楊 俊,聶福平,王 昱,史梅梅,謝曉倩,王國民,李賢良,吳 蕊,張 歡,唐昌杰,李應(yīng)國
(重慶海關(guān)技術(shù)中心,重慶 400020)
豬瘟,又被稱為古典豬瘟(classical swine fever,CSF)、爛腸瘟,是一種感染了豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)而引起的高度接觸性的急性傳染病。該病流行廣泛,發(fā)病率和死亡率高,是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的通報(bào)類傳染病[1],在我國《進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》中列為一類傳染病。
重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),在較低溫度下,15~30 min即可完成檢測,具有反應(yīng)條件溫和、擴(kuò)增效率高的優(yōu)點(diǎn),并且通過在反應(yīng)體系中加入熒光探針可實(shí)現(xiàn)對擴(kuò)增對象的實(shí)時(shí)檢測。該研究基于RPA檢測技術(shù),針對CSFV基因組的5′端非編碼區(qū)高度保守序列設(shè)計(jì)并合成了特異性的引物和exo探針,成功建立了實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測豬瘟病毒的方法,以期為豬瘟快速診斷提供新的選擇。
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1毒株。豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)疫苗株(石門株)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis,TGEV)(IND型)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)(AP76)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)(SH0165)、豬肺炎支原體(mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)(168-L)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)(BIAH-001)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine cirovirus Type 2,PCV-2)(PM167)、豬水皰病病毒(swine vesieular virus,SVDV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)疫苗株(cp99),由重慶海關(guān)技術(shù)中心動物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2主要試劑。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit、Premix TaqTM、DL2000 DNA Marker、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit、PMDTM19-T Vector Cloning kit、DH5a感受態(tài)細(xì)胞、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification kit,購自寶生物工程(大連)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;Twist Amp exo kit,購自英國Twist Dx 公司。
1.1.3主要儀器。Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)(英國OptiGene);NanoDrop oneC 微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo Scientific);Veriti 96多功能梯度PCR儀器(美國Applied Biosystems);GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad);Centrifuge 5417R高速離心機(jī)(德國Eppendorf)。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1引物和探針。CSFV 5′NTR由360~374個(gè)堿基組成,具有高度保守性。該研究選擇該部分序列作為擴(kuò)增對象,從NCBI下載CSFV基因組5′NTR序列進(jìn)行分析,參考Twist Amp exo kit關(guān)于RPA引物和exo探針的設(shè)計(jì)要求,利用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)RPA引物和exo探針,委托TAKARA公司合成。引物及探針序列如下:CSFV-RPA-F:5′-GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGAC-3′;CSFV-RPA-R:5′-CTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGA-3′;CSFV-RPA-P:5′-GTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGTTCTAAGT(FAM)-(THF)CT(BHQ1)-GAGTACAGGACAG-(P)-3′;其中,F(xiàn)AM為羧基熒光素,THF為四氫呋喃,BHQ1為黑洞猝滅劑 1,P為磷酸鹽基團(tuán)。
1.2.2病毒核酸的提取。使用TaKaRa公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒分別提取CSFV、TGEV、PRRSV、SVDV的RNA以及PCR-2和PPV的DNA,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取APP、HPS和Mhp的DNA,以上操作過程均在生物安全柜中進(jìn)行。RNA提取完成后立即使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。cDNA和DNA均置-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建。CSFV核酸RNA提取后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以該cDNA作為模板,用設(shè)計(jì)的CSFV RPA引物(CSFV-RPA-F/CSFV-RPA-R)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確定得到預(yù)期大小的擴(kuò)增子并回收,連接到PMDTM-19T載體,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,從陽性克隆中提取質(zhì)粒,利用紫外可見核酸蛋白分析儀(NanoDrop oneC) 測定其濃度,根據(jù)公式:拷貝數(shù)=[濃度(ng/μL)×6.02×1023×10-9]/(DNA長度×660)計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化。Twist Amp exo kit提供的反應(yīng)管中已經(jīng)預(yù)混了各種酶,按其說明書要求,向反應(yīng)管中加入Rehy-dration Buffer 29.5 μL、ddH2O 8.2 μL,10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL,10 μmol/L探針0.6 μL,模板5 μL,向反應(yīng)管的蓋子中加入Mg2+2.5 μL,蓋上蓋,瞬時(shí)離心后立即將反應(yīng)管置于OptiGene Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng),分別在35、37、39、40、42 ℃下反應(yīng)40 min,根據(jù)擴(kuò)增曲線,確定最適反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)時(shí)間。
1.2.5CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA特異性試驗(yàn)。RPA引物長度為30~35 nt,exo探針長度為46~52 nt,比普通PCR和熒光定量PCR的引物、探針都更長,理論上具有更高的特異性。為了驗(yàn)證CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA的特異性,選擇CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、PCV-2、SVDV、PPV的cDNA或DNA作為模板,以無菌去離子水作為陰性對照,在確定的最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行檢測,評價(jià)方法的特異性。
1.2.6CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA敏感性試驗(yàn)。為測試CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法的敏感性,將擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒并測定濃度,計(jì)算拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋,取各個(gè)稀釋度的質(zhì)粒分別作為模板,在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行RPA擴(kuò)增,確定該方法的最低檢出限。
1.2.7臨床樣品檢測。從重慶某養(yǎng)豬場采集20份血清樣本、5份淋巴結(jié)樣本、5份肝臟樣本和3份腎臟樣本,分別提取核酸,用建立的CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA方法進(jìn)行豬瘟病毒核酸檢測,以評價(jià)其在實(shí)際檢測中的效果,同時(shí),采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16551—2020對所有樣本進(jìn)行豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測,比較2種方法的符合性。
2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備將CSFV擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,提取含有CSFV核酸片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,將測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST比對,結(jié)果顯示,插入的核酸片段大小為124 bp,與預(yù)期一致,與CSFV具有高度同源性,相似度達(dá)到99%以上。經(jīng)紫外可見核酸蛋白分析儀測定,該質(zhì)粒濃度為25.5 ng/μL,A260/A280值為1.87,計(jì)算出拷貝數(shù)為8.3×109copies/μL。
2.2 CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化將配制好的反應(yīng)體系分別在35、37、39、40、42 ℃下進(jìn)行RPA反應(yīng),檢測熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1),隨著反應(yīng)溫度升高,檢測到熒光信號所需的時(shí)間更短,且最終的熒光強(qiáng)度也更高,但當(dāng)反應(yīng)溫度超過39 ℃后,熒光信號反而出現(xiàn)下降;隨著時(shí)間延伸,熒光信號不斷積累,但30 min以后,熒光強(qiáng)度不再升高,說明反應(yīng)進(jìn)入平臺期。綜上,CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為39 ℃、30 min。
圖1 豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法的優(yōu)化
2.3 CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA特異性試驗(yàn)為了驗(yàn)證CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法的特異性,選擇CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、SVDV、PPV、PCV-2等豬場常見的豬病作為研究對象,提取核酸后分別用建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果見圖2。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,CSFV陽性樣品在反應(yīng)開始6 min后熒光強(qiáng)度逐漸升高,相比之下,其他樣本和陰性對照在30 min之內(nèi)都無熒光信號產(chǎn)生,說明該方法對上述除CSFV之外的常見豬病病原無反應(yīng),特異性良好。
注:1.豬瘟病毒;2~10.豬傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬水皰病病毒、豬細(xì)小病毒、陰性對照
2.4 CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA敏感性試驗(yàn)經(jīng)測定CSFV重組質(zhì)粒濃度為8.3×109copies/μL,將該質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋,取每個(gè)稀釋度的質(zhì)粒5 μL分別作為模板,用建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示(圖3),隨著質(zhì)粒濃度的降低,能夠檢測到熒光信號的時(shí)間也隨之延后,而且最終的熒光信號強(qiáng)度也相應(yīng)降低,當(dāng)CSFV重組質(zhì)粒濃度降至8.3×102copies/μL 以下,檢測不到熒光信號,因此,該CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA方法最低檢出限為8.3×102copies/μL,靈敏度較好。
注:1~6為8.3×107~8.3×102 copies/μL
2.5 臨床樣品檢測從重慶某養(yǎng)豬場采集了33份樣本,同時(shí)使用建立的CSFV實(shí)時(shí)熒光RPA方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法對這些樣本進(jìn)行豬瘟病毒核酸檢測,結(jié)果顯示(表2),RPA方法從20份血清樣本中檢出2份CSFV核酸陽性,從5份淋巴結(jié)樣本中檢出2份CSFV核酸陽性,從5份肝臟樣本中檢出1份CSFV核酸陽性,從3份腎臟樣本中檢出1份CSFV核酸陽性,與國家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果完全一致。
表2 豬瘟病毒臨床樣本檢測結(jié)果
我國于1954年研制出豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV),并大規(guī)模地進(jìn)行疫苗接種,現(xiàn)成功控制了該病的大流行,但目前豬瘟仍呈散發(fā)流行的新態(tài)勢,增大了豬瘟防控的難度。此外,家豬和野豬都是CSFV的宿主,野豬可能在CSF的流行和傳播中發(fā)揮重要作用。即便某地區(qū)的家豬中已經(jīng)根除了CSF,如果同地區(qū)的野豬群中仍有該病流行,仍有可能將病毒傳入養(yǎng)殖場中[2]。
快速可靠的診斷對于及時(shí)實(shí)施CSFV控制措施至關(guān)重要,由于目前豬瘟常以非典型形式出現(xiàn),且癥狀與豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病、豬細(xì)小病毒等相似,因此,需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測來確診該病。CSFV的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有RT-PCR試驗(yàn)[3-11],該技術(shù)目前已比較成熟,有許多商品化的CSFV核酸檢測試劑盒可供選擇。為了實(shí)現(xiàn)CSF的現(xiàn)場檢測,有研究人員開發(fā)出了便攜RT-PCR系統(tǒng)[12]、引物-探針能量轉(zhuǎn)移 RT-qPCR系統(tǒng)[13-14]等。為了替代PCR的熱循環(huán)模式還誕生了很多等溫?cái)U(kuò)增方法,如恒溫隔絕式RT-qPCR[15]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP)[16-21]和RPA;CSFV也可以通過傳代細(xì)胞系,如豬腎細(xì)胞系PK15或SK6上培養(yǎng)分離而得到確診,但病毒分離對環(huán)境潔凈度要求極高,需要非常熟練的試驗(yàn)人員來操作,容易發(fā)生污染導(dǎo)致試驗(yàn)失??;此外,還可以使用血清學(xué)的方法來診斷CSFV,如熒光抗體或免疫過氧化物酶測定法等[22-23],但有研究指出,同屬的牛病毒性腹瀉病毒-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea-mucosal dicease virus,BVDB)和綿羊邊界病病毒(border disease virus,BVD)在抗原性上與CSFV存在交叉反應(yīng),這2種病毒都能夠感染豬,而且抗體水平通常比CSF高[24]。因此,血清學(xué)的方法在檢測豬瘟病毒方面存在敏感性低、特異性差的問題,僅適用于發(fā)病豬的檢測[25]。
RPA最早由Niall Armes于2006年提出,該技術(shù)包含3種核心蛋白、重組酶(T4 UvsX protein)、重組酶加載因子(T4 UvsY)和單鏈結(jié)合蛋白(T4 gp32)。重組酶在重組酶加載因子的協(xié)助下,尋找并侵入同源序列形成D-環(huán)結(jié)構(gòu),啟動鏈置換反應(yīng),DNA聚合酶(Bsu或Sau)則在引物的3-OH端開始合成一條與父鏈完全一樣的子鏈,最后,實(shí)現(xiàn)類似PCR結(jié)果的目標(biāo)DNA指數(shù)擴(kuò)增。相比PCR技術(shù),RPA的技術(shù)優(yōu)勢主要體現(xiàn)在:①反應(yīng)效率高,節(jié)省時(shí)間。RPA反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行,明顯減少循環(huán)加溫和降溫的等待時(shí)間;反應(yīng)具有高度的并行性,一條鏈上可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)聚合酶的擴(kuò)增。②對儀器設(shè)備的要求低,適合田間、基層實(shí)驗(yàn)室等開展核酸檢測和研究。相比其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、信號介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)(SMART)、依賴解旋酶核酸擴(kuò)增(HDA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等,RPA同樣優(yōu)勢明顯,具體表現(xiàn)在:①對核酸類型無要求,可以實(shí)現(xiàn)對DNA或RNA信號的放大,而NASBA只能擴(kuò)增RNA。②容易掌握,僅需設(shè)計(jì)一對稍長的特異引物(30~35 mer)即可進(jìn)行RPA試驗(yàn),也可以再設(shè)計(jì)一條帶熒光標(biāo)記的探針實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光檢測;而LAMP 技術(shù)需要多對引物,設(shè)計(jì)難度高,要篩選出合適的引物需要耗費(fèi)大量工作。③RPA的產(chǎn)物是雙鏈DNA分子,可以利用許多PCR平臺成熟的試劑和技術(shù)進(jìn)行分析;LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物是一些大小不等的片段,對下游技術(shù)限制較大,無法進(jìn)行直接克隆和測序,只能用于判斷目的基因的存在,這也是LAMP方法最大的局限性。正因?yàn)镽PA的上述優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)自問世以來深受廣大科研工作者喜愛,被稱為有望替代PCR的新一代型核酸檢測技術(shù),在疫病診斷方面得到廣泛應(yīng)用。楊俊等[26]建立了綿羊痘病毒和山羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測方法,靈敏度高,特異性強(qiáng),為綿羊痘病毒和山羊痘病毒的鑒別診斷提供了技術(shù)支持;Abd等[27]基于RPA技術(shù),建立了可以檢測所有的7個(gè)口蹄疫病毒血清型的方法;Wang等[28]建立了PCV2實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法,靈敏度比普通PCR高10倍;王建昌等[29]針對非洲豬瘟病毒VP72保守基因序列建立的RPA檢測方法,在38 ℃恒溫反應(yīng)30 min即可獲得檢測結(jié)果。
該研究在開展過程中也發(fā)現(xiàn)RPA存在的不足,如擴(kuò)增片段不能太長,超過500 bp則會明顯降低其擴(kuò)增效率,甚至無法擴(kuò)增出目的片段;其次,由于其所需反應(yīng)溫度溫和、反應(yīng)速率快,往往在加樣過程中擴(kuò)增就已經(jīng)開始,無法控制擴(kuò)增起始時(shí)間,暫時(shí)無法實(shí)現(xiàn)熒光PCR的定量檢測功能,但對于定性檢測無任何影響。
該研究基于RPA檢測技術(shù),針對CSFV 5′UTR高度保守的序列,設(shè)計(jì)了特異性引物和探針,建立了實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法,實(shí)現(xiàn)了CSFV的快速診斷。該方法與APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV、SVDV、TGEV、PPV無交叉反應(yīng),檢出限達(dá)到8.3×102copies/μL,特異性好,敏感性高,為CSFV的快速、準(zhǔn)確診斷提供了強(qiáng)有力的工具。