動物源金黃色葡萄球菌的流行特點及耐藥機制研究進(jìn)展

李亞菲 李偉 陳林 曾振靈,*

(1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣州 510640； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥研制與評價重點實驗室，廣州 510642)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的人畜共患的條件性致病菌，能夠在人和動物的鼻腔和皮膚表面進(jìn)行定植。研究表明，50%的成年人是持續(xù)性或間歇性的金黃色葡萄球菌攜帶者[1]。金黃色葡萄球菌攜帶大量的毒力因子，能夠引起廣泛的感染，從常見的皮膚感染如癤病和膿瘡等，到嚴(yán)重的深部感染，如心肌炎、肺炎和乳房炎等[2]。獸醫(yī)臨床上，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎[3]等動物疾病重要的病原菌。作為對人和動物健康最具威脅的細(xì)菌之一，金黃色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA)的耐藥性問題，不僅對臨床治療造成影響，而且已成為影響公共衛(wèi)生安全問題之一。

我國不同來源的動物養(yǎng)殖場環(huán)境、動物糞便拭子、屠宰場、寵物醫(yī)院等分離的金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)多重耐藥的特點。王豪舉等[4]對重慶市動物源金黃色葡萄球菌流行調(diào)查表明，25株金黃色葡萄球菌對常用23種抗菌藥呈現(xiàn)不同程度耐藥，其中氨芐西林、青霉素G、四環(huán)素、強力霉素、林可霉素的耐藥率超過60%。李淑敏等[5]調(diào)研了我國6個省份食品動物源金黃色葡萄球菌的分離特點及耐藥情況，其中MRSA菌株對常見的抗菌藥物如氟苯尼考、四環(huán)素、慶大霉素等的耐藥率超過90%。我國幅員遼闊，各地區(qū)流行情況不盡相同，金黃色葡萄球菌的流行和耐藥特征常處在動態(tài)變化中。同時，動物源耐藥金黃色葡萄球菌可傳播給動物密切接觸者，也可通過食品鏈在消費者中傳播，進(jìn)而可能在人群中擴散，這無疑增加了耐藥性散播的風(fēng)險。因此，有必要了解動物源金黃色葡萄球菌的流行特點及其耐藥特征，并對其進(jìn)行長期監(jiān)測，以降低耐藥菌株傳播的風(fēng)險。

2 金黃色葡萄球菌的分子分型及流行特點

金黃色葡萄球菌在不同地區(qū)的流行有一定的規(guī)律性，分子分型能夠揭示菌株間的親緣關(guān)系，有利于研究菌株的流行分布和傳播機制。目前金黃色葡萄球菌的分子分型方法主要有多位點序列分型(mutilocus sequence typing，MLST)、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、spa分型，以及用于MRSA分型的SCCmec分型和dru分型等。

在2005年荷蘭出現(xiàn)豬源MRSA感染人的病例[6]以前，動物源金黃色葡萄球菌并未引起足夠的重視，但隨著動物源MRSA感染人的報道逐漸增多，畜禽相關(guān)MRSA(livestock associated MRSA，LA-MRSA)逐漸引起人們的重視，并在世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注。LAMRSA不僅能夠在畜禽之間相互傳播，還可以定植感染人，對公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅。

我國LA-MRSA的主要流行克隆型為ST9-t899。Cui等[7]調(diào)查了我國陜西、河北、四川和湖北地區(qū)養(yǎng)殖場和屠宰場中豬源和人源MRSA的攜帶情況，分離獲得的MRSA均為t899型，包括同屬于CC9克隆系的3種ST型(ST9、ST1376和ST1297)。Yan等[8]從黑龍江地區(qū)屠宰場分離的MRSA全部屬于ST9型。Li等[9]報道的44株豬源MRSA除1株屬于ST1376-t899型外，其它均屬于ST9-t899型?？苘堑萚10]對南京地區(qū)獲得的4株豬源MRSA進(jìn)行MLST分型發(fā)現(xiàn)，其中3株屬于ST9。樊潤等[11]對河南省豬源MRSA的耐藥性及分子分型進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示分離株主要為ST9-t899型，此外還檢測到ST1376-t899、ST2454-t899、ST9-t4132和ST9-t1334型，豬源MRSA的遺傳譜系呈現(xiàn)多樣化，存在區(qū)域性流行的特點，不同養(yǎng)殖場或屠宰場也存在優(yōu)勢譜型。MRSA ST9感染人的臨床報道較少，Yu等[12]在我國人醫(yī)臨床檢測到3株對喹奴普汀/達(dá)福普汀耐藥的ST9-t899 MRSA，3名感染MRSA的患者并非家畜飼養(yǎng)員，也沒有與家畜保持密切接觸，導(dǎo)致人感染的LA-MRSA-ST9菌株的起源尚不清楚。Liu等[13]在廣州某醫(yī)院中檢測到ST9-t899 MRSA。另外，在荷蘭也發(fā)現(xiàn)ST9-t899 MRSA感染人的案例[14]。

相較于歐美等地區(qū)，亞洲地區(qū)LA-MRSA的主要流行克隆屬于CC9。Neela等[15]報道了馬來西亞的豬和飼養(yǎng)員中MRSA為MRSA-ST9-SCCmecV型，spa型有t4358和t1784。Larsen等[16]在泰國的豬場中發(fā)現(xiàn)ST9 MRSA，其spa型為t337，并攜帶SCCmecIX。Vestergaard等[17]在泰國豬場中除檢測到MRSA ST9外，還檢測到ST9的變體ST2136和ST2278，同屬于克隆群CC9。Lo等[18]于2009—2010年在中國臺灣西部11個縣的生豬交易市場的150個養(yǎng)豬場收集了299份豬的鼻腔樣本，MRSA陽性農(nóng)場的檢出率為48.7%，而豬中MRSA的攜帶率為42.5%，MRSAST9-t899是主要克隆型，在SCCmec型的鑒定中，檢測到C2mec基因復(fù)合體，但大多數(shù)菌株缺乏ccrC基因。與之不同的是，日本LA-MRSA的主要流行型是ST221[19]，韓國則是ST398及其變體ST541[20]。

LA-MRSA在動物群體中高度流行，導(dǎo)致環(huán)境和空氣經(jīng)常被LA-MRSA污染，并可作為人感染的傳播源。Bos等[21]研究了農(nóng)場工作或生活的人在含有ST398 MRSA的空氣中的暴露水平與鼻腔定植ST398 MRSA的相關(guān)性，研究表明長期暴露于ST398 MRSA環(huán)境是鼻腔定植LA-MRSA的一個重要因素，降低ST398 MRSA在空氣中的水平是預(yù)防LA-MRSA的重要措施。Fox等[22]調(diào)查了英格蘭西北部生肉零售店MRSA的流行分布，從雞源、豬源和火雞源樣品中檢測到ST398 MRSA，其中2株雞肉中檢測到的MRSA與人類報道中的一個亞分支相同，表明家禽肉可能是引起人醫(yī)臨床感染ST398 MRSA的來源。在對巴塞羅那6家養(yǎng)豬場密度較高的地區(qū)養(yǎng)老院中204名居民攜帶MRSA狀況的研究中發(fā)現(xiàn)，15.7%的人在鼻腔中檢測到MRSA定植，其中15.6%的MRSA陽性居民發(fā)現(xiàn)了MRSA ST398，這些居民大多數(shù)與養(yǎng)豬場有直接或間接接觸[23]。

目前，對豬源LA-MRSA的研究較多，ST398是最早發(fā)現(xiàn)且最常見的流行克隆型，自在荷蘭發(fā)現(xiàn)ST398 LA-MRSA以來，德國、丹麥、意大利等國家陸續(xù)被報道，目前已分布于歐洲、北美洲、大洋洲、非洲、亞洲的多個國家和地區(qū)。ST398 MRSA的宿主廣泛，除定植豬外，還在馬、牛、雞、兔、羊等多種畜禽動物和野生動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。Agnoletti等[24]在集中飼養(yǎng)的家兔和與農(nóng)場有關(guān)的人群中發(fā)現(xiàn)MRSA ST398，進(jìn)一步揭示了MRSA可以在人和動物之間相互傳播。Porrero等[25]調(diào)查了野生動物中MRSA的流行情況，從馬鹿、野豬等野生動物身上分離獲得的13株MRSA均屬于ST398和ST1。ST398雖然定植于生豬中，但卻極少引起動物的感染，其主要威脅在于ST398能夠定植于養(yǎng)殖場工作人員，從而引起細(xì)菌感染，另外，ST398可通過環(huán)境、食品鏈等途徑傳播到與畜禽沒有直接接觸的人群中。

不同于豬源MRSA，牛源MRSA的流行呈現(xiàn)多樣化。Li等[26]在陜西省患乳房炎奶牛源金黃色葡萄球菌的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)MRSA的檢出率較低，121株金黃色葡萄球菌中僅檢出8株MRSA，且僅有1株檢出mecA基因，為ST71-t524-SCCmecⅣa型。王登峰等[27]從54株牛源金黃色葡萄球菌中鑒定出6株MRSA，均攜帶mecA基因，分別為ST9-NT型(n=1)、ST97-Ⅳ(n=3)、ST965-Ⅳ型(n=1)和ST6-Ⅳ型(n=1)。Yi等[28]從新疆地區(qū)牛乳汁中分離到56株MRSA，獲得7種spa類型(t034、t269、t4030、t114、t35、t189、t7589)以及12種MLST型，其中ST398和ST2393是最常見的類型，并發(fā)現(xiàn)3株在人醫(yī)臨床中流行的ST188 MRSA。最近一篇報道發(fā)現(xiàn)我國健康牛奶中LA-MRSA ST398的存在[29]。Mistry等[30]調(diào)查了印度引起奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌的臨床分離株的流行及分子特征，從牛奶樣品中分離獲得的39株金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為多種MLST型(ST72、ST88和ST239)和spa型(t2526、t9602)，所有菌株對利奈唑胺敏感，但19株金黃色葡萄球菌mecA基因陽性。Mcmillan等[31]從澳大利亞維多利亞州原料奶(奶牛、山羊和綿羊)中分離到30株金黃色葡萄球菌，牛奶源分離株分為5種ST型，山羊和綿羊分離株為ST133或其變異體；牛奶源菌株主要分為CC1、CC5、CC8、CC97和CC705，而山羊和綿羊分離株為CC133。

值得注意的是，Bhattacharyya等[32]報道了在牛奶和山羊奶中檢測到耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcus aureus，VRSA)。Wu等[33]在患乳房炎的奶牛樣品中獲得1株ST9-t899 MRSA，分析其基因組結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶新的SCCmec結(jié)構(gòu)，即SCCmecXII。Schmidt等[34]對牛乳腺炎樣品和與之密切接觸的人鼻腔拭子樣品中分離獲得的158株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcus aureus，MSSA)進(jìn)行遺傳特征分析，從牛源金黃色葡萄球菌中鑒定出7個ST型，包括ST8、ST97、ST351、ST352、ST508、ST2992和一種新的序列型ST3538，PFGE分析進(jìn)一步說明金黃色葡萄球菌遺傳具有多樣性，牛源和人源分離株無顯著差異，在人源中獲得屬于牛源中流行的ST97和ST352型，在牛源中亦檢測到人源中流行的ST8型，表明金黃色葡萄球菌能夠人類和奶牛之間相互傳播，提示應(yīng)加強病原菌在人和動物之間雙向傳播的監(jiān)測。牛源金黃色葡萄球菌的分子克隆呈現(xiàn)多樣性，無論MRSA還是MSSA中均存在多種ST型，這可能與奶牛中金黃色葡萄球菌攜帶率高有關(guān)，有利于各種克隆型的金黃色葡萄球菌在牛群之間以及牛與人之間傳播，亦利于MSSA菌株向MRSA菌株演變。

3 金黃色葡萄球菌的耐藥機制

金黃色葡萄球菌適應(yīng)能力強，可通過產(chǎn)生滅活酶和修飾酶、靶位改變、外排作用、生物被膜等機制，能夠迅速對新的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。

金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶3類氨基糖苷類修飾酶，從而對氨基糖苷類藥物耐藥。金黃色葡萄球菌流行的相關(guān)耐藥基因有aph(3＇)-III、aac(6＇)-aph(2＇＇)、ant(6)-Ia和aadD等。氨基糖苷類耐藥基因aac(6＇)-aph(2＇＇)、aadD及aadE等常出現(xiàn)在豬源MRSA中，而aph(3＇)-III和ant(6)-Ia等則常出現(xiàn)在與人有關(guān)的MRSA中[35]。李君[36]在分離的所有豬源MRSA中檢測到addD基因，部分菌株中含有aacA-aphD基因，且aacA-aphD基因的流行呈逐年上升趨勢。另外，多重耐藥基因cfr可編碼甲基化轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)林可胺類、酰胺醇類、截短側(cè)耳素類、以及人醫(yī)重要的噁唑烷酮類藥物耐藥[37]。Denis等[38]檢測了48株ST398 MRSA中tet(M)和tet(K)的攜帶情況，其攜帶率分別為100.0%和47.9%。

金黃色葡萄球菌由于產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致對對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，這種酶能夠水解青霉素和氨芐西林等藥物β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，從而使藥物失活，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因是blaZ。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding protein，PBP，稱為PBP2a)，導(dǎo)致其對甲氧西林耐藥。該蛋白對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力低，在抗生素壓力下能夠取代正常的PBPs從而產(chǎn)生耐藥性。PBP2a主要由mecA基因編碼，位于染色體的SCCmec結(jié)構(gòu)中。目前，blaZ和mecA基因在動物源金黃色葡萄球菌等中廣泛存在，牛乳源金黃色葡萄球菌中blaZ的攜帶率達(dá)63.1%[39]。

靶位突變導(dǎo)致藥物與靶位結(jié)合量減少是金黃色葡萄球菌對藥物耐藥的重要原因。喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)決定區(qū)的靶位(DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶 IV)突變，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對喹諾酮類藥物的親和力下降，從而產(chǎn)生耐藥[40]。23S rRNA及核糖體蛋白L3的突變，可引起金黃色葡萄球菌對截短側(cè)耳素類藥物耐藥。編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的νga基因和lsa(E)基因可介導(dǎo)細(xì)菌對截短側(cè)耳素類藥物的耐藥。νga(C)基因主要在動物源MRSA CC398中發(fā)現(xiàn)[41]。lsa(E)基因可介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯類-林可胺類-鏈陽菌素B類(macrolides,lincosamides and type B streptogramin,MLSB)的多重耐藥，常與其它耐藥基因形成多重耐藥基因簇，還含有erm(B)、lnu(B)(林可胺類耐藥基因)、aacAaphD(氨基糖苷類耐藥基因)、aadE(氨基糖苷類耐藥基因)和spw(氨基糖苷類耐藥基因)，該基因簇常存在于豬源ST9 MRSA中[42]。

外排作用是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥的另一原因。多重耐藥泵主要易化子超家族(MFS)、小多重耐藥家族(SMR)、多藥及毒性化合物外排家族(MATE)、ATP結(jié)合盒超家族(ABC)和耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族(RND)，這些多重耐藥泵可分別作用不同的底物，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。optrA基因編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白，介導(dǎo)酰胺醇類和惡唑烷酮類的多重耐藥。外排泵耐藥基因fexA、fexB和pexA等介導(dǎo)金黃色葡萄球菌對酰氨醇類藥物耐藥。

金黃色葡萄球菌可形成生物被膜，使菌株在不利的環(huán)境中存活。形成生物被膜后的菌株，不僅減少菌株被機體清除的風(fēng)險，還增加了對抗菌藥物的抵抗性。當(dāng)生物被膜存在時，抗菌藥物的作用效果可減弱10～1000倍。生物被膜的形成是一個復(fù)雜的過程，形成機制也存在一定的爭議。一般包括定植(attachment)、黏附(multiplication)、聚集(exodus)、成熟(maturation)、散播(dispersal)5個階段[43]。目前認(rèn)為多糖胞間黏附素(polysaccharide intercellular adhesin，PIA)是金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程中的關(guān)鍵因子，由ica操縱子編碼，包括icaR調(diào)節(jié)基因及icaADBC生物合成基因、細(xì)胞外eDNA以及相關(guān)蛋白共同作用的。

此外，可移動元件是細(xì)菌耐藥性傳播的重要載體。金黃色葡萄球菌可通過質(zhì)粒、插入序列、轉(zhuǎn)座子及可移動基因島等途徑獲得耐藥基因。SCCmec元件除攜帶mecA(或mecC)基因外，常攜帶多種其它的耐藥基因如aadD、spc和cfr等。質(zhì)粒作為耐藥基因的載體，在耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，同時本身也是攜帶耐藥基因轉(zhuǎn)座子的載體。含有l(wèi)sa(E)等耐藥基因的多藥耐藥基因簇常存在于豬源ST9 MRSA的質(zhì)粒中[44]。豬源MRSA ST398分離株的質(zhì)粒pUR1902攜帶erm(T)、tet(L)和aadD等多種耐藥基因，耐藥基因的兩側(cè)是ISSau10，說明插入序列可能在質(zhì)粒重組中發(fā)揮重要作用[45]。

4 總結(jié)

金黃色葡萄球菌的耐藥性對人和動物的健康造成了嚴(yán)重的威脅，也給公共衛(wèi)生安全帶來了極大挑戰(zhàn)。動物源金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐藥機制復(fù)雜多樣，研究其耐藥機制和遺傳特征是金黃色葡萄球菌抗菌藥物敏感性檢測的重要依據(jù)，這對防控金黃色葡萄球菌耐藥性具有重要的意義。