氫氧機在抗真菌輔助治療中的效果評價及機制初探

廖魏祖, 賈庚佩, 楊 政, 孫 毅

(1. 長江大學, 湖北 荊州, 434100; 長江大學附屬荊州醫(yī)院, 2. 全科醫(yī)學科,3. 感染科, 4. 皮膚病與性病科, 湖北 荊州, 434100)

真菌廣泛存在于呼吸道、生殖道、消化道、口腔和皮膚等處[1], 大部分為機會致病菌[2], 可引起淺部真菌感染和深部真菌感染[3], 其中深部真菌感染是常見的院內(nèi)感染類型之一[4]。由于缺乏特異性表現(xiàn)，真菌感染的臨床診斷極其困難，且治療難度大，治療成本高[5]。因此，探尋新型的抗真菌治療方案和抗真菌藥協(xié)同治療策略對于改善患者預后具有積極意義。氫氧機是利用電解水技術制備氫氣、氧氣的設備，醫(yī)療用氫氧氣霧化機主要由電解槽和超聲霧化系統(tǒng)組成，通過提供氫氧混合氣體經(jīng)呼吸系統(tǒng)進入人體起治療作用，也可與霧化藥液混合后進行霧化吸入、濕化治療[6-7]。本研究使用氫氧機制備的氫氧混合氣體對臨床常見的致病真菌進行體外處理，觀察不同處理時間的真菌殺傷效果，并檢測處理后真菌對唑類抗真菌藥的敏感性變化，以期為臨床單獨應用氫氧機或聯(lián)用抗真菌藥治療真菌感染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取長江大學附屬荊州醫(yī)院真菌試驗室保存的12株臨床分離真菌作為試驗菌株，分別為白念珠菌R9、R14、R15、SC5314, 耳念珠菌AR382、AR387、AR389(購自美國CDC)，克柔念珠菌ATCC00279, 近平滑念珠菌ATCC22019, 新生隱球菌Z1、Z2、Z3。藥敏試驗質控菌株為近平滑念珠菌(ATCC22019)。試驗藥物包括泊沙康唑(POS)、伊曲康唑(ITR)、氟康唑(FLU)和伏立康唑(VOR)(購自Selleck公司)。氫氧機購自阿斯克勒庇俄斯醫(yī)學(南通)有限公司，型號BYT-JP-H03。一次性無菌管購自北京紅祥聚科貿(mào)易有限公司，生產(chǎn)批號H0081031。

1.2 氫氧機對真菌的體外殺傷試驗

① 菌懸液制備: 以沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基培育真菌2 d后用無菌生理鹽水收集孢子，再使用血細胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為2×106CFU/mL。② 菌液稀釋: 將制備好的12株菌株的菌懸液用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋至終濃度2×104CFU/mL, 分別取10 mL分裝于50 mL EP管中。③ 氫氧機通氣處理: 使用一次性無菌管分別接入氫氧機出氣口和裝有菌懸液的50 mL EP管中，并確保通氣部位在菌懸液底部。氫氧機開機后，設置氣流量為3 L/min, 霧化檔為5檔。以通氣0 min時(未通氣時)和通氣處理菌懸液5、10 min時為3個觀察時點，各時點分別取菌懸液100 μL, 用玻璃珠涂布于SDA培養(yǎng)基，于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后進行菌落計數(shù)。所有試驗操作重復3次。

1.3 體外藥敏試驗

按照美國臨床試驗室標準化研究所(CLSI)頒布的M27-A4文件中的微量液基稀釋法，配置RPMI 1640液體培養(yǎng)基。將試驗藥物VOR、POS、FLU和ITR分為8個濃度梯度，工作濃度范圍分別為0.031～4.000 μg/mL、0.031～4.000 μg/mL、0.500～64.000 μg/mL和0.063～8.000 μg/mL。倍比稀釋4種藥物，將稀釋后的藥物分別加入96孔板，設立無藥孔為生長對照孔，剩余每孔再加入倍比稀釋后藥物100 μL和菌懸液100 μL, 35 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后讀取最低抑菌濃度(MIC)結果。每個藥敏試驗重復3次，質控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019。

1.4 細胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測

采用雙氫羅丹明123(DHR-123, 購自Sigma-Aldrich公司，貨號NO.D1054, 將粉狀熒光染料溶解于二甲亞砜)檢測細胞內(nèi)ROS。取3個觀察時點的菌懸液，分別配置6管10 mL孢子濃度為5×106CFU/mL的沙氏葡萄糖水液體培養(yǎng)基菌懸液，取其中1管不做處理，其余5管分別加入DHR-123(5.000 μg/mL), 再取5管中的4管分別加入濃度不同的4種藥物(每管加其中1種藥物)，即ITR(0.250 μg/mL)、VOR(0.125 μg/mL)、POS(0.500 μg/mL)、FLU(0.250 μg/mL)。將配置好的菌懸液放入搖箱中于37 ℃、130 轉/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min。取培養(yǎng)后的菌液離心(2 000～4 000轉/min) 5～10 min, 去除上清后以5 mL預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重復洗滌2次。洗滌后重懸細胞于5 mL SDA液體培養(yǎng)基中，放入搖箱以37 ℃、130轉/min振蕩培養(yǎng)60 min, 取經(jīng)第2次培育后的菌液離心(2 000～4 000轉/min) 5～10 min, 去除上清后加入1 mL預冷的PBS重懸。取150 μL重懸液置于流式管中，使用流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號B53000)進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較行卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 氫氧機不同通氣時間對真菌菌株的殺傷情況

氫氧機5 min通氣處理對12株菌株的殺傷率與通氣0 min比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 整體殺傷率范圍為6.3%～76.2%, 其中對4株白念珠菌的殺傷率范圍為9.0%～49.6%, 對3株耳念珠菌的殺傷率范圍為6.3%～20.9%, 對3株新生隱球菌的殺傷范圍為10.3%～76.2%, 對克柔念珠菌的殺傷率為21.1%, 對近平滑念珠菌的殺傷率為37.8%。與5 min通氣處理相比，氫氧機10 min通氣處理對12株菌株的殺傷率增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 整體殺傷率范圍為19.6%～93.5%, 其中對4株白念珠菌的殺傷率增至23.1%～53.4%, 對3株耳念珠菌的殺傷率增至23.9%～49.7%, 對3株新生隱球菌的殺傷率增至19.6%～93.5%, 對克柔念珠菌的殺傷率增至39.5%, 對近平滑念珠菌的殺傷率增至46.1%。由此可見, 5 min通氣處理即可顯著改變對真菌的殺傷效果，但10 min通氣處理對真菌的殺傷效果顯著更優(yōu)，故10 min是更合適的通氣處理時間。經(jīng)高濃度氫氣處理后，孢子數(shù)明顯減少，說明高濃度氫氣通氣處理對真菌菌株產(chǎn)生了明顯的殺傷效果。菌株生長狀況見圖1, 各菌株殘余孢子數(shù)量見圖2, 通氣不同時間后各菌株孢子存活率見表1。

表1 通氣不同時間后各菌株的孢子存活率 %

2.2 體外藥敏試驗結果

與未經(jīng)通氣處理時相比，通氣處理10 min后，大部分菌株表現(xiàn)出對抗真菌藥更加敏感。對于白念珠菌, ITR的MIC從0.250～1.000 μg/mL降至0.125～1.000 μg/mL, POS的MIC從0.063～0.500 μg/mL降至0.063～0.250 μg/mL, FLU的MIC從0.500～8.000 μg/mL降至0.125～4.000 μg/mL; 對于耳念珠菌, ITR的MIC從0.125～4.000 μg/mL降至0.125～1.000 μg/mL, VOR的MIC從0.250～4.000 μg/mL降至0.250～2.000 μg/mL, POS的MIC從0.063～4.000 μg/mL降至0.063～0.500 μg/mL, FLU的MIC從4.000～64.000 μg/mL降至2.000～64.000 μg/mL; 對于克柔念珠菌, ITR的MIC從0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL, VOR的MIC從0.125 μg/mL降至0.063 μg/mL, POS的MIC從0.500 μg/mL降至0.031 μg/mL, FLU的MIC從0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL; 對于近平滑念珠菌, ITR的MIC從0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL, VOR的MIC從0.125 μg/mL降至0.063 μg/mL, POS的MIC從0.500 μg/mL降至0.250 μg/mL, FLU的MIC從2.000 μg/mL降至0.063 μg/mL; 對于新生隱球菌, ITR的MIC從0.125～0.250 μg/mL降至0.063～0.250 μg/mL, FLU的MIC從2.000～4.000 μg/mL降至0.500～2.000 μg/mL。藥敏試驗結果顯示，經(jīng)過高濃度氫氣處理后，抗真菌藥對11株真菌的MIC值明顯降低，說明高濃度氫氣處理可使菌株對藥物的敏感性增強，起到協(xié)同殺傷效果。見表2。

表2 4種抗真菌藥對12株真菌的體外藥敏試驗最低抑菌濃度結果 μg/mL

2.3 細胞內(nèi)ROS檢測結果

根據(jù)藥敏試驗結果以及存活率結果篩選出克柔念珠菌ATCC00279進行ROS檢測，見圖3。相較于通氣處理0 min, 通氣處理10 min后的ATCC00279對4種唑類抗真菌藥的ROS百分比均有所增加，其中ATCC00279對ITR和VOR的ROS百分比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖4。由此表明，高濃度氫氣處理會對菌株產(chǎn)生明顯殺傷效果，導致孢子數(shù)目減少，且菌株細胞內(nèi)ROS比例增加，使其對唑類抗真菌藥的敏感性增強。

3 討 論

臨床常見的真菌主要包括念珠菌、曲霉菌和隱球菌等，廣泛存在于呼吸道、生殖道、消化道、口腔及體表皮膚等部位，其中白念珠菌、新型隱球菌和煙曲霉菌是導致真菌感染最重要的3大致病菌[8-9]。真菌性疾病在國內(nèi)外人群中的發(fā)病率均較高，為20%～25%, 可對人們的身心健康造成重大損害[10]。臨床常見的深部真菌感染的發(fā)生往往與廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑的廣泛使用，導管技術、器官移植的開展，以及艾滋病、惡性腫瘤患者和老年患者的增加等因素有關[11-12]。念珠菌是深部真菌感染排名首位的病原菌，其后是曲霉菌和隱球菌[3]。隱球菌引起的深部真菌感染主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肺[13], 造成隱球菌性腦膜炎和肺炎。相關研究[14]稱, 40歲以上慢性阻塞性肺疾病患者合并真菌感染的概率為25%～40%。臨床較少見的耳念珠菌有著“超級真菌”之稱，具有多重耐藥性，一旦感染往往難以治療且流行難以控制[15]。目前，侵襲性真菌感染尚無很好的臨床治療方法，深部真菌感染更是嚴重影響患者轉歸，且隨著耐藥菌株的增加抗菌藥的臨床應用受到限制[16], 導致患者住院時間延長，甚至危及生命健康。

2020年2月2日，氫氧氣霧化機被國家藥品監(jiān)督管理局批準作為三類呼吸醫(yī)療設備用于慢性阻塞性肺疾病的輔助治療，可改善呼吸困難、咳嗽、咳痰等癥狀。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》、《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》均將氫氣治療作為推薦治療方法，使得氫氣的臨床價值逐漸引起重視[17]。本研究選取臨床常見的深部致病真菌12株，使用氫氧機制備的氫氧混合氣體對其進行體外處理，發(fā)現(xiàn)氫氧混合氣體在體外對真菌孢子均有不同程度的殺傷效果，其中對新生隱球菌、白念珠菌的殺傷效果尤為明顯，對耳念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌亦表現(xiàn)出較好的殺傷效果。同時，體外藥敏試驗結果顯示，氫氧機通氣處理與唑類抗真菌藥對上述真菌孢子的協(xié)同殺傷效果明顯，即氫氧機通氣可提高真菌孢子對唑類抗真菌藥的敏感性，表明氫氣在真菌感染性疾病治療方面或許有較好的前景。

氫氣的具體作用機制目前尚未明確，本研究提示氫氣對孢子具有高抑制效果，其可能機制是高濃度的氫氣打破了真菌微生物的氧化-抗氧化平衡，甚至有可能直接作用于微生物線粒體而影響孢子的能量代謝[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)通氣處理后，菌株細胞內(nèi)ROS比例增加，對4種唑類抗真菌藥的敏感性增強。研究[18]證實ROS對孢子具有殺傷效應，細胞內(nèi)蓄積的ROS氧化細胞內(nèi)的DNA、蛋白、脂質及細胞器，從而引起氧化應激，被ROS氧化的蛋白及脂質不僅會失去應有功能，而且易在細胞內(nèi)聚集形成脂褐素等毒性物質，并通過影響溶酶體的活性而引起細胞死亡。另外，氧化應激也會引起線粒體的嚴重損害，線粒體內(nèi)積聚的ROS可使其DNA突變、脂質過氧化，從而影響線粒體的功能，線粒體嚴重損害還可引起胞體自噬、自噬性細胞死亡、凋亡和壞死[19]。研究[20]顯示，不同種類的抗菌藥物可能通過激活呼吸鏈電子傳遞，誘導大量的ROS積累而參與殺菌，對于致死濃度的抗菌藥物而言，抗菌共有通路產(chǎn)生的ROS參與并促進抗生素殺菌，進而減少細菌數(shù)目，并減少耐藥菌產(chǎn)生機會，進一步證實氫氧機產(chǎn)生的氫氧混合氣體和唑類抗真菌藥對真菌孢子具有協(xié)同殺傷作用。相關研究[21]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)呼吸道吸入氫氣可改善眾多疾病模型中的組織損傷，如肺、腦、心、腎、皮膚、鼻等，特別是在慢性阻塞性肺疾病合并深部真菌感染的治療中，氫氧混合氣呼吸療法不僅可降低氣體在小氣道中的流速阻力，提高氧氣的利用度，減輕慢性阻塞性肺疾病癥狀，而且對深部真菌感染有一定的協(xié)同治療作用，提升了整體治療效果。

綜上所述，氫氧機通氣具有安全、易操作等特點，且單獨氫氧機通氣處理即可實現(xiàn)高達93.5%的菌株殺傷效果，將其與抗真菌藥聯(lián)用還可進一步降低抗真菌藥對真菌的MIC, 其機制可能與氫氧機能增強真菌細胞內(nèi)ROS活性有關。本研究可為氫氧機在真菌感染輔助治療中的臨床應用提供一定的參考依據(jù)，但本研究選取的試驗菌株為臨床常見的深部真菌感染菌株，氫氣單獨或聯(lián)合抗真菌藥是否對廣譜真菌亦有直接殺傷或協(xié)同殺傷效果還需在后續(xù)研究中進一步證實。