基于生信數(shù)據(jù)的Toll樣受體4泛癌分析

華浩銘，王凡璐，黃江妮，彭慧，丁浩，鐘浩華，馬晶，王居平

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 百色 533000)

TLR4是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白[1]，它定位在9號(hào)染色體上。TLR4在接受包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在內(nèi)的刺激后，形成CD14/TLR4/MD-2異質(zhì)三聚體而活化，活化的TLR4經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而參與炎癥反應(yīng)、抗病毒感染、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)免疫細(xì)胞活化等重要環(huán)節(jié)[2-4]。泛癌分析通過(guò)多組學(xué)系統(tǒng)整合分析，目的在于檢查在不同腫瘤類(lèi)型中已發(fā)現(xiàn)的基因組或蛋白質(zhì)表達(dá)變化之間的相似性和差異[5]。本課題組一直在對(duì)TLRs蛋白進(jìn)行研究，并報(bào)道了TLR4、宮頸癌和免疫球蛋白G之間的功能聯(lián)系[6]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果盡管支持TLR4與不同類(lèi)型的癌癥之間存在聯(lián)系，然而目前沒(méi)有關(guān)于TLR4與各種癌癥類(lèi)型之間的具體關(guān)系的泛癌分析報(bào)道。本研究使用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)分析了TLR4在腫瘤中的表達(dá)、生存預(yù)后的相關(guān)性、基因突變、CAFs和TLR4相關(guān)的生物學(xué)功能途徑，為T(mén)LR4在不同癌癥中的發(fā)病機(jī)制以及臨床預(yù)后中的潛在分子機(jī)制提供了更加全面的理解。

1 資料和方法

1.1基因表達(dá)分析 檢索HPA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了正常組織和細(xì)胞TLR4蛋白水平表達(dá)柱狀圖、TLR4在不同免疫細(xì)胞中的分布柱狀圖、單核細(xì)胞中TLR4 mRNA主要表達(dá)柱狀圖，其中單核細(xì)胞中TLR4 mRNA主要表達(dá)柱狀圖來(lái)源于Schmiedel數(shù)據(jù)集。檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到不同癌癥或特異性癌癥亞型的腫瘤組織與鄰近正常組織之間TLR4的表達(dá)差異。在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有正常對(duì)照組織或沒(méi)有腫瘤組織的情況下如腎上腺皮質(zhì)癌(TCGA-ACC)、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(TCGA-LGG)等，使用GEPIA2(gene expression profiling interactive analysis，version 2)網(wǎng)站和GTEx(genotype-tissue expression)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得這些腫瘤組織與相應(yīng)正常組織表達(dá)差異的箱線圖。參數(shù)設(shè)置為：P-value cutoff=0.05，log2FC cutoff=1。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)臨床參數(shù)(性別、癌癥階段、轉(zhuǎn)移)評(píng)估并計(jì)算每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本的值，用Log2(TPM+1)表示，繪制了在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同癌癥患者中TLR4表達(dá)水平的箱線圖。

1.2生存預(yù)后分析 用卡普蘭-梅爾數(shù)據(jù)庫(kù)(Kaplan-Meier Plotter)分析上述TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的所有腫瘤，選擇合適的表達(dá)閾值以區(qū)分高表達(dá)人群和低表達(dá)人群(Cutoff-High=50；Cutoff-Low=50)，假設(shè)檢驗(yàn)采用 Mentel-Cox檢驗(yàn)，繪制單基因生存分析圖(Kaplan-Meier曲線)。

1.3免疫浸潤(rùn)分析 TIMER是一個(gè)對(duì)不同免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平進(jìn)行全面的分析的公共網(wǎng)站，我們通過(guò)TIMER檢索了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)所有腫瘤中TLR4的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，著重選擇了CAFs進(jìn)行詳細(xì)分析，應(yīng)用EP- IC、MCPCOUNTER、XCLL和TIDE算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估。腫瘤純度是本分析中主要的混雜因素[7]，根據(jù)純度調(diào)整后的Spearman’s等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)得到P值和偏相關(guān)系(partialcorrelation，COR)值。數(shù)據(jù)以熱圖和散點(diǎn)圖的形式展現(xiàn)。

1.4基因改變分析 使用cBioPortal工具收集所有TCGA腫瘤TLR4基因結(jié)構(gòu)的突變頻率、突變類(lèi)型、突變位點(diǎn)信息和拷貝數(shù)改變。比較TLR4基因突變是否導(dǎo)致TCGA癌癥病例中的總體生存率(overall survival，OS)、無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)、無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和疾病特異生存率(disease-specific survival，DSS)發(fā)生改變。

1.5TLR4相關(guān)基因富集分析 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)并選擇蛋白質(zhì)名稱(chēng)和物種，這里選擇的是TLR4和人，然后最低關(guān)系分?jǐn)?shù)設(shè)置為高可信度0.700，顯示的交互對(duì)象的最大數(shù)量不超過(guò)50個(gè)，交互來(lái)源為實(shí)驗(yàn)。最后篩選得到了50個(gè)實(shí)驗(yàn)確定的與TLR4相互作用蛋白。隨后使用GEPIA2基于TCGA+GTEx聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與TLR4相關(guān)的前100個(gè)基因，并從中選取相關(guān)性高的基因與TLR4基因進(jìn)行成對(duì)基因的 Pearson相關(guān)分析。散點(diǎn)圖采用 log2TPM，給出P值和相關(guān)系數(shù)R。然后繪制所選基因的熱圖，圖中包含R值和P值。為了進(jìn)一步篩選基因，使用交互式韋恩圖(Venn diagram)查看器Jvenn將以上100個(gè)基因與能和TLR4發(fā)生相互作用的50個(gè)基因進(jìn)行交集分析，比較TLR4結(jié)合基因和相互作用基因。此外，把兩組數(shù)據(jù)合并上傳仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站(www.xiantao.love)進(jìn)行GO(gene ontoligy)/KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，繪制相關(guān)氣泡圖和柱狀圖。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。成正態(tài)分布的兩組計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1基因表達(dá)分析結(jié)果 首先分析TLR4在不同細(xì)胞系和正常組織中的表達(dá)，根據(jù)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，TLR4在骨髓中表達(dá)最高；其次是脾臟、淋巴結(jié)組織；大腦皮質(zhì)、腎上腺、唾液腺食管、扁桃體呈現(xiàn)中等程度的表達(dá)。但是TLR4在除上述以外的組織幾乎不表達(dá)，顯示出了較高的組織特異性(見(jiàn)圖1a)。在單核細(xì)胞中TLR4 mRNA主要表達(dá)在血細(xì)胞和部分器官的免疫細(xì)胞(如肝巨噬細(xì)胞)以及間質(zhì)細(xì)胞中(見(jiàn)圖1b)。此外，在分析HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中Schmiedel數(shù)據(jù)集時(shí)發(fā)現(xiàn)，TLR4 mRNA在不同血細(xì)胞中表達(dá)分布有相似的富集現(xiàn)象：即大多數(shù)在經(jīng)典的單核細(xì)胞和非經(jīng)典的單核細(xì)胞中表達(dá)較高，極少量在幼稚B細(xì)胞中，其他血細(xì)胞幾乎沒(méi)有(見(jiàn)圖1c)，這表明TLR4分布區(qū)域化的特性與它的生物功能密切相關(guān)。接下來(lái)，檢索TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)和Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，TLR4在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、乳腺浸潤(rùn)癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney Chromophobe，KICH)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)、肝細(xì)胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma，LIHC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma，THCA)、子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織(P<0.05)，在腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、胃癌(stomach adenocarcinoma，STAD)組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)(見(jiàn)圖2a和圖2b)。將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少正常組織對(duì)照的腫瘤聯(lián)合GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步評(píng)估分析發(fā)現(xiàn)，TLR4在腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)、宮頸癌(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large b-cell lymphoma，DLBC)、胸腺癌(thymoma，THYM)、子宮肉瘤(uterine carcinosarcoma，UCS)表達(dá)水平顯著低于正常組織(P<0.05)(見(jiàn)圖2c)。TLR4在多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)、急性髓細(xì)胞樣白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma，LGG)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)中表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05)(見(jiàn)圖2d)。TLR4在卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG)、肉瘤(sarcoma，SARC)、睪丸癌(testicular germ cell tumors，TGCT)中表達(dá)水平與正常組織相比沒(méi)有顯著性差異。此外在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)不同的臨床參數(shù)研究了LUAD患者組間TLR4的表達(dá)。根據(jù)性別的不同，與相應(yīng)的正常對(duì)照組相比，男性和女性肺腺癌患者都顯著下降(P<0.05)。從腫瘤分期來(lái)看，在1、2、3、4期中TLR4表達(dá)也顯著下降(P<0.05)。最后根據(jù)轉(zhuǎn)移分期來(lái)看，LUAD患者在N0、N1、N2、N3階段的TLR4表達(dá)也相應(yīng)的下降(P<0.05)(見(jiàn)圖2e)。其他腫瘤則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差異。

a：TLR4基因在不同組織中的表達(dá)；b：不同單核細(xì)胞中TLR4基因的表達(dá)；c：不同血細(xì)胞中TLR4基因的表達(dá)。數(shù)據(jù)基于HPA、GTEx和FANTOM5轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。

a：Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的腫瘤與鄰近組織中TLR4的表達(dá)水平，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；b：TIMER

2.2生存預(yù)后分析結(jié)果 由于TLR4的表達(dá)水平與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為了評(píng)估TLR4與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)繪制了單基因生存分析圖(見(jiàn)圖3a)，TLR4高表達(dá)會(huì)降低THCA、LUSC患者的OS，LUAD、UCEC患者的OS降低與TLR4低表達(dá)有關(guān)，與PCPG患者則無(wú)關(guān)。此外，從DFS數(shù)據(jù)來(lái)看，TLR4高表達(dá)與PAAD患者的DFS有關(guān)，BLCA、LIHC、UCEC患者的DFS與TLR4低表達(dá)有關(guān)，直腸腺癌(rectum adenocarcinoma，READ)患者的DFS則與TLR4表達(dá)無(wú)關(guān)(見(jiàn)圖3b)。UCEC患者的TLR4低表達(dá)顯示出總生存率和無(wú)病生存率降低的一致性。

注：使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了所有TCGA腫瘤中TLR4基因表達(dá)與OS(a)、DFS(b)之間的關(guān)系，列出了Kaplan-Meier曲線結(jié)果。

2.3免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果 TLR4通過(guò)激活下游通路Myd88/NF-κB/MMP2是經(jīng)典的腫瘤轉(zhuǎn)移通路[8]，因此TLR4表達(dá)水平或基因突變可能影響腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞反應(yīng)。腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究應(yīng)用EP- IC、MCPCOUNTER、XCLL、TIDE算法，探討了不同腫瘤與CAFs之間的相關(guān)性(見(jiàn)圖4a)。下面僅將TIDE算法的結(jié)果進(jìn)行展示，如圖4b所示，BRCA、BRCA-LumA、ESCA、HNSC、HNSC-HPV-、LIHC、LUAD、PAAD、PRAD、THYM中TLR4的表達(dá)與CAFs浸潤(rùn)都呈現(xiàn)正相關(guān)。

注：采用EP- IC、MCPCOUNTER、XCLL、TIDE算法分析TCGA中所有腫瘤中TLR4基因的表達(dá)水平與成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性熱圖(a)和散點(diǎn)圖(b)。

2.4基因改變分析結(jié)果 癌癥的發(fā)展是由于基因突變的積累，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的不同腫瘤樣本中分析到了TLR4的基因變異情況。如圖5a所示，大部分癌癥都以TLR4基因突變?yōu)橹饕儺愵?lèi)型，在SKCM中TLR4基因突變占到了總突變的14%，LUAD同樣占到了11%，值得關(guān)注的是KICH和KIRP則全部是TLR4擴(kuò)增突變，1%胰腺癌則是TLR4拷貝數(shù)缺失導(dǎo)致。進(jìn)一步分析顯示，TLR4遺傳變異類(lèi)型大多數(shù)是錯(cuò)義突變，在8號(hào)鋅指結(jié)構(gòu)域中，有1例LUSC和2例SKCM檢測(cè)出第111位點(diǎn)鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生了錯(cuò)義突變(G111-missense)(見(jiàn)圖5b)。進(jìn)一步評(píng)估TLR4的某些基因突變對(duì)LUSC腫瘤患者的臨床生存預(yù)后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有TLR4基因突變的LUSC患者的OS、DFS以及DSS與健康人相比無(wú)明顯差別(見(jiàn)圖5c)。

注：使用cBioPortal工具分析TCGA腫瘤中TLR4的突變狀態(tài)，顯示了突變類(lèi)型(a)和突變位點(diǎn)(b)的變化頻率；展示了突變位點(diǎn)(G111-missense)以及該突變位點(diǎn)與LUSC的OS、DSS和DFS之間的相關(guān)性(c)。

2.5富集分析結(jié)果 為了研究TLR4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，篩選出已知的與TLR4相互作用蛋白和TLR4表達(dá)相關(guān)基因。使用String數(shù)據(jù)庫(kù)，總共獲得了50個(gè)與TLR4相互作用的蛋白質(zhì)，圖6a顯示了這50個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)。然后利用GEPIA 2工具結(jié)合TCGA的所有腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)，獲得與TLR4相關(guān)的前100位基因。本研究分析表明，TLR4與補(bǔ)體成分3a受體1(C3AR1)(R=0.66)、細(xì)胞色素B-β鏈(CYBB)(R=0.67)、線粒體E3泛素連接酶1(MARCH1)(R=0.68)、炎癥小體4(NLRC4)(R=0.69)和胞外核苷酸ADP受體(P2RY13)(R=0.69)的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.001)(見(jiàn)圖6b)。此外，熱圖數(shù)據(jù)顯示，在大多數(shù)癌癥類(lèi)型中，TLR4與上述5個(gè)基因成正相關(guān)(見(jiàn)圖6c)。進(jìn)一步將TOP前100基因與前50個(gè)互作蛋白的基因做交集分析，最終篩選出了一位共同成員淋巴細(xì)胞抗原86(LY86)(見(jiàn)圖6d)。進(jìn)一步將上述兩組數(shù)據(jù)合并進(jìn)行GO和KEGG分析。KEGG分析顯示TLR4在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用可能與Toll樣受體信號(hào)通路、人類(lèi)免疫缺陷病毒1感染、MAPK信號(hào)通路、癌癥中PD-L1的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路有關(guān)。GO分析顯示，這些基因大多數(shù)參與免疫應(yīng)答、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾，腫瘤增殖、凋亡和自噬(見(jiàn)圖6e和圖6f)。

注：TLR4相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖；彩色節(jié)點(diǎn)表示已識(shí)別的單個(gè)蛋白質(zhì)(a)；通過(guò)GEPIA2檢測(cè)的TCGA項(xiàng)目中TLR4與代表性基因(C3AR1、CYBB、MARCH1、NLRC4和P2RY13)的表達(dá)相關(guān)性(b)，并繪制了相應(yīng)的熱圖(c)；TLR4相互作用蛋白的基因和相關(guān)基因的交叉分析圖(d)；TLR4相互作用和相關(guān)性基因的KEGG通路分析(e)和GO分析(f)。

3 討論

自20世紀(jì)末TLR4發(fā)現(xiàn)之日起，關(guān)于TLR4的研究就從未停歇，先前的研究表明，TLR4是人體天然免疫重要組成部分，對(duì)機(jī)體免疫自穩(wěn)有著不可替代的重要作用。隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，TLR4在癌癥中起著雙刃劍的作用，TLR4一方面監(jiān)視和殺滅腫瘤細(xì)胞，另一方面也“幫助”腫瘤細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移。目前少有關(guān)于從整體角度對(duì)TLR4進(jìn)行泛癌分析的報(bào)道，由此本研究基于HPA、TCGA、Kaplan-Meier Plotter等數(shù)據(jù)庫(kù)從基因表達(dá)、基因變異等角度對(duì)不同腫瘤中的TLR4進(jìn)行全面的分析[9]。

TLR4在人體組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出了獨(dú)特的組織特異性，即固有免疫器官和細(xì)胞的組織特異性，這與它的主要生物功能密不可分。同時(shí)，分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤組織中的TLR4表達(dá)水平，由于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)缺失了部分正常組織的數(shù)據(jù)信息，因此補(bǔ)充了GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的正常組織作為參照一同分析。本研究分析表明，大多數(shù)癌組織(BLCA、BRCA、CHOL、KICH、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、THCA、UCEC、ACC、CESC、DLBC、THYM、UCS)的TLR4表達(dá)水平顯著低于正常組織，根據(jù)以往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)腸癌細(xì)胞表面表達(dá)TLR4，當(dāng)被LPS激活時(shí)可誘導(dǎo)活性白細(xì)胞介素12p70(IL-12p70)的合成，IL-12p70對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的產(chǎn)生具有抑制作用。IL-12p70還可以激活體內(nèi)NK細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，并促進(jìn)對(duì)腫瘤的特異性CTL細(xì)胞的殺傷作用[10-12]。此外，牛分枝桿菌(卡介苗)通過(guò)TLR4促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，產(chǎn)生特異性活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡反應(yīng)，目前正用于治療非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌[13]；TLR4過(guò)表達(dá)抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌的體外增殖和遷移，延緩腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)[14]。但是也有文獻(xiàn)報(bào)道，LPS通過(guò)TLR4/MD-2信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC 7901的CXC趨化因子受體7表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]；TLR4的表達(dá)與胰腺癌腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈常正相關(guān)，并且與HIF-1α信號(hào)通路協(xié)同促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展[16]。這些有爭(zhēng)議的結(jié)果表明，TLR4在不同癌癥類(lèi)型或者癌癥亞型中發(fā)揮著不同的作用。雖然在CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有檢索到TLR4總蛋白和磷酸化數(shù)據(jù)結(jié)果，但這不意味著TLR4不能發(fā)生翻譯后修飾，以往的文獻(xiàn)表明TLR4可以發(fā)生磷酸化修飾[17]，本課題組先前也發(fā)現(xiàn)TLR4可發(fā)生乙?；揎?，該修飾正向調(diào)控NF-κB促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生[18]。

LANKI M A等[19]發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)強(qiáng)度與預(yù)后不良及發(fā)育不良程度有關(guān)；在胰管腺癌中，TLR4可作為早期腫瘤患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[20]；在濾泡性甲狀腺腫瘤中，TLR4與腫瘤的原發(fā)轉(zhuǎn)移和侵襲性有關(guān)[21]。本研究對(duì)TLR4在癌癥患者中的預(yù)后情況分析后也證實(shí)了TLR4高表達(dá)與THCA患者的預(yù)后不良有關(guān)(P=0.011)。此外，在子宮內(nèi)膜癌患者中TLR4低表達(dá)顯示了OS和DFS降低的一致性，為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的整體生存提供了一個(gè)可能的臨床生物標(biāo)志物。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，不管TLR4基因是否突變都不直接影響肺鱗癌患者生存差異，以8號(hào)鋅指結(jié)構(gòu)域中第111號(hào)位點(diǎn)鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生了錯(cuò)義突變?yōu)槔琇USC患者的OS、DFS、DSS無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其主要原因可能是基因突變是隨機(jī)的，其相同位點(diǎn)突變的病例數(shù)太少，因此需要更多的病例數(shù)來(lái)確定TLR4基因突變是否增加預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。

CAFs是腫瘤微環(huán)境中一類(lèi)重要的非造血類(lèi)基質(zhì)細(xì)胞群體，某些炎癥因子可促進(jìn)CAFs活化，如白細(xì)胞介素-1通過(guò)NF-κB作用于JAK-STAT信號(hào)通路促進(jìn)CAFs的激活[22]。CAFs能夠調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生、影響血管生成和對(duì)藥物治療產(chǎn)生耐藥反應(yīng)等，因此CAFs的活化與大部分癌癥患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化不良密切相關(guān)。TLR4在絕大多數(shù)腫瘤中表達(dá)水平都與CAFs浸潤(rùn)呈明顯正相關(guān)，這表明TLR4與CAFs浸潤(rùn)之間的相關(guān)性是癌癥依賴(lài)性的，因此在CAFs介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)干擾TLR4正常功能進(jìn)行免疫逃逸。TLR4除了參與經(jīng)典的Toll樣受體通路，還參與了B細(xì)胞和T細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答通路。ARORA H等[23]研究表明，泛素化修飾也可以調(diào)控TLR4信號(hào)通路抑制膿毒血癥導(dǎo)致的休克。KEGG和GO分析結(jié)果也顯示，TLR4不僅僅局限在天然免疫信號(hào)通路調(diào)節(jié)中，還廣泛的參與除上述以外的自噬、DNA轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯后修飾和各種囊泡活動(dòng)中，這表明TLR4具有廣泛生物學(xué)活性和作為治療靶點(diǎn)的價(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)多種生物信息學(xué)分析方法對(duì)TLR4進(jìn)行泛癌分析。分析結(jié)果表明，TLR4在癌癥中廣泛低表達(dá)，與臨床預(yù)后、CAFs浸潤(rùn)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，這有助于人們從臨床角度認(rèn)識(shí)TLR4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色，至于TLR4基因突變與腫瘤患者的臨床生存預(yù)后相關(guān)性還有待進(jìn)一步探究。