研究較多的SNPs。該兩位點SNPs的A等位基因和T等位基因與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的發(fā)生有關(guān)[21]；另外，rs1800812位點SNPs還報道與血小板減少癥和手足綜合征(HFS)的風(fēng)險相關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，rs6554162位點的基因型GG、GA和AA以及等位基因G、A在NPC組和對照組中比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均有P>0.05)；rs1800812位點的基因型GG、GT和TT以及等位基因G、T在兩組中比較差異同樣也無統(tǒng)計學(xué)意義(均有P>0.05)；另外，單倍型分析結(jié)果得出的結(jié)論也是如此?？梢姡琍DGFRA基因啟動子區(qū)rs6554162和rs1800812的SNPs可能與鼻咽癌易感性無關(guān)聯(lián)。鼻咽癌的發(fā)病受多因素影響，EB病毒感染、化學(xué)致癌物等因素都可能起重要作用，且與地域和種族人群有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PDGFRA基因啟動子區(qū)rs6554162和rs1800812的SNPs在NPC組和對照組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，其可能與鼻咽癌易感性無關(guān)聯(lián)，不增加廣西壯族人群鼻咽癌的患病風(fēng)險。不過由于本研究樣本量較少，且未對基因交互作用做一定分析等。因此，今后將繼續(xù)加大樣本收集量，多方評估鼻咽癌的易感影響因素，更好地揭示鼻咽癌的發(fā)病分子機制。