產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類藥物的分子機制研究

張鵬 李婕 單泳源 李宇晨

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗科，蕪湖 241001)

肺炎克雷伯菌是臨床檢出率最高的腸桿菌目細(xì)菌之一，除可引起原發(fā)性肺炎外，還能引起各種肺外感染，包括菌血癥、泌尿系感染、腦膜炎和腸炎等。碳青霉烯類抗生素目前仍是臨床上治療腸桿菌目細(xì)菌感染最有效的抗菌藥物，然而近來發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumonia,CRKP)檢出率逐年增高[1]，且因其治療困難引起臨床高度關(guān)注。自2013年起，美國CDC將CRKP列為必須緊急處理的耐藥菌之一[2]。CRKP耐碳青霉烯類藥物的機制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，在中國這其中以A組絲氨酸碳青霉烯酶(KPC酶)最常見[3]。本研究收集皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院臨床分離非重復(fù)CRKP菌株，對其產(chǎn)碳青霉烯酶及ESBLs的表型進行檢測并驗證，并對CRKP進行序列分型，為臨床抗CRKP精準(zhǔn)治療提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集

回顧性收集2020年1月—2020年12月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院臨床分離保存的非重復(fù)肺炎克雷伯菌株923株，使用VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定儀進行菌種鑒定，并用PCR擴增16S rRNA，將產(chǎn)物送至上海生工進行測序，根據(jù)測序結(jié)果與GenBank中序列的比對驗證菌種。藥敏試驗按《全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案(2018版)》進行，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI,2019版)推薦的腸桿菌耐藥折點，將亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度(MIC)＞2 mg/L并同時使用K-B法復(fù)核美羅培南藥敏紙片抑菌圈直徑 ≤14 mm的肺炎克雷伯菌納入CRKP范圍。質(zhì)控菌株均為本實驗室保存的菌株，產(chǎn)碳青霉烯酶表型檢測陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705，陰性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706，碳青霉烯酶基因檢測陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌1192(blaKPC)、肺炎克雷伯菌1923(blaOXA)，ESBLs基因檢測陽性質(zhì)控菌為肺炎克雷伯菌1182(blaTEM)、肺炎克雷伯菌1 5 0 7(b l aSHV)和肺炎克雷伯菌1188(blaCTX-M)。

1.1.2 主要儀器與試劑

采用法國BioMérieux VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)以及配套試劑、杭州艾康生物Promotor RTO-960實時熒光定量PCR儀、美國Bio-Rad PCR擴增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)。天壇生物藥敏紙片購于北京普納德科技有限公司，NGTest CARBA 5碳青霉烯酶檢測試劑盒購于上海復(fù)興長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，Trizol及RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基購自濟南百博生物技術(shù)股份有限公司，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自鄭州點石生物技術(shù)有限公司，MH瓊脂培養(yǎng)基為英國Oxoid公司商品配制而成。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗

使用VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)配套的革蘭陰性桿菌藥敏板測定臨床分離肺炎克雷伯菌株對常見抗菌藥物的MIC值，采用微量肉湯稀釋法測定肺炎克雷伯菌株對藥敏板未包含的藥物如多黏菌素B及頭孢他啶/阿維巴坦的MIC值。結(jié)果根據(jù)CLSI M100-S30推薦的折點進行判讀。替加環(huán)素藥敏折點參考EUCAST V11.0關(guān)于腸桿菌科細(xì)菌MIC藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)。藥敏結(jié)果中顯示碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌，采用K-B法復(fù)核，美羅培南藥敏紙片抑菌圈直徑≤14 mm的肺炎克雷伯菌被納入CRKP。

1.2.2 碳青霉烯酶表型檢測

采用膠體金免疫層析法體外定性檢測CRKP產(chǎn)碳青霉烯酶型[4]，將待測菌株與提取緩沖液混合后加入檢測卡樣本孔，待測標(biāo)本中的碳青霉烯酶與膠體金結(jié)合墊上耦聯(lián)的碳青霉烯酶單抗反應(yīng)，形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物在層析作用下沿著硝酸纖維素膜移動，固定在KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM相應(yīng)的檢測線上。陽性質(zhì)控菌采用肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705，陰性質(zhì)控菌采用肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706。

1.2.3 碳青霉烯酶耐藥相關(guān)基因的檢測

PCR法擴增CRKP菌株常見的產(chǎn)碳青霉烯酶相關(guān)基因blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP和blaNDM。按照文獻中提供的引物序列進行引物合成[5]，15 μL PCR反應(yīng)體系包括DNA模板2.0μL、P1 0.5 μL、P2 0.5 μL、 2×PCR mixture 7.5 μL、ddH2O 4.5 μL，反應(yīng)參數(shù)為95℃ 5 min、95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，35個循環(huán)，72℃延伸6 min。取PCR擴增產(chǎn)物5μL行瓊脂糖凝膠電泳并成像，同時將擴增產(chǎn)物及引物送至上海生工進行Sanger測序，結(jié)果與GenBank中序列比對加以驗證。

1.2.4 ESBLs耐藥相關(guān)基因的檢測

選取產(chǎn)KPC酶CRKP菌株，PCR法擴增產(chǎn)ESBLs相關(guān)基因blaTEM、blaSHV和blaCTX-M。按照文獻中提供的引物序列進行引物合成[6]，15 μL PCR反應(yīng)體系包括DNA模板2.0 μL、P1 0.5 μL、P2 0.5 μL、2×PCR mixture 7.5 μL、ddH2O 4.5 μL，反應(yīng)參數(shù)為95℃ 5 min、95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 90 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min。電泳分析及測序驗證如上所述。

1.2.5 多位點序列分型

針對產(chǎn)KPC酶CRKP，用PCR法擴增其高度保守的管家基因rpoB、gapA、phoE、infB、tonB、mdh和pgi。按照文獻中提供的引物序列進行引物合成[7]，15μL PCR反應(yīng)體系包括DNA模板2.0 μL、P1 0.5

μL、P2 0.5 μL、2×PCR mixture 7.5 μL、ddH2O 4.5 μL，反應(yīng)參數(shù)為95℃ 5 min、95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物進行Sanger測序并將序列結(jié)果傳至http://pubmlst.org/獲得等位基因編號，組合編號進一步查得ST結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌株對臨床常見抗菌藥物的耐藥結(jié)果

所收集923株肺炎克雷伯菌株對亞胺培南耐藥率為25.89%，對美羅培南耐藥率為24.16%，256株CRKP對亞胺培南和美羅培南耐藥率高達93.36%和87.11%。CRKP菌株對所有β-內(nèi)酰胺類藥物(含酶抑制劑)耐藥率均較高(＞95%)，對氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥率也偏高(＞70%)，但對替加環(huán)素、多黏菌素B及頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率較低，表1。

表1 肺炎克雷伯菌及CRKP菌株對臨床常見抗菌藥物的耐藥率[n(%)]Tab.1 Drug resistance of Klebsiella pneumoniae and CRKP strains[n(%)]

2.2 CRKP產(chǎn)碳青霉烯酶表型及基因型鑒定結(jié)果

256株CRKP菌株采用膠體金免疫層析法體外定性檢測碳青霉烯酶型，與PCR產(chǎn)物經(jīng)測序?qū)Ρ冉Y(jié)果正確率為100%，同時經(jīng)PCR擴增5種常見碳青霉烯酶耐藥相關(guān)基因后，其中183株KPC陽性、5株NDM陽性、25株IMP陽性，未檢出VIM和OXA-48陽性菌株。碳青霉烯酶表型檢測及相關(guān)基因部分電泳結(jié)果如圖所示(圖1)。測序結(jié)果顯示183株KPC陽性菌株均攜帶KPC-2型碳青霉烯酶，占CRKP菌株的71.48%。

圖1 部分CRKP菌株碳青霉烯酶基因檢測電泳結(jié)果Fig.1 Detection of carbapenemase gene in some CRKP strains by electrophoresis

2.3 產(chǎn)KPC酶CRKP攜帶ESBLs耐藥相關(guān)基因鑒定結(jié)果

183株KPC酶陽性CRKP經(jīng)全自動微生物分析系統(tǒng)檢測均產(chǎn)ESBLs，PCR擴增3種常見ESBLs耐藥相關(guān)基因后，有118株攜帶blaTEM-1，129株攜帶blaSHV-11，101株攜帶blaCTX-M-1，ESBLs耐藥相關(guān)基因部分電泳結(jié)果如圖2所示，其中55株產(chǎn)KPC酶CRKP菌株攜帶2種及2種以上ESBLs耐藥相關(guān)基因，占產(chǎn)KPC酶CRKP菌株的30.05%。

圖2 產(chǎn)KPC酶CRKP攜帶ESBLs基因檢測部分電泳結(jié)果Fig.2 Detection of ESBLs gene carried in KPC producing CRKP strains by electrophoresis

2.4 產(chǎn)KPC酶CRKP菌株ST分型結(jié)果

經(jīng)過MLST測序比對，183株產(chǎn)KPC酶CRKP分屬于2種ST分型，其中176株為ST11型，占96.17%，7株為ST12型，占3.83%。

3 討論

肺炎克雷伯菌是臨床分離腸桿菌目克雷伯菌屬中最常見的重要致病菌，其廣泛存在于自然界及人類呼吸道和腸道中。當(dāng)人體免疫力下降時，肺炎克雷伯菌作為條件致病菌成為患者感染的病原菌[8]。由肺炎克雷伯菌引起的感染在治療方面最有效的藥物是碳青霉烯類藥物，但隨著該類藥物在臨床的廣泛濫用，耐藥率也不斷攀升。近年來，我院臨床送檢培養(yǎng)標(biāo)本結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌占比逐年增高，且耐藥現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重。全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2014—2019年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測報告顯示肺炎克雷伯菌構(gòu)成比由13.9%增至14.3%，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率由4.5%增至10.9%[9]。我院2020年細(xì)菌耐藥統(tǒng)計結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌構(gòu)成比占19.6%，對碳青霉烯類藥物耐藥率為25%左右，均高于全國平均水平。這一結(jié)果強烈提示需要重點加強臨床CRKP防控及相關(guān)科室的感控工作。

本研究256株CRKP菌株對臨床常用抗菌藥物的體外藥敏試驗結(jié)果顯示，對所有β-內(nèi)酰胺類藥物(含酶抑制劑)耐藥率均較高(＞95%)，對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類藥物耐藥率也較高(＞70%)，這給臨床治療和院內(nèi)感控帶來了極大的挑戰(zhàn)。由于碳青霉烯類藥物的耐藥，CRKP的治療在臨床常用抗菌藥物選擇上幾乎無藥可選，有文獻報道可通過增加給藥劑量[10]、延長滴注時間、優(yōu)化給藥頻次或霧化、局部注射等[11]提高藥物濃度來達標(biāo)PK/PD，或聯(lián)合替加環(huán)素、多黏菌素抗感染治療[12-13]以及應(yīng)用新的酶抑制劑[14]。本研究顯示我院CRKP對多黏菌素和替加環(huán)素的耐藥率僅為2.34%和10.94%，對新的酶抑制劑頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率僅為3.13%，可作為臨床CRKP治療的新選擇。

CRKP主要耐藥機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，臨床常見碳青霉烯酶型有KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM等，其中我國常見的是KPC和IMP型[15]，OXA-48型主要流行于歐洲和拉丁美洲[16]，NDM和VIM型主要流行于希臘地區(qū)[17]。本研究中，我院KPC型CRKP占71.48%，是主要的耐藥機制，與目前相關(guān)文獻報道一致[18]。此外，我院IMP型CRKP占9.77%，NDM型CRKP占1.95%，未檢出VIM和OXA-48型CRKP。其中NDM型CRKP菌株耐藥是通過質(zhì)粒水平傳播的，速度快，需加強重視和監(jiān)控。另外，仍有部分CRKP菌株未檢測出產(chǎn)以上5種碳青霉烯酶，也未檢測出攜帶碳青霉烯酶耐藥相關(guān)基因，這與其OmpK35、OmpK36和OmpK37等外膜孔蛋白缺失或合并產(chǎn)AmpC酶有關(guān)[19]。Moland等[20]研究發(fā)現(xiàn)僅KPC酶通常只會引起肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物低水平耐藥，而產(chǎn)KPC酶CRKP對碳青霉烯類藥物高水平耐藥可能與合并產(chǎn)ESBLs有關(guān)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)我院產(chǎn)KPC酶CRKP菌株均至少攜帶3種ESBLs基因blaTEM-1、blaSHV-11和blaCTX-M-1中的1種，攜帶2種及2種以上ESBLs耐藥相關(guān)基因菌株占產(chǎn)KPC酶CRKP菌株的30.05%。

CRKP菌株除為臨床常見致病菌外，還可引起院內(nèi)感染，因此對CRKP進行同源性分析不僅能了解肺炎克雷伯菌的分子流行特征，還能及時發(fā)現(xiàn)耐藥菌株的暴發(fā)，為院感防控提供依據(jù)[21]。MLST是一種常用的菌株同源性分析方法，本研究對183株產(chǎn)KPC酶CRKP菌株進行ST分型，結(jié)果顯示ST11型占96.17%，為主要流行株，與國內(nèi)其他報道一致[22]。表明我院臨床科室存在ST11型CRKP不同程度的流行，應(yīng)加強相關(guān)科室醫(yī)務(wù)人員的院感防控意識。本研究將進一步對CRKP菌株來源科室及標(biāo)本類型進行詳細(xì)分類統(tǒng)計，著重確定CRKP院內(nèi)流行區(qū)域。

綜上所述，皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院臨床分離耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌主要為ST11型產(chǎn)KPC酶CRKP，且不同程度攜帶ESBLs，這些耐藥菌株治療用藥有限，致病死率較高，檢出率逐年增高，僅對替加環(huán)素、多黏菌素及新的酶抑制劑敏感，應(yīng)引起臨床高度重視抗菌藥物合理應(yīng)用。同時，我院應(yīng)進一步加強產(chǎn)KPC酶CRKP的細(xì)菌耐藥監(jiān)測工作及醫(yī)院感染管控措施，防止CRKP院內(nèi)播散流行。