帕金森?。≒D）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究統(tǒng)計(jì)與分析＊

文/李金鳳，鐘海潮，王諾

帕金森?。≒D）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，位列神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率第二。目前，該病病因、發(fā)病機(jī)制等尚無(wú)確切定論，患者多見行動(dòng)緩慢、肌肉僵直、靜止性震顫、姿勢(shì)異常、便秘、嗅覺(jué)障礙、自主神經(jīng)功能障礙等?；颊咄砥谕斫┲保畈荒茏岳?，影響患者、家屬的生活質(zhì)量。

1 帕金森病動(dòng)物化學(xué)藥物模型

6-羥基多巴胺屬神經(jīng)毒素，分子結(jié)構(gòu)式類似DA，注射至中腦黑質(zhì)后，在進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中，多與DA產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，其化學(xué)性質(zhì)具有不穩(wěn)定性，可在細(xì)胞內(nèi)外自動(dòng)氧化，成為活性氧(ROS)、6-羥多胺醌(6-OHDAO)，其在單胺氧化酶(MAO)誘下，生成H0，且與Fe反應(yīng)后產(chǎn)生羥自由基，可作用于細(xì)胞膜，最紅導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)化、蛋白及DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

在黎民等學(xué)者對(duì)6-羥基多巴胺大鼠模型不同部位注射建立的效果分析中，其分別對(duì)4組SD鼠在中腦黑質(zhì)致密部單點(diǎn)坐標(biāo)[A/P(-5.0 mm)、L/R(-1.7 mm)、O/V(-7.6 mm)]、中腦黑質(zhì)致密部[A/P()-5.0 mm、L/R(-1.7 mm)、O/V(-7.6 mm)]、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)[A/P(-4.6 mm)、L/R(-0.9 mm)、O/V(-7.3 mm)]、紋狀體單點(diǎn)雙注[A/P(-1.0 mm)、L/R(-2.7 mm)、O/V(-5.2 mm)、O/V(-6.0 mm)]、中腦黑質(zhì)致密部單點(diǎn)坐標(biāo)[A/P(-5.0 mm)、L/R(-1.7 mm)、O/V(-7.6 mm)]，將6-羥基多巴胺按照分組方案注入大鼠腦內(nèi)。分別于造模不同時(shí)點(diǎn)(l、2、4、8 W)腹腔注射誘導(dǎo)劑APO，誘發(fā)大鼠向側(cè)旋轉(zhuǎn)，并觀察注射30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)周數(shù)。其結(jié)果顯示，通過(guò)位于中腦黑質(zhì)致密區(qū)進(jìn)行單點(diǎn)注射6-羥基多巴胺，建立的PD大鼠模型成功率高，模型穩(wěn)定，死亡率低。該研究?jī)?yōu)點(diǎn)在于操作步驟少，成功率及模型穩(wěn)定性均較高，且降低動(dòng)物死亡率，為相對(duì)理想PD大鼠模型建立方式。

1.2 MPTP模型

MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶）于20世紀(jì)80年代被人們發(fā)現(xiàn)，因其具有特異性的神經(jīng)毒性作用，能導(dǎo)致人類及多種動(dòng)物出現(xiàn)PD癥狀，常被PD相關(guān)研究學(xué)者用于制備帕金森（PD）病動(dòng)物模型。

在林臻等學(xué)者的小鼠帕金森模型制備、評(píng)估中，其對(duì)4組小鼠，分別給予30 mg/kg、25 mg/kg、35 mg/kg MPTP及30 mg/kg生理鹽水，通過(guò)行為學(xué)評(píng)分測(cè)試，分析不同劑量MPTP間的區(qū)別，觀察神經(jīng)纖維及黑質(zhì)、紋狀體區(qū)域神經(jīng)元變化情況。結(jié)果顯示，給藥三組小鼠與對(duì)照小鼠差異顯著，提示低劑量藥物可引起帕金森病動(dòng)物模型的行為改變，且低劑量與中、高劑量小鼠亦存在顯著差異。中、高劑量組之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明藥物的劑量有一定的閾值。該研究結(jié)果可以為MPTP誘導(dǎo)下C57BL/6小鼠帕金森模型制備及科研提供可靠數(shù)據(jù)支持。

2 帕金森病動(dòng)物生物毒素模型

2.1 百草枯模型

百草枯在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用范圍極廣。其結(jié)構(gòu)類似于帕金森病MPTP及活性代謝產(chǎn)物（MPP+），神經(jīng)毒性作用也類似于MPTP。目前，百草枯誤服是帕金森發(fā)病的危險(xiǎn)因素。目前百草枯動(dòng)物模型制備，多以腹腔、腦內(nèi)注射、皮下方式對(duì)大鼠、小鼠注射百草枯，對(duì)于口服百草枯建立帕金森動(dòng)物模型的研究較少。

對(duì)此，羅烘權(quán)學(xué)者對(duì)口服百草枯建立帕金森動(dòng)物模型進(jìn)行了研究。其通過(guò)對(duì)4組大鼠每天分組將不同濃度的百草枯連續(xù)灌胃4個(gè)月，通過(guò)體重監(jiān)測(cè)、行為學(xué)觀察與HPLC-FD法檢測(cè)多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量。結(jié)果顯示，4個(gè)月后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、日常活動(dòng)均下降，且中腦黑質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)細(xì)胞、大鼠紋狀體中DA及其代謝物HVA也呈下降趨勢(shì)。肺泡腔多淤血，且肺泡上皮出現(xiàn)壞死、脫落等。肝、腎作為其主要代謝器官，但研究結(jié)果顯示，本方法并未對(duì)動(dòng)物肝腎功能造成損傷，證實(shí)口服建立百草枯PD模型的可行性。但其缺點(diǎn)在于副作用較大，大鼠模型死亡率較高。

2.2 魚藤酮模型

魚藤酮這一神經(jīng)毒素最早應(yīng)用于殺蟲劑中，其選擇性與線粒體復(fù)合體I、細(xì)胞微管血腦屏障發(fā)生作用，在脂質(zhì)過(guò)氧化作用下，產(chǎn)生的自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PC12表現(xiàn)出神經(jīng)分泌細(xì)胞、神經(jīng)元雙重特性，其在酶、細(xì)胞表面受體、合成神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)，類似于中腦多巴胺能神經(jīng)元。

在李夢(mèng)楠等學(xué)者在姜黃素是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-1/AKT/FoxO3a的表達(dá)，而對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型產(chǎn)生直接作用并達(dá)到目的進(jìn)行了研究，該研究中，使用姜黃素對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)pc12細(xì)胞帕金森病模型干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組為空白對(duì)照組、魚藤酮模型組(0.1 μmol/L)、姜黃素干預(yù)組(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L)。而后，分別采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，AO/EB法分析細(xì)胞凋亡情況，雙重染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并檢測(cè)各組的IGF-1/AKT/FoxO3a蛋白表達(dá)情況。其結(jié)果證明了，姜黃素濃度介于0.5 ～1.0 μmol/L時(shí)，可達(dá)到拮抗魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并產(chǎn)生保護(hù)，其細(xì)胞活力更高、凋亡率也更低。因此，姜黃素濃度適宜，可對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞損傷PD模型進(jìn)行保護(hù)，且保護(hù)作用對(duì)濃度有一定的要求，其保護(hù)作用的原理可能與激活I(lǐng)GF-1/AKT/FoxO3a通路有關(guān)。然而，姜黃素是否能通過(guò)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用仍需各位學(xué)者在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究。

2.3 LPS誘導(dǎo)動(dòng)物模型

環(huán)境因素是PD重要誘發(fā)因素，其原理可能是通過(guò)口腔或鼻腔接觸的環(huán)境毒素。自然界中脂多糖（Lps）且存在范圍廣的一種內(nèi)毒素?？諝夥蹓m和空氣污染源中的細(xì)顆粒物中都含有這種物質(zhì)。因此，人類經(jīng)常暴露在脂多糖中，可以直接通過(guò)鼻子進(jìn)入大腦。Lps對(duì)神經(jīng)元不產(chǎn)生直接毒性作用，但經(jīng)Lps誘導(dǎo)后，患者炎癥反應(yīng)被激活，大量釋放ROS、RNS等神經(jīng)毒性因子及TNF-α、IL-6等炎性因子，破壞黑質(zhì)紋狀體通路,出現(xiàn)PD癥狀。

在宋國(guó)斌等學(xué)者的研究中，以多次小劑量滴鼻方式給予LPS，對(duì)C57BL/6小鼠誘導(dǎo)PD動(dòng)物模型產(chǎn)生作用，持續(xù)7周后，行為學(xué)結(jié)果顯示：LPS模型組小鼠運(yùn)動(dòng)功能顯著低于對(duì)照組；病理學(xué)結(jié)果顯示，LPS模型組出現(xiàn)黑質(zhì)多巴胺能便神經(jīng)元及神經(jīng)遞質(zhì)含量減少、TH表達(dá)降低，α-突觸核蛋白表達(dá)增加等情況（P＜0.05），成功建立病理學(xué)、行為學(xué)均符合的PD小鼠模型。該研究的特點(diǎn)是建模時(shí)間僅為5個(gè)月，可以更便捷地研究帕金森病的神經(jīng)遞質(zhì)變化、病理變化、發(fā)病機(jī)制、治療方法和療效。

3 帕金森病動(dòng)物基因模型

3.1 α-突觸核蛋白動(dòng)物模型

PD的主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的變性丟失及路易小體（Lewy bodies，LBs）形成。而α-突觸核蛋白（α-syn）是LBs的主要組成成分，且α-syn的基因點(diǎn)突變（A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E 和 A53T）與家族性 PD 的發(fā)病密切相關(guān)，α-syn 參與了 PD 的發(fā)病。

在宋娜等學(xué)者的研究中，對(duì)人α-syn A30P突變大鼠PD模型展開研究。利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)野生型α-SYN載體pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A -GFP及αSYN A30P突變載體pLKO-CMV-α-SYN-A30P-P2A-GFP，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)α-SYN水平，經(jīng)慢病毒包裝、濃縮，使用立體定位技術(shù)對(duì)大鼠中腦黑質(zhì)致密部注射病毒稀釋液，過(guò)表達(dá)α-SYN野生型、A30P突變型慢病毒顆粒，檢測(cè)α-SYN和酪氨酸羥化酶（TH）的分布，分析中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量變化。結(jié)果證實(shí)典型路易小體未形成，但野生型、突變體兩組轉(zhuǎn)基因大鼠的中腦黑質(zhì)致密部神經(jīng)元出現(xiàn)了丟失情況。該研究中的轉(zhuǎn)基因大鼠模型可表現(xiàn)PD典型病理特征，為PD病情進(jìn)展、靶點(diǎn)藥物開發(fā)及治療提供研究基礎(chǔ)。

3.2 基因敲除模型

在郭祥玉等學(xué)者對(duì)基因敲除模型的研究中，發(fā)明了一種腦黑質(zhì)基因敲除快速建立帕金森病動(dòng)物模型的方法。其原理是通過(guò)sgRNA達(dá)到敲除PINK1基因的目的，通過(guò)向動(dòng)物大腦黑質(zhì)部注射sgRNA、CRISPR核酸酶，形成PINK1基因片段缺失，最終達(dá)到靶向敲除中腦黑質(zhì)PINK1基因，建立PD動(dòng)物模型的目的。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除3～4周后，可產(chǎn)生PD典型運(yùn)動(dòng)障礙，且需進(jìn)行藥物治療，運(yùn)動(dòng)障礙方可恢復(fù)。該制備方法直接造成黑質(zhì)部位神經(jīng)元死亡，無(wú)副作用，制備成功率＞90%，適用性和重復(fù)性好。為PD相關(guān)研究提供重要模型，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與臨床研究意義。

4 討論

綜上所述，本文具體展示了各類不同方式的 PD 動(dòng)物模型建立方式并進(jìn)行了探討，羅列了其研究的造模劑的使用、造模時(shí)間以及評(píng)判指標(biāo)等。而這些新模型在實(shí)際應(yīng)用中是否存在爭(zhēng)議或未完善之處，仍需要國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。