高效液相色譜法同時(shí)測定徐長卿提取物中6種酚酸類成分含量

李志霞，李正國

（山東省濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 濟(jì)寧 272025）

徐長卿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名鬼督郵、別仙蹤、一枝香、老君須等，為蘿藤科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag.的干燥根或根莖。性溫，味辛，歸肝經(jīng)、胃經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、行氣活血、祛痛止癢、解毒消腫功效，主治風(fēng)濕痹痛、脘腹疼痛、牙痛、跌撲傷痛、泄瀉、痢疾、蕁麻疹、毒蛇咬傷等[1-2］。徐長卿富含揮發(fā)油類、C21甾體類、黃酮類、生物堿類、多糖類等成分[3-6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗腫瘤、保護(hù)軟骨細(xì)胞、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等作用[7-12］。目前的研究中僅將丹皮酚作為其檢測指標(biāo)性成分，檢測指標(biāo)較局限。本研究中通過提取純化方法制備徐長卿提取物，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測定徐長卿提取物中綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚的含量，旨在為徐長卿醫(yī)藥保健產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），配有Empower色譜工作站；ZFS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（青島聚創(chuàng)世紀(jì)環(huán)保科技有限公司）；Gilson型移液槍（吉而遜實(shí)驗(yàn)儀器＜上海＞有限公司）；RE30型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率為320 W，頻率為30 kHz）；真空干燥機(jī)（上海一恒醫(yī)療器械有限公司）；BS型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110753-202018，純度≥96.1%），香草酸對照品（批號為110776-201503，純度≥99.8%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，純度≥96.2%），丹皮酚對照品（批號為110708-201908，純度≥99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；丹皮酚原苷對照品（九鼎生物科技有限公司，批號為P1879，純度≥98%）；白前苷B對照品（四川艾克瑞思檢測技術(shù)有限公司，批號為202019，純度≥98%）；徐長卿提取物（實(shí)驗(yàn)室自制，批號分別為20210705，20210816，20210906，以下簡稱a，b，c）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；純化水（自制）；其余試劑均為分析純；徐長卿藥材購自安徽亳州中藥材市場，經(jīng)我院李正國主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～19 min時(shí)10%B～33%B，19～32 min時(shí)33%B～58%B，32～46 min時(shí)58%B～83%B，46～58 min時(shí)83%B～90%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 徐長卿提取物制備

稱取徐長卿適量，粉碎，過24目篩，加純化水回流提取3次，第1次加13倍量水，提取1 h，第2次和第3次均加10倍量水，提取1 h，合并提取液，濾過，減壓濃縮（-0.10 MPa，＜80℃）至相對密度為1.20（室溫），加乙醇充分?jǐn)嚢?，并使含醇量達(dá)60%，靜置24 h，濾過，得醇沉清液。醇沉清液先過001×7陽離子樹脂，收集流出液，回收乙醇，經(jīng)大孔樹脂[HPD300-HPD826（1∶1.5，V/V）］吸附，大孔樹脂用水洗[3 BV（柱體積）］，用60%乙醇4 BV進(jìn)行洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，即得。

2.3 溶液制備

混合對照品溶液：取綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚對照品各適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚質(zhì)量濃度分別為158.3，98.5，102.4，114.5，105.6，124.7μg/mL的混合對照品溶液，備用。

供試品溶液：取2.2項(xiàng)下徐長卿提取物100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇超聲使溶解，用乙腈定容，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.3項(xiàng)下混合對照品溶液和供試品溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1?？梢?，綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚6種成分的分離度良好，專屬性強(qiáng)。

圖1 高效液相色譜圖1.Chlorogenic acid 2.Vanillic acid 3.Hesperidin 4.Paeonolide 5.Vincetoxicosid B 6.Paeonol A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.3項(xiàng)下混合對照品溶液10，5，2.5，1，0.5，0.25 mL，分別置10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，得綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚質(zhì)量濃度分別為3.957 5，7.915，15.83，39.575，79.15，158.3μg/mL，2.462 5，4.925，9.85，24.625，49.25，98.5μg/mL，2.56，5.12，10.24，25.6，51.2，102.4μg/mL，2.862 5，5.725，11.45，28.625，57.25，114.5μg/mL，2.64，5.28，10.56，26.4，52.8，105.6μg/mL，3.117 5，6.235，12.47，31.175，62.35，124.7μg/mL的系列對照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并記錄峰面積，以對照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果各成分在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系均良好，詳見表1。

精密度試驗(yàn)：精密吸取綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚質(zhì)量濃度分別為15.83，9.85，10.24，11.45，10.56，12.47μg/mL的混合對照品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取徐長卿提取物（批號為b）100 mg，平行6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表1，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0，1，2，3，6，9，15，30 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表1，表明供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的徐長卿提取物（批號為b）50 mg，精密稱定，平行6份，加60%乙醇超聲使溶解，精密吸取綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚質(zhì)量濃度分別為15.83，9.85，10.24，11.45，10.56，12.47μg/mL的混合對照品溶液4 mL，置10 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，得供試品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test，precision repeatability，stability tests and recovery test（n=6）

2.5 樣品含量測定

取3批（批號分別為a，b，c）徐長卿提取物各100 mg，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定3次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of the content determination of six phenolic acids in samples（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚各對照品分別經(jīng)紫外全波長掃描，結(jié)果分別在326，261，283，278，268/371，275 nm波長處有最大吸收，在275 nm波長處的色譜峰峰形及基線均良好，綜合考慮，選擇275 nm作為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相選擇

考察了甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.2%醋酸、甲醇-0.1%磷酸及相應(yīng)乙腈體系的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%甲酸體系的基線平穩(wěn)、色譜峰峰形及分離度均顯著好于其他流動(dòng)相，且色譜圖中的綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚的保留時(shí)間均良好，故選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相。

3.3 大孔樹脂選擇

采用大孔樹脂聯(lián)用純化徐長卿提取物，前期通過篩選多種型號的大孔樹脂發(fā)現(xiàn)，HPD300和HPD826 2種型號大孔樹脂聯(lián)用的純化效果較好，其最佳混合比為1∶1.5（V/V）。HPD826能較好地保留有機(jī)酸類及黃酮苷類成分，如綠原酸、香草酸、橙皮苷等；HPD300能較好地吸附弱極性的甾體類、萜類及黃酮類成分。兩者混用可對不同類成分進(jìn)行吸附，使徐長卿中相關(guān)成分達(dá)到最大保留。

3.4 考察指標(biāo)選擇

選擇綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B、丹皮酚6種成分作為考察指標(biāo)，初步探索在本工藝條件下制備的徐長卿提取物成分的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，徐長卿提取物中丹皮酚、丹皮酚原苷和綠原酸的含量相對較高，香草酸、橙皮苷和白前苷B亦有較高的含量。結(jié)合丹皮酚和綠原酸在肝損傷、肝纖維化、肝脂肪堆積等肝病方面的功效顯著[13-16］，進(jìn)一步推測徐長卿中高含量的丹皮酚和綠原酸可能是其歸肝經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.5 方法評價(jià)

本研究中建立的HPLC法準(zhǔn)確、可靠、快捷，可用于同時(shí)測定徐長卿提取物中綠原酸、香草酸、橙皮苷、丹皮酚原苷、白前苷B及丹皮酚的含量及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)。