離子色譜法測(cè)定藥品中抗壞血酸

舒開(kāi)繼，黃選忠

(湖北興山縣疾病預(yù)防控制中心，湖北興山 443700)

抗壞血酸(維生素C)是維持機(jī)體正常生理功能的重要維生素之一，它廣泛參與機(jī)體內(nèi)多種氧化還原等復(fù)雜的代謝過(guò)程，具有重要的生理功能，包括促進(jìn)膠原蛋白合成、加速傷口愈合、促進(jìn)鐵的吸收和葉酸的利用，增加造血功能等，在臨床上主要用于治療壞血病、特發(fā)性高鐵血紅蛋白血癥、肝硬化、急性肝炎和化學(xué)中毒所至的肝損傷等，也可用于肝炎、腦炎等病毒性傳染病及紫癜的輔助治療，因此準(zhǔn)確測(cè)定藥品中抗壞血酸的含量對(duì)保障患者治療效果具有重要意義。

目前測(cè)定抗壞血酸的主要方法有碘量法[1]、分光光度法[2-3]、電化學(xué)法[4]、高效液相色譜法[5-7]、離子色譜法[8-10]等，其中，碘量法、分光光度法選擇性差，電化學(xué)法、高效液相色譜法需要專(zhuān)用儀器，離子色譜-直流安培檢測(cè)法[8]和離子色譜-間接熒光檢測(cè)法[9]雖然有較高的檢測(cè)靈敏度，但均需要專(zhuān)用檢測(cè)器，不便推廣應(yīng)用。離子色譜-電導(dǎo)檢測(cè)法[10]線(xiàn)性范圍為50～500 mg/L，不適用于抗壞血酸含量在50 mg/L 以下樣品的檢測(cè)。

筆者以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱，以12.0 mmol/L NaHCO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL/min，采用等度洗脫的方式可使抗壞血酸與氟化物、乙酸鹽、氯化物、亞硝酸鹽、溴化物、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等常見(jiàn)陰離子及苯甲酸、草酸等完全分離，采用CIC-100 型色譜儀測(cè)定藥品中抗壞血酸含量，線(xiàn)性范圍為3.0～500.0 mg/L，比文獻(xiàn)[10]的線(xiàn)性范圍(50～500 mg/L)更寬，可測(cè)定質(zhì)量濃度低至3 mg/L 的抗壞血酸。該方法滿(mǎn)足維生素C 針劑和片劑中抗壞血酸含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC-100 型，附SHY-2 型自再生抑制器，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

定量環(huán)體積：25 μL，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

自動(dòng)進(jìn)樣器：SHA-15 型，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

電子天平：BT214D 型，感量為0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

電子天平：JA2003 型，感量為1 mg，上海菁海儀器有限公司。

濾膜過(guò)濾器：孔徑為0.45 μm ，直徑為13 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。抗壞血酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。草酸(H2C2O4·2H2O)：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磷酸二氫鉀、溴化鉀、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

水中硝酸鹽氮溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、水中氟化物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、水中氯根成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、水中硫酸根成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、食品防腐劑苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，編號(hào)分別為NIM-RM 3058、GBW(E) 080549、GBW(E) 080268、GBW(E) 080266、GBW(E) 100006，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

水中亞硝酸鹽氮成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量濃度為100 mg/L，編號(hào)為GBW(E) 080223，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

碳酸氫鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

維生素C針劑：0.5 g/(2 mL)，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。

維生素C片劑：0.1 g/片，華中藥業(yè)股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水為高純水，電阻率為18.2ΜΩ·cm。

1.2 儀器工作條件

色譜分離柱：SH-AC-3 型陰離子交換柱(250 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司)；保護(hù)柱：SH-AC-3 型柱(50 mm×4.0 mm，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司)；淋洗液：12.0 mmol/L NaHCO3溶液，流量為1.0 mL/min；柱箱溫度：30 ℃；電流強(qiáng)度：75 mA；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器：全定量環(huán)取樣，取樣后清洗(每針之間)，置換量為70 μL；進(jìn)樣體積：25 μL；進(jìn)樣深度：4 mm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，稱(chēng)取0.140 1 g 草酸，用高純水溶解并定容至100 mL。

H2PO4-標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，稱(chēng)取磷酸二氫鉀(于105 ℃烘烤2 h) 0.140 2 g，用高純水溶解并定容至100 mL。

Br-標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，準(zhǔn)確稱(chēng)取溴化鉀(于105 ℃烘烤2 h) 0.148 9 g，用高純水溶解并定容至100 mL。

乙酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，稱(chēng)取乙酸鈉(CH3COONa·3H2O) 0.230 5 g，用高純水溶解并定容至100 mL。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，稱(chēng)取0.100 0 g抗壞血酸，溶解于高純水并定容至100 mL。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：100.0 mg/L，將抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用高純水稀釋制得，臨用現(xiàn)配。

抗壞血酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液0.30、0.50、1.00 mL 及抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.30、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 只10 mL容量瓶中，加入高純水定容至標(biāo)線(xiàn)，混勻，配制成抗壞血酸質(zhì)量濃 度分別為3.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)繪制

分別取抗壞血酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.5 mL于樣品瓶中，啟動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，在1.2 儀器工作條件下分別測(cè)定，以抗壞血酸質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

1.3.3 樣品處理

取維生素C 片劑10 片，用高純水溶解，充分?jǐn)嚢韬螅ㄈ葜? 000 mL，濾去不溶物，取濾液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

吸取維生素C 針劑1.00 mL，用高純水定容至100 mL，溶液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.4 樣品測(cè)定

取1.3.3 中的樣品溶液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后加入樣品瓶中，啟動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算抗壞血酸的色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量。同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 淋洗液

在堿性條件下，抗壞血酸易發(fā)生降解反應(yīng)生成草酸，影響抗壞血酸的準(zhǔn)確測(cè)定，文獻(xiàn)[11]曾報(bào)道在15.0 mmol/L NaHCO3溶液(pH 約為8.3)中抗壞血酸在80 min 內(nèi)未降解為草酸。為盡量減少抗壞血酸的降解反應(yīng)，選擇NaHCO3溶液為淋洗液，并對(duì)NaHCO3溶液濃度進(jìn)行試驗(yàn)考察，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同淋洗液濃度時(shí)待測(cè)組分保留時(shí)間(t)與分離度(R)

由表1 可知，NaHCO3溶液濃度分別為10.0、12.0、15.0 mmol/L 時(shí)，抗壞血酸均能與氟化物、氯化物完全分離，3 種NaHCO3溶液濃度下，氟化物色譜峰分離度分別為3.96、3.72 和3.28，抗壞血酸色譜峰分離度分別為3.34、3.17 和2.88，滿(mǎn)足相鄰組分完全分離(R≥1.5)的要求[12]，故選擇12.0 mmol/L NaHCO3溶液為淋洗液。在此淋洗條件下抗壞血酸、氟化物、氯化物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1 所示。

圖1 抗壞血酸、氟化物、氯化物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.1.2 淋洗液流量

考察淋洗液流量分別為0.8、1.0、1.2 mL/min 時(shí)各組分的分離情況，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，隨著淋洗液流量的增加，各組分的保留時(shí)間(t)逐漸縮短，且氟化物、抗壞血酸的色譜峰分離度(R)均在1.5以上，表明各組分能完全分離。在保證抗壞血酸與其它離子良好分離的前提下，為保證組分有較短的保留時(shí)間和較高的色譜峰分離度、系統(tǒng)有較低的壓力，選擇淋洗液流量為1.0 mL/min。

表2 不同淋洗液流量時(shí)待測(cè)組分保留時(shí)間(t)與分離度(R)

2.1.3 柱箱溫度

考察柱箱溫度分別為25、30、35、40 ℃時(shí)各組分的分離效果，結(jié)果顯示，隨著柱溫的升高，抗壞血酸的保留時(shí)間稍微延長(zhǎng)，色譜峰面積及色譜峰分離度均逐漸減小，與鄰苯二甲酸根[13]、草酸[14]、對(duì)氨基苯磺酸[15]和巴比妥酸[16]的試驗(yàn)結(jié)果正好相反，可能與溫度較高時(shí)抗壞血酸穩(wěn)定性降低從而加速降解有關(guān)?？紤]到較高溫度時(shí)抗壞血酸更容易發(fā)生降解反應(yīng)，同時(shí)便于柱溫的控制，選擇柱箱溫度為30 ℃。

2.1.4 色譜柱

以12.0 mmol/L 的NaHCO3溶液為淋洗液、流量1.0 mL/min，等度洗脫，分別考察SH-AC-1 型和SH-AC-3 型陰離子交換柱對(duì)抗壞血酸與其它常見(jiàn)陰離子的分離效果。結(jié)果表明，SH-AC-1 型陰離子交換柱雖然能將抗壞血酸與氟化物、氯化物等常見(jiàn)陰離子完全分離，但抗壞血酸的檢測(cè)靈敏度明顯偏低，故選擇SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱。

2.2 共存物質(zhì)影響

配制含抗壞血酸100 mg/L，硝酸鹽、亞硝酸鹽各10 mg/L，氯化物5 mg/L，溴化物、苯甲酸、草酸各20 mg/L，硫酸鹽、乙酸鹽、H2PO4-各40 mg/L，氟化物2 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1.5 mL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品瓶中，啟動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣測(cè)定，考察抗壞血酸與上述8 種常見(jiàn)陰離子和2 種有機(jī)酸的分離效果，結(jié)果表明，在試驗(yàn)條件下，抗壞血酸與上述8 種常見(jiàn)陰離子和2 種有機(jī)酸可以完全分離，但H2PO4-、硫酸鹽和草酸的保留時(shí)間分別長(zhǎng)達(dá)55、110、152 min，其余7 種組分的色譜圖如圖2 所示。由圖2 可以看出，氟化物和乙酸鹽的出峰順序均在抗壞血酸之前，其余5 種組分的出峰順序均在抗壞血酸之后，其中苯甲酸與硝酸鹽完全不能分離，二者合并為一個(gè)峰，由此可見(jiàn)所考察的10 種物質(zhì)均不影響抗壞血酸的測(cè)定。

圖2 抗壞血酸與常見(jiàn)陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 線(xiàn)性方程與檢出限

按照1.3.2 方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)。測(cè)定儀器工作30 min 的基線(xiàn)平均噪聲[17]，以3 倍基線(xiàn)噪聲除以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率作為抗壞血酸的檢出限。結(jié)果表明，抗壞血酸的線(xiàn)性范圍為3.0～500.0 mg/L，線(xiàn)性方程為y=11 820x-52 060，相關(guān)系數(shù)為0.999 3，檢出限為2.7 mg/L。50.0 mg/L抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖3 所示。

圖3 50.0 mg/L 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

按1.3.3 和1.3.4 操作步驟，對(duì)維生素C 針劑和片劑中抗壞血酸含量各平行測(cè)定5 次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。在樣品中分別添加25.0、50.0、100.0 mg/L 的抗壞血酸，測(cè)定并計(jì)算加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，樣品加標(biāo)回收率為95.1%～101.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.55%～2.79%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性良好。維生素C 針劑、片劑加標(biāo)樣品色譜圖如圖4 所示。

表3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

圖4 維生素C 針劑、片劑加標(biāo)樣品色譜圖

3 結(jié)語(yǔ)

以SH-AC-3 型陰離子交換柱為分離柱，以12.0 mmol/L NaHCO3溶液為淋洗液，流量為1.0 mL/min等度洗脫，建立了離子色譜-抑制電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定藥品中抗壞血酸。該方法應(yīng)用于維生素C 針劑和片劑中抗壞血酸含量測(cè)定，回收率高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便、快速，有推廣價(jià)值。