尖翅燕魚染色體核型分析

高 杰，郭華陽，劉明鑒，朱克誠，劉寶鎖，張 楠，郭 梁，劉 波，張殿昌，3，4

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島 066003；3.三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南三亞 572019；4.廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510300）

尖翅燕魚（Platax teira）又稱長蝙蝠，為在熱帶和溫帶海岸附近生存的海水魚，屬鱸形目（Perciformes），鱸 亞 目（Percoidei），白 鯧 科（Ephippidae），燕魚屬［1］，在阿拉伯海、印度尼西亞到日本海等熱帶和溫帶開放水域均有發(fā)現(xiàn)。它們主要生活在水深20 m以內(nèi)的水域。其性情溫順，游動緩慢，屬于雜食性動物，主要食物來源為藻類和小型底棲無脊椎動物。作為新興的養(yǎng)殖品種，該魚在幼年時形態(tài)奇特，可以作為觀賞魚；而其成魚肌肉蛋白含量高、肉質(zhì)鮮美，市場潛力巨大。隨著人工繁育技術(shù)的發(fā)展，在中國海南和東南亞諸多國家均實現(xiàn)了人工繁育及養(yǎng)殖，已成為深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖最有發(fā)展?jié)摿Φ聂~類之一。目前有關(guān)尖翅燕魚的研究多集中于發(fā)育生物學(xué)［1］和形態(tài)學(xué)［2］等方面，在遺傳學(xué)方面尚未見相關(guān)報道。

染色體是遺傳物質(zhì)的載體，可以從其數(shù)目和形態(tài)來判斷物種的進化程度，在魚類遺傳學(xué)中起著重要的作用［3］。染色體核型主要由染色體長短臂、臂比、染色體相對長度等組成，某一機體體內(nèi)染色體可通過相機拍攝的方式，獲得其相對恒定的染色體圖像。魚類染色體有數(shù)量多、個體小、拍攝難度大等特點，致使研究進展相對緩慢。近年來，對鱸形目魚類染色體研究較多，但染色體形態(tài)數(shù)目不盡相同。本研究通過對尖翅燕魚的染色體核型特征進行研究，旨在為尖翅燕魚系統(tǒng)分化、進化地位等提供基礎(chǔ)信息，同時為尖翅燕魚育種工作提供細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗于2021年7月在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地進行，共取8尾4月齡的尖翅燕魚用于染色體核型分析，體質(zhì)量（30.56±2.37）g，體長（12.70±0.59）cm。采集實驗樣品后為防止尖翅燕魚發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，暫養(yǎng)2 d待魚體穩(wěn)定后再進行實驗，養(yǎng)殖過程中水溫27～30℃，pH 8.2～8.4，溶氧5.0～5.5 mg·L-1，鹽度30‰，氨氮含量＜0.02 mg·L-1，亞硝酸鹽含量＜0.005 mg·L-1。

1.2 染色體標(biāo)本制備

實驗參照林義浩等［4］腎細(xì)胞直接制片法，并略加改進：1）實驗魚分為兩組，每組4尾，第1組將實驗用魚進行麻醉，從實驗魚背鰭基部注射植物血凝素（phytohaemagg lutinin，PHA）溶液（0.75% NaCl配制濃度為2.5 mg·mL-1），劑量按魚體質(zhì)量15μg·g-1注射，注射后20 h進行第2次PHA注射，注射部位與劑量同第1次。第2次注射PHA 5 h后在同一部位注射秋水仙素溶液（0.75% NaC1配制濃度為125 mg·mL-1），劑量按魚體質(zhì)量2.5 mg·g-1注射。第2組使用不同組織浸泡法［3］，直接剪去鰭條和鰓組織，置于250 mg·mL-1秋水仙素溶液中浸泡40 min后備用。2）第1組斷尾失血：注射秋水仙素溶液3 h后把實驗魚剪尾放血10 min，魚死前取出頭腎，用生理鹽水反復(fù)洗滌。3）制備細(xì)胞懸液：將組織塊置于裝有少許生理鹽水的培養(yǎng)皿中，兩手各持1把鑷子，分別將頭腎、鰓絲和鰭條反復(fù)拉撕分散組織，加入生理鹽水，用250目尼龍紗絹過濾。4）低滲處理：0.075 mol·L-1KC1低滲處理30 min。5）固定：在低滲液中加少許固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1，體積比），用吸管吹打進行預(yù)固定，隨后離心8 min，棄上清液，加固定液，離心，重復(fù)2次。6）滴片：將細(xì)胞懸浮液滴于事先在4℃冰箱預(yù)冷的載玻片上，馬上在酒精燈上過火。自然干燥后用10% Giemsa染液染色30 min，蒸餾水緩慢沖洗，自然干燥后置于LEICA DM4000B顯微鏡下觀察拍照。

1.3 染色體核型分析

在顯微鏡下觀察染色體制片并拍照，選擇分散均勻、長度適中、形態(tài)明確的分離相進行鏡檢。用Photoshop CS6軟件對染色體進行分析，染色體的數(shù)量是根據(jù)眾數(shù)原則來計算的［5］。確認(rèn)著絲點的位置，測量和計算每條染色體的相對長度和臂比，并根據(jù)LEVAN等［6］的標(biāo)準(zhǔn)對它們進行配對。根據(jù)臂比將染色體分為4組。1）中部著絲粒染色體（metacentric chromosomes，m），臂比為1.0～1.70；2）亞 中 部 著 絲 粒 染 色 體（submetacentric chromosomes，sm），臂比為1.71～3.00；3）亞端部著絲粒染色體（subtelocentric chromosomes，st），臂比為3.01～7.00；4）端部著絲粒染色體（telocentric chromosomes，t），臂比≥7.00。m和sm染色體的臂數(shù)為2，t和st染色體的臂數(shù)為1。相對染色體長度＝（1條染色體的長度×2／所有染色體的總長度）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖翅燕魚染色體數(shù)目

鏡檢共獲得110個分散良好的染色體并對其進行計數(shù)（表1），其中95個分裂項（占比86.36%）有48條染色體，11個分裂項（占比10%）染色體數(shù)少于48條，4個分裂項（占比3.64%）的染色體數(shù)多于48條，因此確定尖翅燕魚的二倍體染色體數(shù)為2n＝48（圖1，左）。

表1 尖翅燕魚中期染色體數(shù)目計數(shù)結(jié)果Tab.1 Results of themetaphase chromosome number of Platax teira

2.2 尖翅燕魚染色體核型

尖翅燕魚24對染色體中相對長度最大的為4.67±0.220，最小的為1.90±0.213。如圖1（右）所示，尖翅燕魚的染色體核型為2n＝48 t，染色體臂數(shù)NF＝48。所有48條染色體均為端著絲粒型（t型），臂比為∞（“∞”表示臂比＞7.0），而且未出現(xiàn)存在差異的性染色體。表2為染色體的相對長度和臂比。

表2 尖翅燕魚各染色體的相對長度及臂比（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.2 Relative length and arm ratio of chromosomes of Platax teira（mean±SD）

圖1 尖翅燕魚染色體中期細(xì)胞分裂相形態(tài)（左）和核型圖（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）of Platax teira

2.3 不同取材方法對制片效果的影響研究

實驗用頭腎、鰭條和鰓組織獲取制片，共獲取110個中期細(xì)胞相，95個來源于第1組腎組織，占比86.4%。15個來源于第2組鰓組織和鰭條組織，占比13.6%，其中12個來源于鰓組織，占比10.9%；3個來源于鰭條組織，占比2.7%。表明在本實驗條件下，尖翅燕魚染色體制備直接注射法優(yōu)于組織浸泡法。

3 討論

本研究揭示了尖翅燕魚染色體核型是由24對端著絲粒染色體組成，是鱸形目中最常見的染色體核型［6］。迄今為止，有記載的鱸形目魚類研究中，大約60%的物種為48條單臂（端著絲粒）染 色 體 核 型［7-29］（附 錄Ⅰ），如 雀 鯛 科（Pomacentridae）、鯛科（Sparidae）和石首魚科（Sciaenidae）等［30］。致使非眾數(shù)染色體分項出現(xiàn)的原因有以下幾種：一是秋水仙素和PHA的濃度：使用高濃度秋水仙素和PHA或處理時間過長會影響染色體大小，難以確定著絲粒的位置，導(dǎo)致染色體的數(shù)量增加；使用較低濃度的秋水仙素和PHA或處理時間較短可能會誘導(dǎo)染色體畸變，從而導(dǎo)致觀察到的中期染色體數(shù)量減少。二是滴片過程中的高度，該因素會影響染色體擴散程度，有研究表明［3］，15 cm被認(rèn)為是最佳的滴片高度。三是制片過程中壓片沖擊可導(dǎo)致染色體丟失或重疊致使計數(shù)不準(zhǔn)確［4］。

附錄Ⅰ 36種鱸形目魚的染色體特征AppendixⅠ Chromosome characteristics of 36 species of Perciformes fishes

染色體多樣性的研究對不同魚種的分類、進化和相互關(guān)系都有著重要意義，并且能為魚類的遺傳選擇提供細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)［31-32］。然而，在比較不同研究的種間或種內(nèi)的著絲粒染色體數(shù)目時應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎，因為置信區(qū)間的確定可能取決于染色體收縮程度［4］。染色體制片成功的前提是獲取細(xì)胞分裂快、代謝活動旺盛的組織［33］，頭腎作為硬骨魚重要的造血和免疫器官，細(xì)胞分裂速度較快，因而為制片首選。本實驗表明，通過對鰭條和鰓組織的浸泡處理也可完成制片，而就鰭條和鰓組織而言，其制片結(jié)果也存在差異，鰓組織的制片效果略優(yōu)于鰭條組織，造成該結(jié)果的原因可能是尖翅燕魚鰭條過大，細(xì)胞分裂較慢，從而影響了實驗結(jié)果。蔣俊等［34］利用鰓組織成功制備了鳳鱭（Coiliamystus）的染色體標(biāo)本，獲得了理想的分裂項細(xì)胞，可見鰓組織是尖翅燕魚制備染色體核型的理想組織。鰓組織制片與腎組織制片相比，用鰓組織作為實驗材料，可降低實驗成本，且操作簡單無需注射［35］，更適用于活力強或極易死亡品種的細(xì)胞遺傳學(xué)研究。

核型是對染色體數(shù)量和形態(tài)的描述，每種魚都有其獨特的染色體核型。有研究［11］根據(jù)真骨魚類的系統(tǒng)演化關(guān)系將染色體核型分為高位、中位、低位共3個演化類群。魚類的演化類群進化越高，其染色體數(shù)目分布表現(xiàn)為越收斂，端部著絲粒染色體越多，染色體臂數(shù)越少［36］。李樹深等［37-38］在研究中指出，在特定的分類階元中，端部著絲粒染色體占據(jù)大部分時，該魚屬于原始類型，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體時，被稱為是特化類型；而與染色體臂數(shù)多的類群相比，染色體臂數(shù)少的類群更可能為原始種［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，尖翅燕魚24對染色體均為端部著絲粒染色體（t型），其染色體數(shù)目極為收斂，并且染色體臂數(shù)為48，按上述分類依據(jù)劃分，尖翅燕魚屬于高位演化類群。

趙金良［40］研究表明，2n＝48的核型數(shù)量占海洋魚類核型的72%，而本研究中尖翅燕魚的核型數(shù)量與大多數(shù)海洋魚類的核型一致。本次實驗運用的樣本為尖翅燕魚幼魚，核型圖片中未發(fā)現(xiàn)異型染色體，因此推測，決定尖翅燕魚的性別基因在常染色體上。今后研究方向擬在尖翅燕魚的繁殖期以性成熟的成魚為研究材料，通過熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)對染色體進行深入研究，進一步剖析性染色體決定的類型。