卵黃抗體在水產(chǎn)疾病防治中的研究應(yīng)用進(jìn)展

范賢平，蔣 葛，喬 毅，沈 輝*，徐軍田

(1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222000；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007)

近年來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖產(chǎn)能長(zhǎng)期處于世界首位。隨著高密度、工廠化、集約化養(yǎng)殖模式的建立和推廣，水環(huán)境污染、水生動(dòng)物病害等問題已成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的主要瓶頸[1]。尤其抗生素等藥物的大量使用，造成了養(yǎng)殖生物大量藥物殘留、病原菌耐藥性增加、環(huán)境污染等嚴(yán)重問題[2]。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)急需安全、高效的抗生素替代品[3]。

IgY(immunoglobulin of yolk，IgY)又稱卵黃免疫球蛋白，因其具有特異性強(qiáng)、無(wú)毒副作用、制備方便、經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)明顯等特點(diǎn)，已被廣大研究者所關(guān)注。近年來(lái)，該技術(shù)被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，以治療某些水生動(dòng)物的傳染病[4]。IgY技術(shù)在預(yù)防和治療水產(chǎn)細(xì)菌性方面取得了豐富的進(jìn)展，如弧菌病、腐皮病、愛德華氏菌病、敗血病等。另外，針對(duì)水生病毒性疾病如蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)、神經(jīng)壞死病毒(nervous necrosis virus,NNV)、彈狀病毒(micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV)等水生疾病方面也有研究報(bào)道。此外，該技術(shù)還應(yīng)用于病原診斷和海鮮保存，豐富了IgY的研究應(yīng)用。筆者總結(jié)了IgY的結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)、作用機(jī)理等，綜述了近年來(lái)水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中IgY的應(yīng)用，以期為IgY在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中的深入研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 IgY基本特征

1.1 IgY的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)IgY分子的結(jié)構(gòu)與動(dòng)物免疫球蛋白G(IgG)相似，都具有兩條重鏈和兩條輕鏈，且呈Y字形排列。不同之處在于IgG的重鏈具有3個(gè)恒定區(qū)，且含有鉸鏈區(qū)，而IgY具有4個(gè)恒定區(qū)。此外，鉸鏈區(qū)的缺失使得IgY與IgG的抗原識(shí)別和結(jié)合能力不同[5]。IgY的等電點(diǎn)為pH 5.7～7.6，比IgG更疏水[5]。IgY的Fc片段與IgG不同，不會(huì)激活哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)[6]。同樣，IgY不與IgA、IgG或類風(fēng)濕因子結(jié)合，從而避免了假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生[5]。

1.2 IgY的優(yōu)勢(shì)在IgY制備方面，少量的抗原刺激可引起蛋雞強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，特異性抗體可以在蛋雞體內(nèi)連續(xù)合成，抗體產(chǎn)生的周期較長(zhǎng)。每枚蛋可收集100～200 mg IgY，成本較低[7]；同時(shí)避免了采血對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，符合動(dòng)物福利的要求[8]。另外，抗體提取方式簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模生產(chǎn)，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有耐酸、耐堿、耐熱的特點(diǎn)[9]。IgY與抗生素相比，IgY具有療效高、作用快、不易產(chǎn)生耐藥菌和繼發(fā)感染等特點(diǎn)，對(duì)病原具有較強(qiáng)的特異性，無(wú)毒副作用，具有局部和快速吸收作用及更高的比活性，并且不會(huì)有有害物質(zhì)殘留[10]。IgY在對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[11]、鰻鱺(Anguillajaponica)[12]及中華鱉(Trionyxsinensis)[13]的病原防治過程中，除可有效抑制病原的侵染力外，還具有明顯的促生長(zhǎng)作用。

2 IgY在水產(chǎn)細(xì)菌性疾病中的應(yīng)用

目前，盡管研究者們開展了一系列研究，但仍尚未完全闡明IgY在疾病的預(yù)防和治療中的作用機(jī)制。據(jù)已有研究報(bào)道，IgY主要通過抑菌活性、凝集作用、黏附抑制、對(duì)細(xì)菌毒素中和作用，吞噬調(diào)理作用方式發(fā)揮中和保護(hù)效果。

IgY的抑菌活性主要?dú)w因于IgY介導(dǎo)的細(xì)菌凝集作用[14-15]，細(xì)菌與特定IgY形成復(fù)合物，并在培養(yǎng)管底部沉淀形成小球，可能導(dǎo)致病原菌活動(dòng)性下降，降低其自由獲取營(yíng)養(yǎng)的能力，從而發(fā)揮抗菌作用[16-17]。有研究表明，特異性IgY以濃度依賴的方式抑制液體培養(yǎng)基中哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)[16]、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[17]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[15]、希瓦氏菌(Shewanellamarisflavi)[14]等的生長(zhǎng)。Zhang等[16]通過觀察液體培養(yǎng)基濁度來(lái)測(cè)量特異性IgY對(duì)哈維氏弧菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示特異性IgY的濃度越高，作用效果越明顯，10 mg/mL特異性IgY的生長(zhǎng)抑制作用與0.1 mg/mL鏈霉素相似(P>0.05)。此外，IgY在固體培養(yǎng)基上也表現(xiàn)出細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用，說(shuō)明特異性IgY的抑菌作用不僅有IgY介導(dǎo)的細(xì)菌凝集作用，還有一定的拮抗作用[16,18]。Xu等[17]對(duì)IgY與遲緩愛德華氏菌相互作用后的反應(yīng)溶液組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IgY能使菌體表面變得粗糙，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，甚至使菌體細(xì)胞壁破碎，內(nèi)容物溢出；MATH試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，遲緩愛德華氏菌與特異性IgY相互作用后疏水性顯著降低17%，表明抗原與IgY結(jié)合可以破壞病原體的細(xì)胞壁和疏水性，直接阻礙病原體在感染部位的黏附和營(yíng)養(yǎng)交換，從而還促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，降低體內(nèi)致病性，該結(jié)果是對(duì)IgY的抑菌機(jī)制進(jìn)一步補(bǔ)充。類似的結(jié)果在特異性IgY對(duì)希瓦氏菌[14]、燦爛弧菌(Vibriosplendidus)[19]的作用研究中也得到了印證。

此外，體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)顯示，特異性IgY能顯著降低在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevi)[20]和香魚(Plecoglossusaltivelis)[21]血液、肝臟、脾臟和腎臟中鰻弧菌(Vibrioanguillarum)的數(shù)量。除降低病原菌數(shù)量外，IgY還可以提高血細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬活性[14,16-17]。特異性IgY可以顯著降低大菱鲆脾臟和頭腎中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、TNF-α)和補(bǔ)體C3的轉(zhuǎn)錄水平，有效緩解遲緩愛德華氏菌引起的炎癥反應(yīng)，有助于避免炎癥細(xì)胞因子過度產(chǎn)生造成的組織病理學(xué)損傷[17]?？惯t緩愛德華氏菌特異性IgY還可以增強(qiáng)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)頭腎巨噬細(xì)胞的吞噬活性，刺激大菱鲆非特異性免疫相關(guān)酶(LZM、SOD、POD)的產(chǎn)生，并增強(qiáng)這些酶的活性[22]。

一般來(lái)講，致病菌的蛋白毒素與細(xì)胞表面受體結(jié)合后內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，才能使細(xì)胞發(fā)生病變，而IgY與細(xì)胞表面受體或毒素蛋白結(jié)合，中和這些毒素，并減少毒素蛋白進(jìn)入細(xì)胞來(lái)保護(hù)細(xì)胞的作用。近年來(lái)，一種新興的對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合征(AHPND)給對(duì)蝦養(yǎng)殖造成巨大損失。該病原一般為一種攜帶一個(gè)69 kD(pVA1)質(zhì)粒，可編碼PirA、PirB毒力蛋白的一類弧菌[23]。Nakamura等[24]開發(fā)了一種基于重組PirA毒素的特異性IgY，將10%高價(jià)抗PirA卵黃粉添加到飼料中，投喂3 d后IgY通過特異性結(jié)合并中和蝦消化系統(tǒng)中釋放的天然PirA毒素，與對(duì)照組相比，對(duì)蝦死亡率降低了75%。IgY在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病中的應(yīng)用見表1。

表1 IgY在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病中的應(yīng)用

續(xù)表1

3 IgY在病毒性疾病中的應(yīng)用

IgY除了在細(xì)菌疾病中的應(yīng)用外，在病毒疾病方面的防控也得到了廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，IgY可以抑制病毒顆粒的細(xì)胞間傳播，從而抑制病毒定植?？芎Ｑ嗟萚36]將卵黃粉稀釋液與CyHV-2混合后孵育鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC)，結(jié)果顯示CyHV-2病毒解螺旋酶(Hel)基因表達(dá)水平分別下調(diào)60%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異極顯著，表明IgY具有較好的病毒中和作用，可顯著降低病毒量。一般來(lái)講，采用甲醛滅活完整病毒粒子，可以得到較好的免疫效果IgY[37]。盧亞楠[38]將抗-WSSV特異性卵黃抗體溶于鰲蝦飼養(yǎng)水中，結(jié)果表明，DNA疫苗特異性IgY組死亡率為80%，滅活WSSV疫苗IgY組死亡率降低至33.3%。從抗原選擇上，以DNA疫苗產(chǎn)生的特異性IgY免疫保護(hù)效果弱于滅活疫苗。盡管IgY對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物不能直接激發(fā)其直接病原免疫作用，但可以引發(fā)其被動(dòng)免疫。韋嵩等[39]連續(xù)投喂添加抗WSSV-IgY飼料20 d，發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫因子(PO、SOD、ACP、UL)活性均顯著高于對(duì)照組。袁雪梅等[37]采用MSRV滅活疫苗免疫蛋雞，獲得抗MRSV-IgY，中和作用率達(dá)38%以上，病毒核酸拷貝數(shù)顯著降低，其凝集素在細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表達(dá)，表明其免疫作用被激活。IgY在水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病中的應(yīng)用見表2。

表2 IgY在水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病中的應(yīng)用

4 IgY在水產(chǎn)養(yǎng)殖診斷中的應(yīng)用

IgY除抑制病原外，還具有病原診斷檢測(cè)能力。李思泉等[46]采用甲醛滅活柱狀黃桿菌免疫蛋雞獲得IgY，建立的間接ELISA方法檢測(cè)柱狀黃桿菌純培養(yǎng)液的檢出限值為1×107cfu/mL，與嗜水氣單胞菌、哈維菌無(wú)交叉反應(yīng)，重復(fù)性好。另外，王帥兵等[47]以嗜水氣單胞菌主要致病因子Aer毒素和胞外蛋白酶(ECPase)作為免疫原制備IgY，與直接用嗜水氣單胞菌苗免疫制備的抗體相比，以Aer毒素和ECPase為免疫原獲得的抗體與不同來(lái)源菌株的致病因子間具有交叉反應(yīng)性，克服了不同血清型病原菌對(duì)IgY免疫保護(hù)的影響，具有廣泛的適用性。

Young等[48]制備了抗針對(duì)太平洋鮭魚(Oncorhynchusspp.)微孢子蟲的特異性IgY。通過間接免疫熒光抗體試驗(yàn)和免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)太平洋鮭魚各組織的感染。Zhang等[49]應(yīng)用膠體金與抗全身性敗血癥球形病毒(STSSSV)特異性IgY結(jié)合開發(fā)了一種具有高靈敏度和特異性的一步免疫層析條，可在5～10 min內(nèi)快速檢測(cè)甲魚肌肉組織和血清甚至糞便中全身性敗血癥球形病毒。IgY還能夠檢測(cè)水產(chǎn)品中有害物質(zhì)。Campora等[50]利用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)魚肉組織中的雪卡毒素，與軟海綿酸和軟骨藻酸無(wú)交叉反應(yīng)性。

5 存在問題及展望

IgY作為一種安全綠色抗體制劑，被用于檢測(cè)各種病原體、預(yù)防治療各種疾病，取得了豐富的研究成果及較為理想的應(yīng)用效果。然而，IgY的研究與應(yīng)用還存在諸多問題。

首先，IgY對(duì)于機(jī)體的作用機(jī)制并不單一，而是多種作用機(jī)制共同作用的的結(jié)果，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。其次，IgY對(duì)革蘭氏陰性菌抑制與應(yīng)用的報(bào)道較多，但針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的研究報(bào)道較少，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。再次，IgY抑制效果特異性還需要進(jìn)一步加強(qiáng)，IgY從傳統(tǒng)的滅活病原至蛋白水平的特異毒力或結(jié)構(gòu)蛋白為靶蛋白制備手段還需要對(duì)病原學(xué)進(jìn)一步的協(xié)同，提高其特異性效果。最后，IgY防治技術(shù)和產(chǎn)品應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程尚未建立，使IgY作為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治產(chǎn)品而產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有一定的困難。但隨著研究的不斷深入，IgY在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治、水產(chǎn)品的保鮮及病害的診斷等方面將有更好的應(yīng)用前景。