分離自野生獼猴桃的釀酒酵母A12-2和BL20對(duì)獼猴桃酒品質(zhì)的影響

朱 靜，楊曉聰，陳亞藍(lán)，王閃閃

（信陽農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南信陽 464000）

獼猴桃營養(yǎng)豐富[1]，市場(chǎng)接受度高，有廣闊的市 場(chǎng)應(yīng)用前景。目前，我國獼猴桃的種植面積位于世界第1位，年產(chǎn)量居世界第4位，主要分布在河南、陜西秦嶺區(qū)域等區(qū)域[2]，獼猴桃銷售方式以鮮銷為主，然而由于貯藏技術(shù)有限，導(dǎo)致大量次果鮮銷困難[3]，因此，加大果實(shí)加工產(chǎn)品的開發(fā)，對(duì)于獼猴桃資源的利用有很大的意義和前景[4]。目前針對(duì)獼猴桃的加工產(chǎn)品主要涉及果汁、果酒、果干、果脯、果醬、果糕等[2,5]，其中果酒具有加工利用率高，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)價(jià)值高[6]，市場(chǎng)前景廣闊的特點(diǎn)。釀造果酒的質(zhì)量主要與釀造時(shí)選用的酵母品種有關(guān)，采用普通酵母釀造的獼猴桃果酒發(fā)酵性差[7-8]，因此，較多的研究集中在獼猴桃釀酒酵母品種的分離純化和選育[4,9]上，而關(guān)于獼猴桃釀酒酵母在釀造工藝及其工藝參數(shù)優(yōu)化[9]和野生獼猴桃酵母菌種與商用酵母特性對(duì)比的研究較少。已報(bào)道分離純化的獼猴桃釀酒酵母主要有菌株1-21和1-31[9]、野生酵母JM11[10]、菌株Q3[11]以及菌株GT-1、GT-2等[12]，但上述酵母釀造的果酒還存在色澤較淺、VC和酒精產(chǎn)量低、發(fā)酵效果并不理想等問題。

本試驗(yàn)以前期從大別山區(qū)野生獼猴桃中分離的專用酵母 A12-2和 BL20（以下簡(jiǎn)稱 A12-2、BL20）為研究對(duì)象，與商用酵母：安琪果酒專用酵母RW、安琪酵母RV002（以下簡(jiǎn)稱RW、RV002）對(duì)比，通過測(cè)定發(fā)酵過程中的總酸、酒精度、糖度、pH、VC、揮發(fā)性香氣成分，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，闡述A12-2和BL20的發(fā)酵特性及其對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響，為野生獼猴桃專用酵母和獼猴桃果酒的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安琪果酒專用酵母RW、安琪酵母RV002 安琪酵母股份有限公司；野生獼猴桃釀酒酵母BL20和A12-2 信陽農(nóng)林學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；野生獼猴桃 信陽商城大別山山脈采摘；白砂糖 購自當(dāng)?shù)匚鱽喅?；偏重亞硫酸鉀（食品?jí)） 河南禾興生物科技有限公司；檸檬酸（食品級(jí)） 廣東康達(dá)生物科技有限公司；葡萄糖、瓊脂粉、氫氧化鈉、抗壞血酸、碳酸氫鈉（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉（分析純） 天津市巴斯夫化工有限公司；YEPD培養(yǎng)基 參照蔣成等[11]的方法配制。

HH-6電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；STARTER3C pH計(jì) 奧豪斯儀器（上海）有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C1112C智城超凈工作臺(tái)、ZWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；HW遠(yuǎn)紅外干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；TG16臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；GC9800氣相色譜儀 上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母擴(kuò)大化培養(yǎng)流程 實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌菌種→菌種活化→菌種擴(kuò)大培養(yǎng)→菌種的檢驗(yàn)→菌液離心→濕菌體

1.2.2 菌種擴(kuò)大化培養(yǎng)操作要點(diǎn) 菌種活化：按郝愛玲等[13]的方法，將-80 ℃甘油保藏的酵母菌涂布接種 100 μL于YEPD平板上，30 ℃ 恒溫培養(yǎng) 2～3 d。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：挑取活化的單菌落接種于5 mL YPD試管中，30 ℃ 165 r/min培養(yǎng)過夜，即種子液。以5%的接種量，將種子液接種于150 mL YPD三角瓶中，同條件下培養(yǎng)48 h。

酵母菌種的檢驗(yàn)：用接種環(huán)挑取1環(huán)的菌液，制成水浸片，在顯微鏡下觀察，檢測(cè)菌體是否純凈。

菌液離心：在超凈工作臺(tái)中，將菌液倒入滅菌的離心管中，4000 r/min離心15 min，倒掉上清液，反復(fù)多次，至全部離心結(jié)束，將無菌水倒入帶有酵母菌沉淀的離心管，8000 r/min離心10 min，重復(fù)2～3次，棄去清液得濕菌體。

1.2.3 獼猴桃果酒發(fā)酵工藝 新鮮的獼猴桃清洗去皮，切碎打漿，加蔗糖調(diào)節(jié)糖度到20°Brix。將偏重亞硫酸鉀（60 mg/L）溶于經(jīng)滅菌（75%酒精）過的含有10 mL水的廣口瓶中，加入打漿好的獼猴桃汁液，加果膠酶（100 mg/L），50℃水浴脫膠4 h，加入檸檬酸將pH調(diào)至3.50，按1 g/L接種1.2.2中的濕菌體，22 ℃前發(fā)酵6 d，雙層紗布過濾，18 ℃后發(fā)酵6 d，用500 mg/L皂土（50 ℃熱水活化后使用）澄清，換罐、去除沉淀，15 ℃陳釀后，雙層紗布過濾后采用0.45 μm濾膜過濾除菌，即獲得成品獼猴桃果酒[14-15]。

1.2.4 理化指標(biāo)測(cè)定 總酸的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示劑法測(cè)定；可溶性固形物的測(cè)定參考Wei等[16]進(jìn)行；還原糖的測(cè)定采用斐林法[17]；VC的測(cè)定采用國標(biāo)GB5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測(cè)定》中2,6-二氯靛酚滴定法；pH的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中pH計(jì)法；酒精度的測(cè)定采用國標(biāo)GB5009.225-2016《酒中乙醇濃度測(cè)定》中酒精計(jì)法。

1.2.5 成品的揮發(fā)性香氣成分 采用氣相色譜法，參照朱靜[18]、琪安等[19]方法進(jìn)行部分揮發(fā)性物質(zhì)分析。

1.2.5.1 樣品處理 檢測(cè)時(shí)取2 mL待測(cè)樣放入5 mL頂空瓶中，每毫升樣品中加入20 μL內(nèi)標(biāo)（50 g/L 4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液）終濃度為9.8 mmol/L，在60 ℃下保溫處理30 min，使氣液平衡，然后用500 μL微量進(jìn)樣器在距液面0.3 mm處吸取300 μL頂空瓶上層氣體，注入氣相色譜儀（GC-17A/FID，SHIMADZU，日本）中，檢測(cè)揮發(fā)性化合物的殘留量。

1.2.5.2 色譜條件 色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱DB-WAX-10（φ0.53 mm×30 m），載氣 N2，進(jìn)樣量300 μL；采取程序升溫，設(shè)初始溫度為 55 ℃，在 55 ℃下保持 3 min；然后 15 ℃/min 升至 200 ℃，在 200 ℃保持3 min。

1.2.5.3 揮發(fā)物化合物含量的計(jì)算方法 對(duì)照內(nèi)標(biāo)濃度和峰面積，計(jì)算對(duì)照樣品和處理樣品中揮發(fā)性化合物無濃度，按照式（1）計(jì)算高級(jí)醇降解量。

式中：9.8 為內(nèi)標(biāo)的終濃度（mmol/L），A樣為處理樣品中的揮發(fā)性化合物峰面積，A內(nèi)為內(nèi)標(biāo)的峰面積。1.2.6 感官評(píng)價(jià) 由10位經(jīng)驗(yàn)豐富，具有專業(yè)知識(shí)的人員組成感官評(píng)定小組進(jìn)行感官評(píng)定。獼猴桃酒的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1，參照國標(biāo)GB/T15038-2006葡萄糖、果酒通用分析方法和胡小琴等[19]的方法。

表1 獼猴桃酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard for kiwi fruit wine

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)獼猴桃果酒總酸的影響

總酸（以酒石酸計(jì)）作為獼猴桃果酒發(fā)酵中的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)獼猴桃果酒口感及風(fēng)味具有重要影響。由表2可知，四種酵母菌發(fā)酵獼猴桃果酒總酸含量整體先上升后逐漸趨于平緩。1～9 d四種酵母均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，主要原因是果酒帶渣發(fā)酵，原材料中存在的乳酸菌、酵母菌利用糖產(chǎn)生乳酸[20-21]，且發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞通過EMP和HMP途徑將葡萄糖降解為丙酮酸、乳酸、檸檬酸等一些有機(jī)酸[22-24]，導(dǎo)致總酸含量增加。6 d時(shí)A12-2和BL20總酸含量高于兩種商用酵母，兩種野生獼猴桃釀酒酵母之間總酸含量差異較小，A12-2的總酸含量最高為17.23 g/L。9～12 d四種酵母總酸含量呈較平穩(wěn)狀態(tài)，原因可能是發(fā)酵后期發(fā)酵液中的糖分幾乎耗盡，故酸度漸趨于平穩(wěn)。發(fā)酵終止時(shí)的總酸含量為：RV002升至最高，為18.86 g/L；RW 次之，為18.47 g/L；A12-2 為18.17 g/L，BL20為18.16 g/L，總酸含量從高到低依次排序?yàn)镽V002＞RW＞A12-2＞BL20。

表2 前發(fā)酵和后發(fā)酵總酸含量變化Table 2 Content of total acid during pre-fermentation and post-fermentation

2.2 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)獼猴桃果酒可溶性固形物的影響

獼猴桃果酒中可溶性固形物可以反映酵母菌的生長繁殖情況及耗糖能力。由表3可知，添加A12-2、BL20和安琪RW、RV002的樣品在前發(fā)酵1～3 d的可溶性固形物含量急劇下降，而添加酵母A12-2的樣品比安琪酵母下降趨勢(shì)更大，之后降低趨勢(shì)明顯放緩至基本保持不變。主要是酵母菌生長繁殖需要大量的糖類，其會(huì)分解糖類，導(dǎo)致可溶性糖類含量急劇下降，后期因?yàn)闊o氧環(huán)境以及營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，酵母菌大量死亡，分解糖的能力降低[25]。

表3 前發(fā)酵和后發(fā)酵可溶性固形物含量變化Table 3 Content of soluble solid state material during pre-fermentation and post-fermentation

從下降趨勢(shì)來看，酵母A12-2樣品的可溶性固形物含量下降速率最快，3 d時(shí)A12-2可溶性固形物含量降至最低為7.16°Brix，說明酵母A12-2分解糖的能力較其他酵母更好，更適宜作為發(fā)酵菌種使用。后發(fā)酵階段，BL20和RW釀造的獼猴桃果酒可溶性固形物含量均降至8.5°Brix，A12-2和RV002可溶性固形物含量降至8.0°Brix，發(fā)酵終止時(shí)可溶性固形物含量從低到高依次排序?yàn)锳12-2=RV002＜BL20=RW。研究顯示，酵母菌降糖的速度與酵母菌利用糖轉(zhuǎn)化為酒精的速度即酵母菌發(fā)酵能力密切相關(guān)[26]。綜上可知，A12-2和RV002的發(fā)酵能力較強(qiáng)，BL20和RW次之。

2.3 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)獼猴桃果酒還原糖的影響

還原糖的含量也是衡量果酒發(fā)酵進(jìn)程的一個(gè)重要參數(shù)，由表4可知，四種釀酒酵母釀造的獼猴桃果酒中還原糖在1～7 d時(shí)均呈下降趨勢(shì)，7～12 d，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，四種酵母釀酒中還原糖的下降趨勢(shì)明顯放緩?？赡艿脑蚴乔捌诮湍赴l(fā)酵消耗了大量還原糖，后期酵母數(shù)量減少，因此對(duì)還原糖的利用降低。發(fā)酵中止時(shí)，四種酵母釀酒中還原糖的含量分別為：BL20為 6.35 g/L，A12-2為 6.43 g/L，RV002為6.91 g/L，RW為6.61 g/L，從高到低排序?yàn)椋篟V002＞RW＞AI2-2＞BL20。

表4 前發(fā)酵和后發(fā)酵還原糖含量變化Table 4 Content of reducing sugar during pre-fermentation and post-fermentation

2.4 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)獼猴桃果酒VC的影響

由表5可知，在1～12 d時(shí)，四種酵母菌釀造的獼猴桃果酒中VC含量均呈下降趨勢(shì)，可能原因是發(fā)酵時(shí)溫度升高以及有氧和無氧呼吸導(dǎo)致酒樣中的VC被氧化分解，A12-2和BL20釀造果酒VC含量無明顯差異，下降幅度較為平緩，且整體高于兩種商用酵母的VC含量，兩種商用酵母下降幅度較大、VC含量較低。12 d時(shí)，四種酒樣VC含量均降至最低：BL20為95.40 g/L，A12-2為 87.90 g/L，RV002為85.20 g/L，RW最低，為77.40 g/L。四種酵母釀酒中VC含量從高到低依次排序?yàn)锽L20＞A12-2＞RV002＞RW，其中BL20釀造的獼猴桃果酒中VC含量最高，RW釀造的獼猴桃果酒中VC含量最低，酵母BL20較適合釀造獼猴桃果酒。

表5 前發(fā)酵和后發(fā)酵VC含量變化Table 5 Content of VC during pre-fermentation and post-fermentation

2.5 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)獼猴桃果酒pH的影響

有機(jī)酸含量與果酒的感官品質(zhì)密切相關(guān)，對(duì)果酒的口味、風(fēng)味、香氣等有重要影響。果酒中的有機(jī)酸包括乳酸、乙酸、醋酸、檸檬酸、蘋果酸以及其他酸類物質(zhì)，有機(jī)酸的含量可通過pH反映。

由表6可知，四種酵母釀造的獼猴桃果酒的pH在前發(fā)酵過程整體無較大幅度變化，商用酵母相比于野生獼猴桃釀酒酵母波動(dòng)較小。2 d時(shí)兩種野生獼猴桃果酒pH呈下降趨勢(shì)，速度較快；3 d時(shí)BL20 pH降至 3.44；4 d時(shí) A12-2 pH降至 3.42，3～8 d時(shí)，pH下降的原因一是酵母菌發(fā)酵主要產(chǎn)生酒精，二是帶渣發(fā)酵中其他微生物代謝產(chǎn)生乙酸、乳酸、醋酸和少量二氧化碳等有機(jī)酸，三是葡萄糖酵解的一系列中間產(chǎn)物也呈酸性[21]。由表6可知，在8 d至后發(fā)酵結(jié)束，pH呈上升趨勢(shì)且變化較為平緩、差異較小，是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的推移，生成的有機(jī)酸和乙醇被利用發(fā)生酯化反應(yīng)，生成酯類物質(zhì)，使有機(jī)酸含量下降[27]。12 d時(shí)，BL20的pH最大，為3.72，從高到低依次排序?yàn)?BL20＞A12-2＞RW＞RV002。

表6 前發(fā)酵和后發(fā)酵pH變化Table 6 Content of pH during pre-fermentation and post-fermentation

2.6 釀酒酵母在發(fā)酵過程中對(duì)獼猴桃果酒酒精度的影響

果酒發(fā)酵過程復(fù)雜，發(fā)酵期間原料果漿中的糖被酵解為酒精[28]，支撐起果酒的香氣和風(fēng)味，使果酒風(fēng)味醇厚，具有結(jié)構(gòu)感。

由表7可知，各菌種達(dá)到最高酒精度的時(shí)間大概是第9～12 d，在3～8 d酒精度會(huì)大幅度提升，因?yàn)榻湍妇罅糠敝澈箝_始進(jìn)行無氧呼吸，糖被分解成酒精、二氧化碳和其他產(chǎn)物[29]。4種酵母菌的最終（12 d）酒精度從高到底依次為 A12-2＞BL20＞安琪 RW＞安琪 RV002（A12-2為 13.80%vol，BL20為13.70%vol、安琪 RW為13.00%vol、安琪 RV002為12.00%vol），但酵母菌 A12-2 在 1～10 d，酒精生成量總體高于BL2，在2～4 d期間 BL20上升最快，6 d時(shí)A12-2上升幅度最大為12.6%vol，說明酵母A12-2產(chǎn)酒精迅速，產(chǎn)酒能力較好。作為一株優(yōu)良的釀酒菌種，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到一定產(chǎn)酒量是一項(xiàng)重要的性能，所以從產(chǎn)酒力來說達(dá)到某個(gè)所需酒精度（一般果酒酒精度在9%vol～12%vol）的時(shí)間越短越好。

表7 前發(fā)酵和后發(fā)酵酒精度含量變化Table 7 Content of alcohol in pre-fermentation and post-fermentation

由表7可知，8～12 d酒精含量趨于平緩，主要原因是發(fā)酵后期酒精含量高抑制酵母菌發(fā)酵，且后發(fā)酵階段發(fā)生的酯化反應(yīng)中酒精被消耗，故發(fā)酵趨于平緩[23]。

2.7 揮發(fā)性香氣成分分析結(jié)果

獼猴桃酒中的香氣物質(zhì)包括：酯類、醇類、萜烯類、酸類及醛酮類等[30]，高級(jí)醇是酵母通過Ehrlich途徑將氨基酸或糖代謝生成[31]，苯乙醇、異戊醇和己醇的含量范圍為140.92～536.57 μg/mL，己醇具有水果香味，丁酸乙酯和己酸乙酯散發(fā)出水果味和甜味[32]。課題組主要研究正己醇等高級(jí)醇及其酯類的轉(zhuǎn)化，測(cè)定以下主要揮發(fā)性物質(zhì)，為后期酒的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。四種酒的氣相色譜圖見圖1。

圖1 發(fā)酵獼猴桃果酒狀態(tài)圖Fig.1 State diagram of fermentation kiwi fruit wine

由表8可知，四種酵母菌株釀造的獼猴桃果酒揮發(fā)性香氣成分均有己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、己醇等。四種酵母菌釀制的獼猴桃果酒所測(cè)五種揮發(fā)性物質(zhì)含量分別為25.13、34.21、14.62和23.33 mg/L，從高到低依次排序?yàn)锽L20＞A12-2＞RV002＞ RW。四種不同酵母的揮發(fā)性香氣成分含量存在一定的差異，BL20釀造的獼猴桃果酒中這五種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量最高，RW釀造的獼猴桃果酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量最低。而BL20含量最高的香氣成分為丁酸乙酯，且為獼猴桃果酒典型性香氣成分。根據(jù)周元等[33]的研究，己酸乙酯具有水果甜香味，丁酸乙酯具有梨、花香，乙酸丁酯有強(qiáng)烈的水果香氣、具先辣后甜似菠蘿味道，乳酸乙酯具有優(yōu)雅的氣味，正己醇具有水果芳香，進(jìn)一步說明BL20釀造的獼猴桃果酒香味最為濃郁。綜上所述，BL20釀造的獼猴桃果酒風(fēng)味最佳。

表8 釀酒酵母釀造的獼猴桃果酒部分香氣成分Table 8 Part aroma components of kiwi fruit wine brewed by two kinds of Saccharomyces cerevisiae

2.8 釀酒酵母對(duì)獼猴桃果酒感官評(píng)分的影響對(duì)比

由表9及圖1可知，BL20釀造的獼猴桃果酒感官評(píng)分最高為86分，其酒樣澄清透明，色澤透亮，香味最濃郁，酒體較醇厚具有典型性，品質(zhì)最佳。

表9 獼猴桃酒感官評(píng)價(jià)Table 9 Sensory evaluation of kiwi fruit wine

3 討論與結(jié)論

本文以野生獼猴桃果酒的總酸、糖度、VC、pH、酒精度、揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量為指標(biāo)，通過對(duì)比前期實(shí)驗(yàn)室保藏的野生獼猴桃釀酒酵母A12-2、BL20和普通商用酵母：安琪果酒專用酵母RW、安琪酵母RV002釀造獼猴桃果酒的品質(zhì)差異，說明野生獼猴桃釀酒酵母的發(fā)酵特性及對(duì)獼猴桃果酒品質(zhì)的影響。本文四種酵母釀造的獼猴桃果酒總酸含量均＞18 g/L，酵母RV002較馬佳佳等[22]采用徐香獼猴桃釀造果酒的總酸值高（10.3 g/L），可能是采用的獼猴桃原料不同、菌種不同等因素造成；本文四種酵母可溶性固形物至12 d時(shí)含量＞8.0°Brix，還原糖含量＜7 g/L。與周元等[33]研究相比，分解糖的能力較弱、耗糖速率略慢，后者在第9 d時(shí)可溶性固形物可降低到6～7°Brix，其起始可溶性固形物含量為 18°Brix，本文調(diào)節(jié)初始可溶性固形物含量為20°Brix。與黎星辰等[25]研究相比，分解糖的能力相當(dāng)；本文釀酒酵母BL20釀造的獼猴桃果酒VC含量為95.4 g/L，與馬榮山等[34]研究結(jié)果相比VC含量較低；本文四種酵母所釀獼猴桃酒的pH約3.6，與李影等[23]的研究相比偏低；采用A12-2和BL20釀造的獼猴桃酒的酒精度分別為13.8%vol和13.7%vol，與黎星辰等[35]的研究相比酒較高，但均在0%vol～14%vol范圍內(nèi)，說明前期篩選的A12-2和BL20產(chǎn)酒精能力較好；BL20釀酒酵母釀造的獼猴桃酒正己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯和正己醇含量分別為1.80、28.5、0.25、2.00和1.66 mg/L；BL20釀造的獼猴桃果酒感官評(píng)分最高為86分，品質(zhì)最佳。