血清Sema4C在結直腸癌患者的差異表達及臨床意義

朱萍，浦春，胡蝶，張艷珍，張博超，楊藝凡，吳欣怡，陳銀銀，路勇，張秦

(1. 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 蕪湖 241001；2. 皖南醫(yī)學院檢驗學院，安徽 蕪湖 241002)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，男性和女性癌癥相關死亡率較高[1]。引起CRC的危險因素有很多，包括病毒和細菌感染、酒精、煙草、煙霧、衰老、潰瘍性結腸炎以及基因突變[2]。癌細胞的侵襲和轉移是包括CRC在內多數(shù)惡性腫瘤的基本生物學特征，也是患者治療失敗和致死的主要因素[3]。由于CRC早期癥狀隱匿以及早期發(fā)現(xiàn)和篩查的局限性，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，手術治療或放化療效果欠佳，預后不良[4]。因此在外周血中尋找一個高靈敏度及特異度的新型腫瘤標志物對于CRC的早期篩查診斷具有重要的臨床意義。信號蛋白是一種可以調節(jié)宿主細胞功能，同時能介導癌癥的許多特征，包括細胞生長、血管生成、逃逸等的蛋白家族[5]。腦信號蛋白4C(semaphorin 4C，Sema4C)是信號蛋白家庭成員之一，最初是作為參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和軸突導向的分子被發(fā)現(xiàn)。目前越來越多的研究證明，該分子不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著有重要作用，在腫瘤中同樣起著至關重要的作用。有研究證明其是治療浸潤性乳腺癌[6]、肝細胞性肝癌[7]和宮頸癌[8]的潛在靶點。然而，有關血清中Sema4C水平在CRC患者中的研究較少。本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析Sema4C在CRC組織及正常組織中的表達水平，通過觀察CRC患者血清Sema4C表達情況，分析血清Sema4C水平與CRC患者臨床病理特征間的關系，探討其診斷CRC的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年12月—2021年4月在皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院進行治療的38例CRC患者血清為CRC組，同時收集37例健康體檢者的血清作為對照組，血清立即保存至-80 ℃。CRC組年齡≥60歲患者33例，<60歲5例；男性23例，女性15例；腫瘤最大徑≥3 cm 33例，<3 cm 5例；直腸腺癌21例，結腸腺癌17例；有神經(jīng)侵襲11例，無神經(jīng)侵襲27例；有脈管侵襲7例，無脈管侵襲31例；有淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移26例；T1+T2的6例，T3+T4的32例。對照組年齡≥60歲患者4例，<60歲33例；男性23例，女性14例；CRC組和對照組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CRC的診斷以病理學診斷為金標準，所有患者術前均未接受放療、化療及免疫制劑等抗癌治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集CRC患者及健康體檢者空腹靜脈血5 mL(CRC患者于手術前采集，體檢健康者于體檢時采集)，置于含促凝膠劑的真空采血管中，室溫下靜置，1000 r/min離心15 min，取上清液置于EP管中，-80°冰箱保存。

1.2.2血清Sema4C水平檢測 應用Sema4C ELISA試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司]。檢測嚴格按照說明書進行操作，設置標準品孔、樣本孔和空白孔，標準品孔和樣本孔各加不同濃度的標準品50 μL，空白孔不加。將100 μL的辣根過氧化物酶偶聯(lián)試劑加入標準孔和除空白孔外的樣品孔中，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴箱孵育60 min。將反應板每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復清洗4次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μL終止液，15 min內，應用酶標分析儀(美國Bio-rad公司)在450 nm波長處測量樣本吸光度。以所測標準品的吸光度為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣本吸光度值代入方程，計算出樣本的濃度。

1.2.3臨床資料收集 記錄收集CRC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位、神經(jīng)及脈管侵犯、淋巴結轉移和T分期等臨床病理資料，分析血清Sema4C水平與患者臨床病理特征之間的關系。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，計量資料采用M(P25～P75)，兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗；繪制ROC曲線，評估血清Sema4C水平對CRC的診斷效能；以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Sema4C在CRC患者中高表達 本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫對41例正常者和286例CRC患者進行Sema4C表達水平分析，發(fā)現(xiàn)Sema4C在CRC中的表達水平顯著升高(P< 0.05)，見圖1。

圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫中Sema4C在CRC患者及正常者中的表達水平

2.2CRC組與健康體檢組血清Sema4c水平比較 應用Sema4C ELISA試劑盒檢測CRC組與健康體檢組血清，結果顯示CRC組血清Sema4C水平[1.510(0.814～3.452) ng/mL]高于健康體檢組[0.993(0.677～1.995) ng/mL]血清Sema4C水平，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.194，P<0.05)。提示Sema4C的高水平表達可能與CRC的發(fā)生有關。

2.3CRC患者血清Sema4C與臨床病理特征之間的關系 將血清Sema4C水平相對表達水平與CRC患者性別、年齡、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、深部轉移狀態(tài)、有無神經(jīng)侵犯、有無脈管侵犯等臨床病理特征進行統(tǒng)計分析，結果發(fā)現(xiàn)血清Sema4C相對表達水平在腫瘤最大徑、有無神經(jīng)侵犯、T分期之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在不同年齡、性別、腫瘤部位、有無脈管侵犯及淋巴結轉移患者之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示血清Sema4C水平與CRC的腫瘤大小、T分期及神經(jīng)浸潤有關。見表1。

表1 CRC患者血清Sema4C水平與臨床病理特征之間的關系 單位：ng/mL

2.4血清Sema4C水平對CRC診斷效能 繪制ROC曲線評估Sema4C對CRC的診斷效能，結果表明Sema4C的ROC曲線下面積(AUC)為0.674(95%CI：0.523～0.771)(P=0.028)，當最佳截斷值為1.257時，其診斷CRC的靈敏度為60.50%，特異度為70.30%。見圖2。

圖2 血清Sema4C水平對CRC診斷價值的ROC曲線圖

3 討論

Semaphorins家族蛋白(Sema家族)是一大類具有保守Sema結構域的信號蛋白，構成了膜結合和分泌蛋白的大家族，最初是作為調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育，影響軸突的分支和突觸形成被發(fā)現(xiàn)，后來被證明是許多生物過程中的關鍵調節(jié)因子，包括血管發(fā)育和癌癥。該家族共有二十幾個成員，根據(jù)結構和生物起源不同，這些分子被分為8個亞家族(Ⅰ～Ⅷ)[9]。Semas通過與兩個主要受體家族，神經(jīng)吡啶和神經(jīng)叢素家族的受體結合來轉導信號。這些與原代信號蛋白形成復合物的受體也經(jīng)常參與其他信號蛋白信號傳導。最近的證據(jù)表明，信號蛋白在多種癌癥的病因中也起著重要作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些信號蛋白可以作為真正的腫瘤抑制因子，并通過各種機制抑制腫瘤進展，而其他信號蛋白則作為腫瘤進展的誘導劑和啟動子，具體取決于特定的翻譯后修飾[10]。已有的文獻提出腫瘤相關炎性細胞(例如巨噬細胞和嗜中性粒細胞)和癌癥相關成纖維細胞(CAF)在調節(jié)癌癥血管生成、侵襲和轉移方面具有關鍵作用，在這些細胞中，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)從抗腫瘤M1極化到M2替代激活表型的轉變可以誘導腫瘤血管生成并支持腫瘤進展，Semas通過調節(jié)免疫系統(tǒng)并調節(jié)TAM的功能，有助于調節(jié)腫瘤血管生成。例如，Sema3B被認為是潛在的腫瘤抑制因子，在許多癌癥中具有下調作用，但它可以誘導癌細胞中IL-8的產(chǎn)生，有助于TAMs的募集，從而維持腫瘤血管生成和進展及促進轉移形成[11-12]。

GU C H[12]提出Sema3A在內皮細胞中表達，并通過抑制整合素功能以自分泌方式調節(jié)內皮細胞遷移和血管重塑。此外，有研究表明，小鼠Sema3A的遺傳缺失導致嚴重的腎臟血管模式缺陷，進一步支持Sema3A在血管生成重塑中的作用。而Sema4D其在多種腫瘤中的表達水平均較高，Sema4D可以通過結合PlexinB2刺激腫瘤內血管新生。同時Sema4D與Plexin-B1的結合也增強了Met磷酸化反過來進一步誘導腫瘤血管生成、侵襲和轉移，加劇腫瘤細胞的惡性生物學行為，已被描述為血管生成的啟動子和腫瘤進展的啟動子。因此，這種信號蛋白被認為是開發(fā)新型癌癥治療藥物的靶標[13]。而Sema4C與Sema4D結構同源性較高，功能相似。人Sema4C已被報道其在多種腫瘤中異常表達，并通過多種信號轉導途徑參與腫瘤的生長、轉移和凋亡過程從而影響腫瘤的發(fā)生進展[5]。HUANG S Y等[14]通過對收集的74例上皮性卵巢癌、20例卵巢上皮良性腫瘤、20例卵巢邊緣上皮腫瘤和15例正常卵巢組織進行檢測并將Sema4C表達與患者臨床病理特征做相關性分析，分析結果顯示Sema4C mRNA在所有癌癥組織中均有高表達，其表達水平與組織學類型無關，但Sema4C蛋白在上皮性卵巢癌中高度表達。并且Sema4C mRNA在上皮性卵巢癌中的表達與腫瘤分化程度、臨床分期及腹水相關，而Sema4C蛋白表達與上皮性卵巢癌的分化和臨床分期有關，但與組織學類型、腹水和年齡無關。Sema4C還被證明在肝癌中上調，并調節(jié)肝癌細胞的侵襲和遷移[15]。此外，有研究報道Sema4C在CRC組織中呈高表達，其表達情況與CRC患者的病理分期和腫瘤轉移有一定的相關性，高Sema4C蛋白表達的CRC患者也表現(xiàn)出較差的總生存期和無進展生存期，提示高Sema4C表達可預測CRC患者的預后不良。該報道還指出Sema4C不僅可以通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路誘導上皮間質轉化(EMT)，從而降低了細胞之間的黏附力，抑制細胞極性并增加腫瘤細胞的遷移能力，并且Sema4C表達與Sema4C基因中5’-UTR區(qū)域的甲基化呈負相關，而DNA甲基化等表觀遺傳變化在調節(jié)基因轉錄和CRC發(fā)展中起關鍵作用，異常的DNA甲基化可以通過滅活腫瘤抑制基因或激活癌基因來促進CRC進展[16]。WANG Y等[17]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清Sema4C水平顯著高于良性乳腺癌患者和正常人員，且術后血清Sema4C水平顯著低于治療前水平。提示血清Sema4C水平可作為乳腺癌診斷特異性的生物標志物。

理想的血清學蛋白生物標志物應至少滿足2個標準。首先，它應該是一種分泌的蛋白質，可以很容易地在血清中檢測到。其次，它應該在癌癥中特異性過表達，而不是在正常組織或良性病變中。最近的研究結果表明，Sema4C符合以下兩個標準：它是一種分泌蛋白，在腫瘤中特異性過表達，在正常成人組織中幾乎檢測不到[17]。但關于血清中Sema4C的表達卻少有人研究，本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫對41例正常者和286例CRC患者進行Sema4C表達水平分析，發(fā)現(xiàn)Sema4C在CRC中的表達水平顯著升高。為了探究CRC與正常體檢人員血清中Sema4C水平的關系，實驗收集了CRC患者及健康體檢者的血清檢測發(fā)現(xiàn)在CRC患者中Sema4C的表達水平顯著高于健康體檢者。同時本研究收集了CRC患者的病理資料進行統(tǒng)計分析，結果顯示，腫瘤最大直徑≥3 cm者血清Sema4C水平高于腫瘤最大直徑<3 cm者，CRCT3+T4者血清Sema4C水平高于T1+T2者，有神經(jīng)侵犯者血清Sema4C水平高于無神經(jīng)侵犯者，提升Sema4C可能參與CRC的發(fā)展過程，與CRC的腫瘤大小、T分期及神經(jīng)浸潤有關。有可能是由于Sema4C在調節(jié)癌細胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和免疫細胞遷移中起重要作用[17-18]。研究結果顯示，Sema4C在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達并且Sema4C可以特異性地與Plexin-B2結合，Plexin-B2受體在神經(jīng)管閉合和小腦顆粒細胞發(fā)育中起關鍵作用，有研究報道Sema4C可能作為顆粒細胞到顆粒細胞的旁分泌因子，其和Plexin-B2結合后可以促進小腦顆粒細胞前體的遷移，并且當敲低Sema4C或抑制其受體Plexin-B2時，會導致癌細胞G2/M相變損傷、細胞分裂缺陷、生長停滯和細胞衰老，同時Plexin-B2也會損害Sema4C控制的小腦發(fā)育[18，20]。但Sema4C如何調節(jié)癌細胞運動仍不清楚。同時本研究結果顯示，血清Sema4C診斷CRC的AUC為0.674，當最佳截斷值取1.2570時，其診斷CRC的靈敏度為60.50%，特異度為70.30%。

盡管本實驗結果提示CRC患者血清Sema4C蛋白水平高于腸道非腫瘤，血清Sema4C蛋白水平升高提示有發(fā)生深部轉移及神經(jīng)浸潤的可能，其對CRC的診斷具有一定的價值。但將血清Sema4C蛋白水平作為CRC早期診斷的生物標志物仍然需要進行大樣本深入研究，因為只有大樣本量的前瞻性研究才能進一步闡明血清Sema4C作為CRC新型診斷生物標志物的臨床價值。其次，血清Sema4C的ROC曲線下面積值較小，造成這一現(xiàn)象的原因可能與CRC的異質性、樣本量的差異以及血細胞溶血等原因有關。因此，仍需要進行大規(guī)模多中心臨床研究進一步來驗證其有效性。