一株H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定與進化分析

李亮

（廣東省廣州市黃埔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州 510530）

豬流行性感冒（Swine influenza）簡稱豬流感，是一種豬急性高度接觸性傳染病，病原為正黏病毒科甲型流感病毒屬的豬流感病毒（Swine influenza virus,SIV）[1,2]。豬流感病毒主要通過呼吸道進行傳播，病豬主要表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏、流鼻涕等癥狀，發(fā)病較急，發(fā)病率最高可達100%，傳播速度較快并且與人流感密切相關(guān)，因此，豬流感對養(yǎng)豬業(yè)和公共衛(wèi)生安全可造成嚴重威脅。

當前，豬群中主要流行的SIV分為H1N1、H3N2和H1N2，3種亞型，其中H1N1亞型SIV主要包括古典和禽源H1N1亞型SIV[2]。流感病毒具有極強的宿主識別特異性，通常流感病毒不會跨越種間屏障感染其他類型的宿主，但豬的呼吸道上皮細胞具有特殊的包容性，其同時擁有唾液酸α2,6和α2,3兩種受體，基于此，豬被認為是禽、人流感跨種間傳播的中間宿主，同時可作為不同流感病毒重組的混合器[3]。本研究通過分離到的人源豬流感病毒的遺傳演化、抗原性分析，為闡明豬在流感病毒跨種傳播提供了重要的病原學佐證。

1 材料和方法

1.1 樣品采集、動物病毒分離及試驗動物

2020年從廣州某豬場采集疑似流感癥狀豬的鼻拭子30份，通過常規(guī)方法接種9日齡SPF雞胚增殖病毒。試驗所用雞胚購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒亞型的鑒定

利用RNA純化試劑盒（購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司）提取病毒RNA，并以Unin-12為引物，按照反轉(zhuǎn)錄酶AMV試劑盒（購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司）說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用特異性的亞型鑒定引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）通過PCR擴增鑒定病毒亞型。

1.3 全基因序列測定與分析

1.3.1 全序列測定

吸取收獲的病毒尿囊液200 μL，提取基因組并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，利用SIV H1N1亞型各節(jié)段特異性引物進行PCR（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）擴增病毒各個基因區(qū)段，膠回收PCR產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.3.2 病毒分子特征與遺傳演化分析

利用Lasergene軟件中的Seqman程序包組裝各基因片段序列，通過NCBI的blast窗口進行同源性檢索，用MEGA7.0繪制進化分析樹，通過對HA和NA基因片段對應的氨基酸序列分析，獲得該流感病毒的分子特征。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離鑒定

通過特異的PCR鑒定分離到的病原，確認該病原為H1N1亞型流感病毒，對該病毒全基因組測序并進行生物學特性分析后，命名其為A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1） （簡稱 SW/Neim/03/20）。

2.2 核苷酸同源性

通過NCBI的Blast窗口對SW/Neim/03/20病毒的8個基因片段進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，除M基因、NS基因與人源SI病毒A/Swine/Fujian/0325/2008（H1N1）同源性最高，其余6個基因均與人流感病毒A/Dunedin/2/2000（H1N1）同源性最高，各基因同源性比對數(shù)據(jù)見下表（表1）。

表1 A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1）相關(guān)基因核苷酸同源性分析

2.3 病毒序列分子特征分析

全基因測序顯示，SIV SW/Neim/03/20（H1N1）的HA基因組開放閱讀框有1 698個核苷酸，編碼565個氨基酸，NA基因開放閱讀框有1 413個核苷酸組成，編碼470個氨基酸。通過HA蛋白分子的特殊構(gòu)象推測，前17個氨基酸為信號肽，整個HA蛋白分為326個氨基酸的HA1和222個氨基酸的HA2兩個亞單位組成，HA1和HA2由一個堿性氨基酸R連接，HA蛋白的裂解位點氨基酸基序為PSIQSR↓G，該基序不含多個堿性氨基酸，表明該分離的病毒與低致病性毒株氨基酸序列特征一致。

通過分析SW/Neim/03/20抗原表位特性發(fā)現(xiàn)，該毒株與經(jīng)典型和類禽型H1N1 SIV比較，在HA1上的4個抗原表位（Sa、Cb、Sb、Ca）易變，每個表位均有多個氨基酸的變異（見表2），HA2部分的表位較為保守。HA氨基酸鏈上分布有10個潛在的糖基化位點，其中HA1 區(qū)分布在 27、28、40、71、104、142、176 和303等氨基酸位點，HA2區(qū)分布在氨基酸的497和556位點。SW/Neim/03/20毒株4個抗原表位（Sa、Cb、Sb、Ca）和潛在的 10個糖基化位點均和參考株A/Dunedin/2/2000（H1N1）所具有的狀態(tài)一致。SW/Neim/03/20毒株與SIV參考株中均具有NA蛋白完整的7個糖基化位點。其中，鏈接區(qū)有4個(N44、N58、N63和N68)，結(jié)構(gòu)域有3個(N88、N146和N235)。

表2 分離株A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1）和參考毒株HA1蛋白氨基酸序列比較

2.4 病毒HA和NA基因核苷酸系統(tǒng)進化分析

通過對分離毒株HA和NA基因進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建與分析發(fā)現(xiàn)，分析的H1N1亞型豬流感病毒基因序列分為3個亞群，包括經(jīng)典的H1N1，類禽的H1N1和季節(jié)性的H1N1人流感病毒。SW/Neim/03/20（H1N1）8個基因均與人流感亞群高度同源，該病毒沒有發(fā)生重組，并與2000年左右的人流感毒株A/Dunedin/2/2000（H1N1）進化關(guān)系最近（圖1、圖2）。

圖1 分離株和參考毒株HA基因進化樹

圖2 分離株和參考毒株NA基因進化樹

3 討論

豬的呼吸道上皮細胞具有特殊的包容性，其同時擁有唾液酸α2,6和α2,3兩種受體，基于此，豬被認為是禽、人流感跨種間傳播的中間宿主，同時，豬可作為不同流感病毒重組的混合器[4]。1998年，一株禽和人流感病毒的重組病毒曾在美國豬群中流行并引發(fā)大范圍流感；2009年3月的甲型H1N1流感病毒由墨西哥迅速傳到全球各地，對經(jīng)濟和公共衛(wèi)生造成嚴重損失，該病原同為重組SIV，其基因由禽源、人源及豬源流感病毒基因三重重配組成[5]。在我國近年相繼報道了多起人和豬流感重配病毒感染事件，這種重配的病毒與多基因型SIV在豬群中共流行，共流行提供了更多的病毒重組可能性[6]。人群和豬群通常缺少針對重配病毒相應的抗體，重組病毒往往會對其造成巨大損害。

在自然條件下，豬同時擁有唾液酸α2,6和α2,3兩種受體，因此，豬可以感染人流感病毒。人源流感病毒抗體在豬群內(nèi)處于缺失狀態(tài)，這將導致人流感病毒更容易在豬群中流行，人源H3N2病毒多次感染豬群的情況，也證明了該觀點[5,7]。相對于H3N2病毒，人源H1N1在豬群中分離率較低，且缺乏持續(xù)進化證據(jù)可能是H1蛋白相對保守導致的[8]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，SW/Neim/03/20（H1N1）的HA基因與A/Dunedin/2/2000具有99.51%的同源性，而 A/Dunedin/2/2000是2000到2007年期間北半球人流感中的代表病毒毒株。分離株與A/Swine/Fujian/0325/2008（H1N1） 以及參考株 A/Dunedin/2/2000的抗原位點完全一致，該相關(guān)性說明分離株SW/Neim/03/20（H1N1）通過人—豬傳播直接來自于人流感病毒，而非豬群進化而來。當前我國豬群遭遇各種重大疾病，與這些高致死、致殘性疾病相比，豬流感對養(yǎng)豬業(yè)的危害容易被輕視甚至忽略。在疫病診治過程中，豬流感常做為原發(fā)病誘發(fā)其他疫病對養(yǎng)殖業(yè)造成損害，而人源病毒在散發(fā)性的感染豬群，對豬致病性具有大流行的潛在危害，其與豬群中的其他病毒存在繼續(xù)發(fā)生重組的可能，再回傳到人群中，對公共衛(wèi)生事業(yè)具有一定的潛在危害，需要持續(xù)監(jiān)測與關(guān)注，防患未然。