六堡茶真菌多樣性分析和優(yōu)勢真菌的分離篩選

楊 娟，陳欣怡，丁子元，田海霞，馬 躍，李 頌，鄭曉衛(wèi)*

1. 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司/中糧生物科技（北京）有限公司，北京 102209；2. 中茶科技（北京）有限公司，北京 102209

六堡茶是一種產(chǎn)自廣西梧州市六堡鄉(xiāng)的黑茶，為后發(fā)酵茶，具有色澤黑褐、湯色紅濃明亮、香氣醇陳等特點(diǎn)，以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱[1-2]。渥堆是六堡茶生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，在該過程中有大量的微生物生長繁殖，在濕熱作用和微生物分泌的酶系的作用下茶葉中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、粗纖維、碳水化合物、脂肪及茶多酚等發(fā)生一系列的轉(zhuǎn)化，形成氨基酸、多糖、酯類及茶色素等，最終影響和形成了六堡茶的品質(zhì)特點(diǎn)[3]。胡沛然[4]通過控制溫度條件，從渥堆茶葉中分離篩選嗜熱菌，共得到細(xì)菌5個(gè)屬14個(gè)種及霉菌5個(gè)屬9個(gè)種，最終篩選出3株產(chǎn)多酚氧化酶嗜熱菌，分別為傘狀毛霉菌（Lichtheimia corymbifera）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。另外，六堡茶素有“耐于久藏，越陳越好”的說法，陳化工藝是其呈現(xiàn)獨(dú)特的檳榔香氣的關(guān)鍵步驟[5]。陳慶金等[6]采用Miseq測序?qū)αげ桕惢跗诘恼婢鄻有赃M(jìn)行分析，在97%的相似水平下分類出62個(gè)OUT，3個(gè)門、6個(gè)綱、9個(gè)目、8個(gè)科和9個(gè)屬，分析發(fā)現(xiàn)陳化6 d的茶樣微生物豐富度最高，其中曲霉屬和散囊菌屬是陳化初期的優(yōu)勢菌屬。

目前六堡茶生產(chǎn)企業(yè)多采用渥堆發(fā)酵制作工藝，渥堆發(fā)酵菌種主要是來自原料或加工環(huán)境中的微生物，其種類和數(shù)量受到原料以及溫濕度等環(huán)境因素的影響，存在不同批次間產(chǎn)品微生物復(fù)雜多變、茶葉品質(zhì)的穩(wěn)定性不易控制等問題[7]；過程工藝控制不當(dāng)也可能會(huì)引入無用的雜菌或產(chǎn)生毒素的有害菌，對成品茶的品質(zhì)風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響，嚴(yán)重的會(huì)引發(fā)安全問題。研究表明黑曲霉中的某些菌株能夠產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬毒素等[8-9]，塔賓曲霉、溜曲霉等能夠產(chǎn)生赭曲霉毒素[10]。目前關(guān)于發(fā)酵茶的毒素報(bào)道多集中于普洱茶[11-13]，對六堡茶中真菌毒素的研究較少，主要圍繞毒素檢測方法的建立，如劉妍等[14]建立了六堡茶、普洱茶等發(fā)酵黑茶的黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等10種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

本試驗(yàn)研究針對不同陳化后的六堡茶樣品，通過真菌多樣性分析結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)挖掘優(yōu)勢真菌，評價(jià)優(yōu)勢真菌酶活及毒素情況，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)升級工藝后中茶新一代高品質(zhì)六堡茶，解析核心有益微生物，為打造高品質(zhì)六堡茶奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于梧州當(dāng)?shù)夭鑿S共采集到9份具有代表性的六堡茶樣品，其中4份陳放一年、4份陳放三年、1份陳放十三年，樣品具體信息見表1。樣品采集后分為兩份，其中一份于-80℃保存用于基因組提取后進(jìn)行高通量測序，另一份于4℃保存用于可培養(yǎng)方法分離。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 試劑與儀器

分離培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。保存培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基：可溶性淀粉2.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母粉1.0 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基：脫脂 2.0 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌15 min。產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基：CMC 1.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，磷酸二氫鉀0.1 g，硫酸鎂0.02 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂0.8 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌15 min。產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，NaCl 1.0 g，橄欖油乳化液1.0，瓊脂粉2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。產(chǎn)酯酶培養(yǎng)基：酵母浸膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，葡萄糖2.0 g，三丁酸甘油酯1.5 mL，溴甲酚紫0.004 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。

真菌DNA提取試劑盒、磁珠組織DNA提取試劑盒，購自美國Omega Bio-Tek公司；PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

生物安全柜，ESCO；電熱恒溫培養(yǎng)箱，Thermo；SQ810C立式壓力蒸汽滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；ME104型萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；VORTEX 3圓周振蕩器，德國IKA公司；ZQZY-CF 9.9振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；微量核酸蛋白分析儀（BioDrop-μLite），英國Biochrom有限公司；一次性培養(yǎng)皿、接種環(huán)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶樣DNA提取和高通量測序

將茶樣充分混勻，每份樣品隨機(jī)取樣3次，并用液氮充分研磨，利用百泰克磁珠組織DNA提取試劑盒提取茶樣的DNA，利用微量核酸蛋白分析儀檢測DNA的濃度及純度，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)對真菌翻譯間隔序列ITS1區(qū)進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3.2 茶樣中真菌的分離純化

菌懸液的制備：分別準(zhǔn)確稱取25 g茶樣，加入盛有225 mL生理鹽水的三角瓶內(nèi)（瓶內(nèi)放適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠），室溫180 r/min充分振蕩30 min，即為1∶10的稀釋液；吸取1∶10樣品勻液1 mL，注入盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，手動(dòng)震蕩30 s使液體混合菌液，制成1∶100的稀釋液，按照上述步驟依次制備10-3、10-4、10-5、10-6的梯度稀釋液。

菌株的分離純化：用無菌移液器分別吸取10-2～ 10-6濃度梯度的稀釋液100 μL，涂布于孟加拉紅平板培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，置于30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。從第2天開始根據(jù)菌落表型特征挑取不同的單菌落進(jìn)行劃線分純，多次劃線后得到純的菌株。分純后轉(zhuǎn)接PDA試管斜面并于4℃保存，同時(shí)光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)學(xué)特征。

1.3.3 菌株DNA序列分析

將分離的純菌株接種到100 mL的PDB液體培養(yǎng)基中，180 r/min搖床培養(yǎng)3 d后收集菌體，利用百泰克真菌提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。將提取的基因組DNA送至上海生工技術(shù)有限公司分別利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增真菌核糖體 RNA基因（即rDNA）的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer, ITS），利用β-tubulin基因霉菌通用引物Bt2a （5'-GGTAACCAAATCGGTGCT GCTTTC-3'）和 Bt2b（5'-ACCCTCAGTGTAGTGACC CTTGGC-3')擴(kuò)增β微管蛋白（β-tubulin）基因序列。測序完成后將測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，利用Blastn軟件進(jìn)行同源序列比對，下載與目標(biāo)菌株相近種的模式菌株序列作為參比菌，采用MEGA 7軟件用鄰位相連法（Neighborjoining）的算法構(gòu)建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株酶活測定

種子液制備：將分純得到的菌株挑取一環(huán)菌絲，分別接種到裝有2 mL YPD液體培養(yǎng)基的24孔板中，搖床培養(yǎng)10 h后作為測定酶活的種子液。

酶活測定：取種子液10 μL點(diǎn)接到各個(gè)酶活篩選培養(yǎng)基平板上測定酶活，每株菌3個(gè)平板，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。淀粉酶活的測定需將稀碘液滴入平板染色30 min，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生淀粉水解圈。纖維素酶活的測定需將1 mg/mL剛果紅溶液滴入平板染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min。五種酶活的測定均測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計(jì)算其比值（D/d）。

1.3.5 毒素檢測

發(fā)酵液的制備：菌株接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5 d。利用無菌打孔器在培養(yǎng)基上打孔，挑取4塊菌餅接種于PDB液體培養(yǎng)基中，30℃、200 rpm搖床培養(yǎng)3 d，得到的發(fā)酵液8000 rpm離心30 min后得到上清液備用。

茶葉樣品的前處理：分別稱取25 g茶葉樣品（精確至0.01 g），加入5 g NaCl，然后準(zhǔn)確加入甲醇-水溶液（80+20）100 mL，振蕩器震蕩30 min后經(jīng)定量濾紙過濾，移取10 mL濾液并加入40 mL PBS，玻璃纖維濾紙過濾至澄清，澄清液備用。

樣品的凈化：準(zhǔn)確移取20 mL上清液，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1 ～ 2滴/s的速度穩(wěn)定下滴。待樣液流干，加入10 mL1%吐溫-20的PBS（4.2.4），流干后加入10 mL水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用洗耳球抽干親和柱。在親和柱下部放置10 mL刻度試管，取下50 mL的注射器筒，依次準(zhǔn)確加入1 mL甲醇、2 mL水洗脫親和柱，控制1 ～ 2滴/s的速度下滴，再抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中，渦旋30 s，過PTFE濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

毒素檢測：利用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法通過高效液相色譜對茶葉中常見的真菌毒素（黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素以及桔青霉毒素）進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序OTU分析結(jié)果

利用Uparse軟件對高通量測序得到的序列在97%相似度下對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類分析，9個(gè)茶葉樣品共產(chǎn)生89個(gè)OTU，每個(gè)樣品測序得到的OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等見表2。Shannon和Simpson指數(shù)反映出六堡茶發(fā)酵過程真菌物種多樣性，指數(shù)越高說明群落多樣性越豐富，Chao是用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，ACE用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，這兩個(gè)指數(shù)反映出普洱茶發(fā)酵過程中真菌物種豐度，數(shù)值越大豐度越高。

表2 各樣品的OUT數(shù)量及多樣性指數(shù)Table 2 The OTU number and the diversity index of the sequencing results of each sample

由表2可知，未經(jīng)過高溫蒸壓的茶葉樣品中的真菌多樣性較高（Y2020_00360除外），其中經(jīng)渥堆發(fā)酵未蒸壓的兩個(gè)樣品Y2020_0901042和Y2018_701017的Shannon指數(shù)均較高，表明其中的微生物種類均較多。

2.2 真菌屬級單元多樣性及豐度

為得到每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類信息，將上述聚類得到的89個(gè)OTU代表序列在真菌ITS數(shù)據(jù)庫（Unite）中進(jìn)行比對和物種注釋，89個(gè)OTU歸屬于4個(gè)門、6個(gè)綱、6個(gè)目、8個(gè)科和8個(gè)屬，各樣品中屬水平的多樣性分布見圖1。由圖1可知，各樣品中豐度大于1%的屬級分類單元包括：曲霉屬（Aspergillus）、芽生葡萄孢酵母屬（Blastobotrys）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、青霉菌屬（Penicillium）、Rasamsonia、油壺菌屬（Olpidium），其中曲霉屬（Aspergillus）在Y2020_2、Y2018_60219、Y2020_023056等多個(gè)樣品中豐度達(dá)70%以上，為絕對優(yōu)勢屬。

圖1 真菌屬級分列單元在各茶葉樣品中的分布情況Figure 1 The taxonomic composition distribution in tea samples at genus-level

2.3 物種聚類結(jié)果

各樣品間物種組成聚類分析結(jié)果詳見圖2。樣品間越靠近，枝長越短，說明兩個(gè)樣品的物種組成越相似。由圖2可知樣品Y2018_60219（經(jīng)渥堆發(fā)酵和蒸壓）與其他樣品中真菌多樣性相差最遠(yuǎn)，樣品Y2018_0068、Y2020_0901042、Y2018_701017、Y2020_023056以及Y2020_00360聚為一支，距離較近，該分組中大多數(shù)樣品為經(jīng)過渥堆發(fā)酵但未經(jīng)過蒸壓工藝；成品Y2018、Y2020以及Y2018_5501聚為一支，距離較近，該組樣品全部為成品。由此我們推斷六堡茶的發(fā)酵工藝會(huì)影響其真菌多樣性，并最終影響了六堡茶的品質(zhì)特征，具體到各工藝階段的作用有待進(jìn)一步研究。

圖2 樣品間的聚類分析結(jié)果Figure 2 Clustering results of samples

2.4 可培養(yǎng)真菌的分離與鑒定結(jié)果

利用可培養(yǎng)方法從9個(gè)六堡茶樣品中分離優(yōu)勢真菌，共分離到優(yōu)勢真菌純培養(yǎng)物20株，按照分離挑取單菌落時(shí)間順序分別編號(hào)為CHA1-CHA7和CHA9～CHA21，通過形態(tài)學(xué)與核酸序列分析可知分離到的霉菌全部為曲霉屬，與高通量測序結(jié)果吻合。根據(jù)菌株鑒定結(jié)果，20株菌株可以歸為2類，分別是塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、琉球曲霉（A.luchuensis），其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)見圖3。

圖3 塔賓曲霉CHA11、琉球曲霉CHA12在PDA培養(yǎng)基上的宏觀形態(tài)及其對應(yīng)的微觀形態(tài)Figure 3 Colony morphology and microscopic morphology of A. tubingensis CHA11 and A. luchuensis CHA12 on PDA

將PCR擴(kuò)增測序得到的ITS rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLASTn進(jìn)行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20株菌株的ITS rDNA序列與琉球曲霉、塔賓曲霉、A.costaricensis、A.piperis等的序列相似性均高于99%，利用該序列無法將這些菌株區(qū)分開，需要結(jié)合微管蛋白基因（β-tubulin）進(jìn)行區(qū)分。

將基于ITS序列的測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行序列比對分析，下載與目標(biāo)菌株相近種的模式菌株β-tubulin基因序列，利用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對，在用MEGA 7.0進(jìn)行鄰接法（neighbor joining）聚類系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，菌株CHA1、CHA2、CHA4、CHA5、CHA6、CHA7、CHA9、CHA10、CHA12、CHA16、CHA17、CHA18、CHA19、CHA20、CHA21與琉球曲霉聚類于同一分枝上，菌株CHA3、CHA11、CHA13、CHA14、CHA15與塔賓曲霉聚類于同一分枝上，可見這9個(gè)六堡茶樣品中優(yōu)勢曲霉屬的種類較為單一。分離菌株的聚類結(jié)果及分離來源見表3。

圖4 基于β-tubulin基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on the BenA gene

2.5 分離菌株的酶活

對分離自不同年份的六堡茶的真菌菌株進(jìn)行不同種類酶活的檢測（表4），菌株CHA12的淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶以及酯酶酶活均較高，分別為2.59±0.15、1.16±0.06、1.17±0.04、1.6±0.02和1.47±0.02，與其他菌株相比5種酶活均具有差異顯著性，因此菌株CHA12為六堡茶的潛在功能菌株。

表4 分離菌株的酶活結(jié)果Table 4 The enzyme activities of five kinds of isolated strains

2.6 真菌的毒素

利用HPLC法檢測結(jié)果顯示，菌株CHA12的發(fā)酵液四種真菌毒素結(jié)果如表5所示，均低于檢出線，可見該菌株生物安全性較高。

表5 琉球曲霉CHA12發(fā)酵液的毒素檢測結(jié)果Table 5 Toxin detection results of A. luchuensis CHA12 fermentation broth

對9種茶葉樣品采用HPLC法對常見的四種真菌毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示這9種茶葉樣品的檢測結(jié)果均為陰性未檢出，毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖以及部分樣品的檢測色譜圖見圖5及圖6。

圖5 樣品Y2018_60219的黃曲霉毒素檢測色譜圖Figure 5 Aflatoxin detection chromatogram of sample Y2018_60219

圖6 樣品Y2008的赭曲霉毒素A檢測色譜圖Figure 6 Ochratoxin A detection chromatogram of sample Y2008

3 討論

本試驗(yàn)研究通過高通量測序揭示了取自梧州代表性茶廠的9個(gè)六堡茶樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)，通過分析發(fā)現(xiàn)六堡茶樣品中的優(yōu)勢真菌主要為曲霉屬（Aspergillus）、芽生葡萄孢酵母屬（Blastobotrys）及節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia），共分析得到94個(gè)OUT，可以歸類為4個(gè)門、6個(gè)綱、6個(gè)目、8個(gè)科以及8個(gè)屬。分離20株優(yōu)勢真菌同屬于曲霉屬，其中數(shù)量最多的為琉球曲霉，其次為塔賓曲霉。高通量測序結(jié)果與菌株分離結(jié)果相吻合，但是高通量測序結(jié)果顯示豐度較高的芽生葡萄孢酵母屬及節(jié)擔(dān)菌屬通過可培養(yǎng)方法并未分離到，可能是由于這些種屬的菌在陳放過程中逐漸消亡，僅以死菌的形式存在于茶葉中。

目前研究者們利用高通量測序技術(shù)對六堡茶中的真菌多樣性也進(jìn)行了大量的研究，徐書澤[7]利用高通量測序技術(shù)對梧州茶廠的4個(gè)成品六堡茶的真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，共鑒定得到3個(gè)門、7個(gè)綱、9個(gè)目、6個(gè)科和8個(gè)屬的真菌類群，包括曲霉屬（Aspergillus）、散囊菌屬（Eurotium）、青霉屬（Penicillium）、Blastobotrys、Guehomyces、Rasamsonia、Rossbeevera和翹孢霉屬（Emericella），其中曲霉屬和散囊菌屬在這4個(gè)樣品中的相對豐度最高；同時(shí)通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)分離鑒定得到了曲霉屬中的8種微生物，包括黑曲霉、塔賓曲霉、煙曲霉、米曲霉、薩氏曲霉、赭曲霉、溜曲霉以及菌核曲霉。楊雅焯等[15]利用高通量測序的方法對比六堡茶和重慶沱茶的微生物多樣性區(qū)別，發(fā)現(xiàn)Blastobotrys是六堡茶的真菌優(yōu)勢菌。

本試驗(yàn)分離得到的優(yōu)勢真菌為曲霉屬真菌，其中琉球曲霉在六堡茶中為首次報(bào)道，與已有報(bào)道的六堡茶發(fā)酵過程中優(yōu)勢種為曲霉屬中的黑曲霉（A.niger）、塔賓曲霉（A. tubingensis）[7,16-17]、散囊菌屬中的冠突散囊菌（A.cristatus）、謝瓦氏散囊菌（A.cheralieri）[18-20]等的結(jié)果均不一致。該結(jié)果表明不同廠家的六堡茶其真菌種類各有特征且差異較大，推測差異主要源于生產(chǎn)環(huán)境以及原料中微生物種類及數(shù)量的不同。

六堡茶發(fā)酵過程中，微生物通過自身的代謝產(chǎn)生多種胞外酶，對淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、果膠以及茶多酚等大分子物質(zhì)進(jìn)行分解，也產(chǎn)生多種香氣物質(zhì)[21-22]，最終影響了六堡茶的品質(zhì)。六堡茶特有色香味的形成，是蛋白質(zhì)、茶多酚等物質(zhì)在發(fā)酵過程中由于水分、溫度及有益微生物的綜合作用，發(fā)生水解、糖解和氧化聚合等物理和化學(xué)變化而形成的[23]，因此本研究還考察了分離自六堡茶的20株霉菌產(chǎn)胞外酶的能力，并從中選取了一株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及酯酶能力都較強(qiáng)的琉球曲霉，通過選育產(chǎn)酶性能優(yōu)良的菌株，以期提升茶葉傳統(tǒng)發(fā)酵工藝。

六堡茶等黑茶的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。本文還分析了9份茶葉樣品以及通過產(chǎn)酶特性篩選得到的菌株發(fā)酵液的產(chǎn)毒素情況，發(fā)現(xiàn)茶葉中常見的四種真菌毒素包括黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）、赭曲霉毒素A、伏馬毒素以及桔青霉毒素均未檢出，且優(yōu)勢菌琉球曲霉未見產(chǎn)毒素和致病性報(bào)道[24]。

本試驗(yàn)研究通過對六堡茶真菌多樣性、多種酶活、產(chǎn)毒素情況進(jìn)行分析，篩選獲得一株產(chǎn)酶性能優(yōu)良且安全性好的琉球曲霉CHA 12，該菌株對中茶六堡茶工藝升級和品質(zhì)穩(wěn)定性提升具有重要意義，該菌株的應(yīng)用可促進(jìn)六堡茶產(chǎn)品升級和發(fā)酵茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展。