基于全基因組測序的耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌耐藥基因、毒力因子及同源性分析

胡小騫 王琴

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230601)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一種易引起醫(yī)院感染的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，近年來在重癥監(jiān)護病房的檢出率居高，主要感染免疫力低下的重癥患者、侵入性治療的患者及抗菌藥物廣泛使用的患者，易引起腦膜炎、肺炎、腹膜炎、菌血癥等疾 病[1-2]，感染患者的死亡率高達35%[3]。AB在環(huán)境中可長期存在，當(dāng)感控措施落實不到位時，會增加患者間交叉?zhèn)鞑ヒ约澳退幘g傳播的機會[4]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，AB的耐藥性日漸嚴(yán)重，其對碳青酶烯類的耐藥率逐年增高[5-6]，耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii,CRAB)的檢出率逐漸增高，其在社區(qū)中、醫(yī)院內(nèi)傳播的機會不斷增加，對醫(yī)療機構(gòu)構(gòu)成了全球性威脅[7]。本研究收集該院重癥監(jiān)護病房、神經(jīng)外科住院患者分離的CRAB，應(yīng)用全基因組測序技術(shù)對其攜帶的耐藥基因、毒力因子及同源性進行分析，為臨床CRAB感染防控措施及抗菌藥物的合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集該院2020年1月—3月ICU、神經(jīng)外科分離的所有醫(yī)院感染CRAB菌株，剔除同一患者的重復(fù)菌株及入院48 h內(nèi)檢出的社區(qū)感染菌株，共11株。菌株納入依據(jù)為1月至3月期間該院ICU發(fā)現(xiàn)7例CRAB醫(yī)院感染的患者，進一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)神經(jīng)外科有4例CRAB醫(yī)院感染的患者與7例ICU患者存在時間及空間的交集，將此11株CRAB納入研究。標(biāo)本來源分別為痰(10株)、血(1株)。11例患者中男性11例(100%)，見表1。以大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，銅綠假單胞菌ATCC27853，陰溝腸桿菌ATCC700323為質(zhì)控菌株。

表1 11株CRAB菌株的分布情況Tab.1 The distribution of 11 strains of CRAB

1.1.2 儀器與試劑

法國生物梅里埃VITEK-2 Compat全自動細(xì)菌分析系統(tǒng)，英國Biochrom超微量分光光度計，上海一恒科學(xué)儀器有限公司恒溫培養(yǎng)搖床，美國Bio-Rad電泳儀，美國Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)。藥敏紙片、M-H培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司，DNA Marker D、4S Red plus核酸染色劑、上樣緩沖液購自上海生工生物工程股份有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，質(zhì)控菌株購自國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏實驗

應(yīng)用法國VITEK-2 Compat全自動細(xì)菌分析系統(tǒng)和配套試劑GN/GN13，進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗。參照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and laboratory standard institute,CLSI)2019年標(biāo)準(zhǔn)對藥敏結(jié)果進行判定，使用微量肉湯稀釋法(MIC法)對亞胺培南、慶大霉素、頭孢菌素、妥布霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星進行藥敏試驗，使用K-B紙片擴散法對美羅培南和阿米卡星進行藥敏試驗，CRAB藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為對任一種碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA提取

復(fù)蘇CRAB菌株于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單克隆CRAB菌株于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖菌過夜。取細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL，10000 r/min離心1 min，吸凈上清液，保留菌體沉淀，使用DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

1.2.3 基因組DNA提取物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

將DNA提取產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用超微量分光光度計檢測純度和濃度。純度要求菌株DNA產(chǎn)物的A260:A280于1.8～2.0范圍內(nèi)，避免RNA污染。DNA濃度≥20 ng/μL，條帶清晰無雜帶，總量在1.0～2.0 μg范圍內(nèi)。

1.2.4 細(xì)菌全基因組測序

通過Illumina Hiseq2500第二代高通量測序平臺進行2×100 bp Paired-End測序，基于Illumina平臺的測序，是對核酸提取樣本進行建庫、擴增測序、質(zhì)控的3個主要步驟。

1.2.5 測序結(jié)果組裝

在Linux或Centos系統(tǒng)中運行SPAdes-2.0軟件將測序原始FASTQ結(jié)果拼接為FASTA文件，運行命令參考SPAdes-2.0軟件網(wǎng)址https://github.com/ablab/spades。

1.2.6 耐藥基因篩選

應(yīng)用丹麥技術(shù)大學(xué)(DTU)基因組流行病學(xué)中心(Center for genomic epidemiology,CGE)(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)的ResFinder 4.0工具，對11株CRAB的contigs進行耐藥基因篩選，獲得其攜帶的耐藥基因。應(yīng)用MORPHEUS(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線制作11株CRAB的耐藥基因熱圖，實現(xiàn)耐藥基因分布可視化。

1.2.7 毒力因子篩選

應(yīng)用Linux系統(tǒng)運行Kaptive軟件檢測CRAB菌株的莢膜型，應(yīng)用中國衛(wèi)生健康委員會創(chuàng)建的病原生物學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)重點實驗室、CAMS＆PUMC病原生物學(xué)研究所毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB)(http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgifunc=VFanalyzer)的VFanalyzer在線工具，對11株CRAB進行毒力因子篩選。

1.2.8 同源性分析

應(yīng)用Linux系統(tǒng)運行MLST軟件，MLST軟件將菌株的FASTA文件應(yīng)用BLAST算法與PubMLST分子分型和微生物基因組多樣性的公共數(shù)據(jù)庫進行(https://pubmlst.org/)比對，運行命令參考MLST軟件(https://github.com/tseemann/mlst)，對細(xì)菌基因組的gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB7個管家基因進行對齊分類，每個基因組的每種管家基因被命名為一個隨機整數(shù)，各種管家基因命名整數(shù)的唯一組合(等位基因譜)即為一種序列類型(ST型)，根據(jù)細(xì)菌ST型初步分析其同源性。

同時，基于全基因組序列的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism,SNP)分析，以1號菌株序列作為參考，使用CGE的CSI Phylogeny 1.4工具(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/)對所有菌株序列進行SNP分析，應(yīng)用FigTree v1.4.4軟件針對分析結(jié)果構(gòu)建11株CRAB的最大似然樹，按同源性大小分組，分析其同源性。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用WHONET5.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計數(shù)資料以例數(shù)進行描述。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌藥敏結(jié)果

11株CRAB均為多重耐藥菌，其中11株對亞胺培南、美羅培南、頭孢菌素和環(huán)丙沙星均表現(xiàn)耐藥，而對阿米卡星和左氧氟沙星耐藥的菌株株數(shù)較少，分別為4株和2株，見表2。

表2 CRAB對常用抗菌藥物的耐藥情況(株數(shù))Tab.2 Resistance of CRAB to commonly used antibacterial drugs(number of plants)

2.2 耐藥基因分析結(jié)果

通過對11株CRAB進行WGS分析，共發(fā)現(xiàn)18種耐藥基因，包括碳青霉烯酶耐藥基因、β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因、多種外排泵相關(guān)耐藥基因及抗菌藥物修飾酶耐藥基因，見圖1和表3。碳青霉烯酶耐藥基因以blaOXA-23和blaOXA-66為主，11株(100.0%)均攜帶此型。11株(100.0%)均攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，包括blaADC-25和blaTEM-1D。檢出外排泵相關(guān)基因如tet(B)，以及抗菌藥物修飾酶耐藥基因如aadA1、aph(3″)-Ib、aph(3＇)-Ia、aph(6)-Id、aac(3)-Ia和aac(6＇)-Ib3，7種氨基糖苷類耐藥基因中，11株(100.0%)攜帶aadA1、aph(3″)-Ib、aph(3＇)-Ia和aph(6)-Id，9株(81.8%)攜帶aac(3)-Ia，5株(45.5%)攜帶aac(6＇)-Ib3和armA。檢出大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mph(E)(10株)、msr(E)(10株)，磺胺類耐藥基因sul1(11株)，喹諾酮類耐藥基因aac(6＇)-Ib-cr(5株)，四環(huán)素耐藥基因tet(B)(11株)，氯霉素耐藥基因catB8(5株)，消毒劑耐藥基因qacE(11株)。

表3 CRAB攜帶的耐藥基因型分布情況Tab.3 The distribution of drug-resistant genotypes carried by CRAB

圖1 11株CRAB耐藥基因熱圖Fig.1 Heat map of 11 strains of CRAB resistant genes

2.3 毒力因子分析結(jié)果

通過WGS分析，發(fā)現(xiàn)11株CRAB均為K22莢膜型，其均攜帶多種毒力因子，包括外膜孔蛋白(OmpA)、脂多糖(LpsB)、生物膜(CsuABCDE、Bap和PgaABCD)、外排泵(AdeFGH)、磷脂酶(Plc、PlcD)、不動桿菌素生物合成蛋白(BauABCDEF)、外膜醋酸桿菌素蛋白(BauABCDEF)、腸桿菌素合成酶(EntE)、血紅素加氧酶(HemO)、群體感應(yīng)(QS系統(tǒng))蛋白(AbaIR)、菌毛調(diào)節(jié)因子(BfmRS)、青霉素結(jié)合蛋白G(PbpG)和過氧化氫酶(KatA)。

2.4 同源性分析結(jié)果

11株CRAB均為ST 2-K22型，其最大似然樹構(gòu)建結(jié)果如圖2所示，依據(jù)樹分支節(jié)點的bootstrap值，將bootstrap值≥0.5的分支菌株分為一組[8-10]，11株CRAB按同源性差異分成5組克隆株，10號為A組，7號為B組，1、3、4、5、6、8和9號為C組，11號為D組，2號為E組。C組組內(nèi)同源性關(guān)系較近，組內(nèi)的分支節(jié)點上的bootstrap值均≥0.7，C組感染患者的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，7位感染患者均為入住ICU后分離出CRAB，其ICU住院時間存在先后或交集關(guān)系，其中6號與8號床位相同，其他感染患者的床號相近。

圖2 11株CRAB最大似然樹Fig.2 Phylogenetic tree diagram of 11 strains of CRAB

3 討論

本研究對11株CRAB的藥敏結(jié)果顯示其耐藥形勢較嚴(yán)峻，其對臨床常用抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥，除了6株對妥布霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑敏感，7株對阿米卡星敏感外，對其他抗菌藥物敏感的菌株株數(shù)均較低。說明臨床應(yīng)加強抗菌藥物合理規(guī)范使用的管理，減少抗菌藥物對耐藥菌的篩選機會，否則將會面臨無藥可用的局面。

CRAB的耐藥機制較為復(fù)雜，主要包括外排泵的過度表達、膜孔通道蛋白表達下調(diào)、藥物作用靶位變化、產(chǎn)碳青霉烯酶等方式實現(xiàn)耐藥[11-15]。其中，產(chǎn)碳青霉烯酶是CRAB重要的耐藥機制之一，本研究中碳青霉烯酶耐藥基因blaOXA-23和blaOXA-66檢出率均為100%，未檢出其他類型碳青霉烯酶耐藥基因。blaOXA-23和blaOXA-66屬于Ambler D類酶，blaOXA-23通常由質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)傳播[16-17]，位于blaOXA-23上游的ISAba1基因?qū)ζ渚哂袇f(xié)調(diào)作用[18-19]，ISAba1作為插入序列可使carO基因失活，致使膜孔蛋白carO缺失[20]，阻止藥物進入菌株內(nèi)部而產(chǎn)生耐藥。說明blaOXA-23和blaOXA-66為該院CRAB對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要因素之一，這與國內(nèi)外相關(guān)報道一致[12,17,21-23]。本研究結(jié)果中的aac(3)-Ia和aac(6＇)-Ib3屬于氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(AACs)基因，其檢出率分別為81.8%和45.5%，檢出率高于國內(nèi)相關(guān)研究[24]，氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶(ANTs/aad)基因aadA1、以及氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APHs)基因aph(3″)-Ib、aph(3＇)-Ia和aph(6)-Id的檢出率均為100.0%，說明這些基因為該院流行的主要耐藥基因，其可通過多種途徑在菌株間傳播，如轉(zhuǎn)座子、整合子及質(zhì)粒等[22]。armA屬于氨基糖苷類耐藥基因中的16S rRNA甲基化酶基因，是AB耐氨基糖苷類藥物的主要因素之一[25]，本研究中的檢出率為45.5%，臨床科室應(yīng)加強氨基糖苷類抗菌藥物的合理使用，減少此類藥物對AB的選擇作用。喹諾酮類耐藥基因aac(6＇)-Ib-cr由氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac(6＇)-Ib突變而來，可由質(zhì)粒介導(dǎo)乙酰化含游離氨基的藥物，可同時對氨基糖苷類和喹諾酮類藥物進行酶解，其檢出率為45.5%。四環(huán)素耐藥基因tet(B)檢出率為100.0%，Vilacoba等[26]發(fā)現(xiàn)tet(B)可與插入序列ISCR2協(xié)同實現(xiàn)耐藥基因的傳播。以上研究顯示該院CRAB耐藥基因類別較多、機制復(fù)雜，說明臨床及相關(guān)主管部門應(yīng)加強抗菌藥物的管理，合理使用抗菌藥物，避免藥物濫用情況的發(fā)生。

AB的毒力因子主要包括磷脂酶、膜孔蛋白、脂多糖、鐵載體及生物被膜相關(guān)蛋白等。本研究中11株CRAB均攜帶多種毒力因子。其中，生物膜因子包括CsuABCDE、Bap和PgaABCD，可保護細(xì)菌以適應(yīng)乏養(yǎng)環(huán)境，CsuE和PgaB是其常見流行因子[27]，其他因素也能促使生物膜的形成，如上調(diào)Csu和菌毛調(diào)節(jié)因子(BfmR)[28]、外排泵AdeFGH基因的過度表達等[29]。膜孔蛋白因子(OmpA)能夠輔助菌株形成生物膜，并參與菌株對宿主的黏附作用，甚至能夠誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[30]。脂多糖因子(LpsB)可提高菌株對宿主血清補體的抵抗力，以實現(xiàn)對宿主細(xì)胞的免疫逃逸，還可以預(yù)防宿主抗菌肽LL-37對菌株的殺傷作用[2,31]。不動桿菌素生物合成蛋白包括BasABCDFGHIJ，其中BasD能夠促進菌株對于宿主細(xì)胞的鐵攝取，保障菌株能量供應(yīng)及持續(xù)生存。外膜醋酸桿菌素蛋白BauA與BasD作用相似[32]。另外，群體感應(yīng)(QS系統(tǒng))蛋白(AbaIR)可輔助菌株表面運動以增強毒力，相關(guān)研 究[33]表明菌株主要依賴AbaI介導(dǎo)的群體感應(yīng)以實現(xiàn)運動能力。青霉素結(jié)合蛋白G(PbpG)基因可參與合成Pbp7/8[11]，有研究[34]表明Pbp7/8的缺失可能破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)，從而影響菌株對宿主的防御作用。血紅素加氧酶HemO會促進CRAB對宿主血紅素及鐵的有效利用[35]，實現(xiàn)菌株的生存維持。本研究結(jié)果顯示該院CRAB毒力機制復(fù)雜多樣，各類毒力因子賦予菌株強大的生存力及侵襲力，說明實施有效防控措施以控制CRAB的傳播至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示11株CRAB均為ST 2-K22莢膜型，與Rezaei等[36]的研究結(jié)果相似。最大似然樹結(jié)果顯示C組的1、3、4、5、6、8和9號菌株同源性較高，提示為該院CRAB的優(yōu)勢克隆株。有研究發(fā)現(xiàn)AB在醫(yī)療環(huán)境中可長期存活，在干燥環(huán)境中可存活60 d，當(dāng)消毒隔離措施落實不到位，醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生不達標(biāo)等情況發(fā)生時，此類環(huán)境可能成為CRAB定植和交叉感染的溫床[37]。同源性分析結(jié)果顯示，C組的1、8號感染患者先于2019年12月在ICU入住治療，轉(zhuǎn)回神經(jīng)外科后分離出CRAB，3、4、5、6、9號感染患者隨后入住ICU治療，并在ICU住院期間分離出CRAB，7位感染患者的ICU入住床號較為相近，其中，6號與8號床位相同。說明不能排除環(huán)境及醫(yī)務(wù)人員等因素導(dǎo)致CRAB在ICU內(nèi)的傳播，此次傳播原因可能與ICU的床單元消毒不到位、醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生不規(guī)范以及醫(yī)務(wù)人員無菌操作不達標(biāo)有關(guān)。醫(yī)院相關(guān)管理部門及臨床科室應(yīng)加強耐藥菌防控的管理，包括嚴(yán)格落實病區(qū)的消毒隔離措施，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，規(guī)范手衛(wèi)生等，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)加強對國內(nèi)、外細(xì)菌耐藥趨勢的了解，合理使用抗菌藥物[38]。

多重耐藥菌的耐藥基因、毒力因子及親緣性關(guān)系對于細(xì)菌耐藥性流行病學(xué)的研究至關(guān)重要，傳統(tǒng)的技術(shù)方法如PCR及qPCR基因芯片、脈沖場凝膠電泳等的分析結(jié)果不全面、靈活性低、耗時長、操作復(fù)雜，具有一定的局限性。WGS結(jié)合生物信息分析的模式能夠快速全面地識別細(xì)菌的耐藥性及毒力機理，精準(zhǔn)地呈現(xiàn)菌株間的親緣性關(guān)系，具有靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性高的特點，對于研究基因組的復(fù)雜性、多樣性以及提高各類細(xì)菌發(fā)展進程的認(rèn)知具有重要意義。WGS分析結(jié)果與流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)合能夠快速、準(zhǔn)確地確認(rèn)院感暴發(fā)、追蹤感染源、明確傳播路徑，為耐藥菌的防控提供更有效的目標(biāo)干預(yù)信息，對于醫(yī)院感染暴發(fā)的調(diào)查具有重要意義，提升了醫(yī)院感染防控的技術(shù)水平。

本研究的菌株樣本量偏少，在開展耐藥性和毒力的統(tǒng)計學(xué)研究方面存在不足。同時，本研究選用的ResFinder 4.0數(shù)據(jù)庫對于部分基因及突變基因的比對不全面，如喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB和parC等，使本研究在預(yù)測菌株的耐藥性方面具有一定的局限性。后續(xù)將收集更多科室的不同種類標(biāo)本，應(yīng)用多樣化的技術(shù)方法對菌株進行耐藥性、毒力及同源性的分析。

綜上所述，本研究中的CRAB對大多數(shù)抗菌藥物均耐藥，同時攜帶多種耐藥基因，耐藥形勢較為嚴(yán)峻。其攜帶的毒力因子較多，毒力機制較為復(fù)雜，給臨床治療帶來了挑戰(zhàn)。CRAB菌株間存在一定的同源性，應(yīng)加強對CRAB的耐藥性監(jiān)測及主動篩查，落實有效的感染防控措施，遏制耐藥菌在醫(yī)院內(nèi)的傳播。